擬康寧木霉T-51菌株對番茄枯萎病的生物防治及其機理研究

王前程，張迎迎，戴陶宇，尤佳琪，郭世榮，朱為民*

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，南京 210014；2 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，上海市設(shè)施園藝重點實驗室，上海 201403)

番茄枯萎病是由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum) 引起的維管束疾病，是一種嚴重危害番茄品質(zhì)和產(chǎn)量的土傳性病害，鐮刀菌酸(fusaric acid, FA)被認為是番茄枯萎病發(fā)生過程中的一個重要致病因子[1]。番茄幼苗期到成株期均可受到病原菌的侵染，很難徹底根除，因此番茄枯萎病又被稱為“番茄癌癥”[2]。癥狀具體表現(xiàn)為植株生長發(fā)育不良，比健康番茄植株矮小瘦弱、葉片發(fā)黃，植株因嚴重缺水而葉片枯萎，最終整株植物枯萎死亡[3]。番茄枯萎病常在開花期發(fā)病，在盛果期出現(xiàn)植株死亡現(xiàn)象，造成果實減產(chǎn)、品質(zhì)不佳[4]。近些年來，伴隨著番茄集約化種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，露天和大棚番茄的枯萎病發(fā)生呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，嚴重制約了番茄的產(chǎn)量和質(zhì)量。

木霉菌(Trichodermaspp.)是自然界廣泛分布的真菌，被普遍應(yīng)用于作物土傳病害的生物防治[5]。真菌寄生和誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)抗性被認為是木霉生物防治的重要機制[6]。研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸/乙烯信號通路在木霉菌誘導(dǎo)植物抗性中普遍發(fā)揮作用[7-8]。也有研究表明，木霉可以通過調(diào)控植物激素茉莉酸和水楊酸兩個不同的信號通路，進而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育和激活植物的防御系統(tǒng)[9]。

T-51是一株具有生防潛力的擬康寧木霉(Trichodermakoningiopsis)。研究表明T-51菌株顯著促進西瓜種子萌發(fā)和番茄幼苗生長，并且可以增強番茄對灰霉病的抗病性[10-11]。但T-51菌株對番茄枯萎病的防治工作目前還沒有相關(guān)報道。本試驗采用不同的處理方式和檢測手段，對T-51菌株與田間分離獲得的尖孢鐮刀菌展開體外和體內(nèi)試驗，從而明確T-51菌株對番茄枯萎病的防治效果。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試番茄品種為感枯萎病的櫻桃番茄材料‘SHy9’。種子采用常規(guī)消毒處理，催芽后播種于育苗盆中，生長3周后供接菌試驗。供試病原真菌為尖孢鐮刀菌，由本實驗室從番茄枯萎病病株上分離獲得。供試生防木霉菌是擬康寧木霉T-51，分離自湖北省武漢市油菜田土壤[11]，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院尤佳琪老師篩選獲得，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，編號M2015729。

1.2 平板對峙試驗

將活化好的T-51菌株和尖孢鐮刀菌同時轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基(馬鈴薯 200 g；葡萄糖 20 g； 瓊脂15 g)平板上，2塊菌餅(5 mm×5 mm)對稱分布，相距約7 cm，以單獨轉(zhuǎn)接尖孢鐮刀菌的平板為對照組，每種處理重復(fù)3次，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測量兩種菌的生長直徑。以T-51對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制率評價競爭作用。抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

另外，將活化好的尖孢鐮刀菌轉(zhuǎn)接到PDA平板上培養(yǎng)3 d后，再轉(zhuǎn)接T-51菌株，取對峙培養(yǎng)2周后尖孢鐮刀菌生長區(qū)域的菌餅進行二次轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)5 d后觀察生長狀態(tài)并鑒定。

1.3 T-51菌株抑制尖孢鐮刀菌最適溫度和pH值篩選試驗

將對峙培養(yǎng)的平板放置在不同的溫度環(huán)境(15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃)中培養(yǎng)，每一種處理3次重復(fù)；調(diào)整用于對峙培養(yǎng)的平板中PDA培養(yǎng)基的pH值(3、5、7、9和11)，并在室溫條件(25 ℃)下進行平板對峙試驗，每一處理3個重復(fù)；均培養(yǎng)7 d后按照1.2的測量方法進行記錄分析。

1.4 T-51菌株防治番茄苗期枯萎病盆栽試驗

首先，進行T-51菌株和尖孢鐮刀菌孢子洗脫液的制備。將T-51轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基上，22 ℃光照培養(yǎng)3 d，用含有0.05% Tween-20的滅菌水刮洗平板得到洗脫液，過濾菌絲獲得孢子液，濃度調(diào)整為1×107個/mL，即得到T-51孢子洗脫液。尖孢鐮刀菌孢子液制備時平板培養(yǎng)條件為25 ℃黑暗培養(yǎng)，其余步驟同上。T-51和尖孢鐮刀菌混合孢子液制備步驟同上，二者終濃度均為1×107個/mL。

其次，對長勢健壯的3周齡番茄幼苗洗根，隨后把根部分別放入清水和制備好的3種孢子液中浸泡15 min，然后重新栽種到盆中，置于溫度25 ℃、相對空氣濕度55%～65%下生長，每種處理24株番茄幼苗[12]。3周后調(diào)查番茄發(fā)病情況，番茄枯萎病參照張素平的分級標(biāo)準[13]，病情指數(shù)參照宗兆鋒和康振生[14]的計算方法。根據(jù)發(fā)病等級計算病情指數(shù)和發(fā)病率，并在各處理番茄幼苗葉片取樣，進行相關(guān)指標(biāo)測定。

病情指數(shù)(%)=∑(各級病株數(shù)×相應(yīng)病級)/(總株數(shù)×最高病級)×100%。

發(fā)病率(%)=該處理發(fā)病植株數(shù)/該處理植株總數(shù)×100%。

1.5 防治試驗中葉片相關(guān)指標(biāo)觀測

1.5.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)利用調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)(德國 WALZ,IMAG-MAX/L)測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，測量前將番茄幼苗葉片暗適應(yīng)15 min，隨后對光合系統(tǒng) Ⅱ(PSⅡ)最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(non-photochemical quenching, NPQ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和表觀光合電子傳遞速率(apparent photosynthetic electron transport rate, ETR)進行測定，每一處理分別選取6株番茄相同部位的葉片，每一葉片避開葉脈隨機選取3個測定點。

1.5.2 抗病性相關(guān)物質(zhì)和酶活性對防治試驗各處理的番茄幼苗葉片取樣，進行過氧化氫(H2O2)含量、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測，每種檢測重復(fù)3次，檢測方法均按照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒說明書操作步驟進行測定。

1.5.3 水楊酸和茉莉酸含量及相關(guān)基因表達量對防治試驗各處理的番茄幼苗葉片取樣，定量測定植物內(nèi)源激素水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)含量，每種測定重復(fù)3次，本試驗由南京瑞源公司采用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/ MS)方法測定分析。

同時，對上述材料提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，進行qRT-PCR表達量分析，每個反應(yīng)3個重復(fù)，相對表達量的計算方法采用2-ΔΔCT法，將目標(biāo)基因的表達量與內(nèi)參基因[15]的信號進行歸一化。利用引物設(shè)計軟件Primer5對SA與JA合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因設(shè)計引物，引物設(shè)計如表1所示。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primer name and sequence

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel進行數(shù)據(jù)整理，并利用SPSS對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與顯著性分析，使用GraphPad Prism 8進行繪圖，表型觀察拍照使用佳能相機，后期用Photoshop進行圖片處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬康寧木霉T-51菌株對尖孢鐮刀菌的抑制作用

平板對峙試驗顯示，與對照相比，同一PDA平板上轉(zhuǎn)接的T-51菌株隨著時間的推移，快速占據(jù)生長所需的營養(yǎng)和空間，并且顯著限制尖孢鐮刀菌菌絲擴展(圖1, Ⅰ)。統(tǒng)計分析對峙培養(yǎng)7 d的2種菌的生長半徑，發(fā)現(xiàn)T-51菌株顯著抑制了尖孢鐮刀菌的生長直徑(圖1, Ⅱ)。培養(yǎng)后期木霉菌可在尖孢鐮刀菌的菌落上生長，并逐漸覆蓋其生長的周邊區(qū)域；從共培養(yǎng)平板中尖孢鐮刀菌菌絲生長區(qū)域取下一塊菌餅轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3 d，觀察鑒定培養(yǎng)皿中生長的是T-51菌株(圖1, Ⅲ)。說明與T-51平板對峙后的尖孢鐮刀菌已沒有生長活性，T-51對尖孢鐮刀菌有顯著抑制作用。

2.2 擬康寧木霉T-51菌株抑制尖孢鐮刀菌的最適溫度和pH值

為探究擬康寧木霉T-51菌株有效抑制尖孢鐮刀菌的最適溫度和pH，進行了不同溫度和pH下的平板對峙試驗(圖2)。其中，不同溫度環(huán)境下T-51菌株和尖孢鐮刀菌的對峙培養(yǎng)結(jié)果(圖2, Ⅰ)顯示，隨著溫度的升高，各時期T-51菌株對尖孢鐮刀菌的抑制率均呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，并均在環(huán)境溫度為20 ℃時達到最高，且與同期其他溫度處理存在顯著差異；隨著處理時間的增加，各溫度處理的尖孢鐮刀菌的抑制率均逐漸增加，在處理第7天時分別達到38.65%、63.56%、57.26%、43.13%和15.17%。這可能與擬康寧木霉T-51菌株和尖孢鐮刀菌各自生長的最適溫度有關(guān)。綜合分析認為，T-51菌株在20 ℃～25 ℃范圍內(nèi)對尖孢鐮刀菌有較顯著的抑制效果。

另外，T-51菌株和尖孢鐮刀菌在不同pH培養(yǎng)基上對峙試驗結(jié)果(圖2, Ⅱ)表明，在培養(yǎng)基不同酸堿度環(huán)境下，T-51菌株對尖孢鐮刀菌抑制率變化趨勢與溫度處理相似，但變化幅度不如溫度處理間大；其中，T-51菌株對尖孢鐮刀菌在pH為5-11范圍內(nèi)均有抑制效果，在處理7 d時抑制率分別是46.45%、63.53%、56.85%和54.06%，且處理間差異均達到顯著水平。這說明T-51菌株在不同酸堿環(huán)境下均有較好的抑菌效果，并以pH為7時抑菌率顯著較高。

2.3 擬康寧木霉T-51菌株對番茄苗期枯萎病的防治效果

不同處理的番茄幼苗生長3周后出現(xiàn)明顯的表型差異，尖孢鐮刀菌孢子液處理的番茄幼苗莖基部皺縮，葉片由上至下逐漸發(fā)黃枯萎；經(jīng)混合孢子液處理的番茄植株無明顯的感病癥狀，植株生長狀態(tài)與對照組的番茄幼苗無顯著差異；浸泡T-51孢子液的番茄植株長勢健壯，葉色深綠、莖部粗壯、株高較高(圖3, Ⅰ)。

進一步統(tǒng)計分析各處理番茄幼苗的發(fā)病情況(圖3, Ⅱ、Ⅲ)發(fā)現(xiàn)，清水處理組和T-51處理組的番茄植株發(fā)病率均是0；單獨接種尖孢鐮刀菌的番茄幼苗發(fā)病情況嚴重，發(fā)病率達83.33%，病情指數(shù)高達81.25%； T-51菌株與尖孢鐮刀菌混合孢子液處理組病情指數(shù)降至13.54%，發(fā)病率降低為12.5%，與單獨接種病原菌組差異顯著，相對防效是87.5%。以上結(jié)果表明T-51能夠有效抑制尖孢鐮刀菌，降低番茄枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)，提高植株抗病性。

2.4 擬康寧木霉T-51菌株對番茄苗期生理生化指標(biāo)的影響

首先，葉綠素?zé)晒獗硇头治鼋Y(jié)果顯示，尖孢鐮刀菌處理組番茄葉片明顯感病，混合孢子液處理組番茄葉片弱感病，對照組和T-51孢子液處理組的番茄葉片無明顯感病狀態(tài)(圖4, Ⅰ)。同時，單施尖孢鐮刀菌、施加混合孢子液、清水處理和單施T-51處理的番茄葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、表觀光合電子傳遞速率(ETR)和光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)呈現(xiàn)依次遞增趨勢，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)呈現(xiàn)依次遞減趨勢；施加混合孢子液處理組番茄葉片的Fv/Fm、ETR和qP與尖孢鐮刀菌處理組相比分別顯著提高了22.41%、27.19%和39.21%，而其NPQ卻顯著降低了34.54%，幾乎恢復(fù)到對照組水平(圖4, Ⅱ-Ⅴ)。結(jié)果表明，T-51菌株能夠有效抑制尖孢鐮刀菌的侵染，保護番茄光合系統(tǒng)免受破壞，顯著提高幼苗的抗病性和光合能力。

其次，由圖5可知，單施尖孢鐮刀菌孢子液的番茄葉片中H2O2含量顯著高于其他3種處理，施加混合孢子液處理組H2O2含量稍低于對照，單施T-51孢子液處理葉片中H2O2含量最低并顯著低于對照；與清水對照相比，單施尖孢鐮刀菌孢子液的番茄葉片中CAT和SOD活性顯著降低，而其POD活性顯著增加，施加混合孢子液和單施T-51孢子液處理的CAT、POD活性顯著增加，而SOD活性無顯著變化；與單施尖孢鐮刀菌孢子液處理組相比，施加混合孢子液和單施T-51孢子液的番茄葉片的CAT、POD和SOD活性均顯著升高，其中混合孢子液處理組酶活分別是尖孢鐮刀菌處理組的2.58倍、1.64倍和1.16倍。可見，T-51能夠顯著提高番茄植株體內(nèi)的抗氧化物酶的活性，清除過量活性氧，提高植株抗枯萎病能力。

2.5 擬康寧木霉T-51菌株對番茄植株內(nèi)水楊酸和茉莉酸含量及相關(guān)基因表達的影響

如圖6顯示，與對照相比，尖孢鐮刀菌處理組番茄幼苗葉片中水楊酸(SA)含量顯著大幅升高，而茉莉酸(JA)含量卻顯著降低，混合孢子液和單施T-51孢子液處理組番茄葉片中的SA和JA含量均有顯著升高；與單施尖孢鐮刀菌孢子液處理相比，混合孢子液處理和單施T-51孢子液處理番茄葉片中SA含量顯著降低，而其JA含量顯著升高(圖6,Ⅰ、Ⅱ)。

以上結(jié)果表明，T-51菌株能有效觸發(fā)番茄幼苗體內(nèi)防御系統(tǒng)，引起激素含量顯著變化，從而提高番茄幼苗的抗病性。

同時，SA信號通路和JA合成的關(guān)鍵基因表達分析結(jié)果顯示，與對照相比，單獨尖孢鐮刀菌孢子液、混合孢子液、單獨T-51孢子液處理的番茄幼苗SA信號通路上的PR1和TGA2基因表達量都顯著上調(diào)，并均以單施尖孢鐮刀菌的番茄幼苗上調(diào)幅度最大，顯著高于其余兩處理(圖7, Ⅰ、Ⅱ)。同時，單施尖孢鐮刀菌孢子液番茄幼苗JA合成基因LoxD的表達量相比于對照組顯著下調(diào)，而混合孢子液處理組和單獨T-51菌株處理組中該基因表達量均顯著上調(diào)(圖7, Ⅲ)。即番茄幼苗中SA信號通路和JA合成關(guān)鍵基因的表達與其激素含量變化趨勢結(jié)果一致。由此可見，擬康寧木霉T-51可以調(diào)節(jié)番茄植株內(nèi)水楊酸和茉莉酸相關(guān)基因表達，調(diào)控內(nèi)源激素含量變化，以抵抗尖孢鐮刀菌病原菌的侵染。

3 討 論

木霉菌生防作用機制是多方面的，其對致病菌的重寄生作用是防治病原菌的主要機制之一[16]；另外木霉菌與植物互作改變了植物基因表達水平，使植物獲得了對病害和逆境的抗性[5,17]；同時，木霉與植物共生時產(chǎn)生的次生代謝物不僅能誘導(dǎo)植物抗性，還參與對植物碳水化合物代謝和植物生長發(fā)育的調(diào)控[18-21]；木霉還可以改變植物體內(nèi)源激素SA和JA的含量從而應(yīng)答病原菌的入侵[22]，誘導(dǎo)番茄體內(nèi)抗病基因表達，激活番茄誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(Induced Systemic Resistance, ISR)，從而對番茄枯萎病產(chǎn)生防御能力[23]。目前，利用木霉防治作物枯萎病的研究已有較多報道，主要集中在哈茨木霉、棘孢木霉[24]和綠色木霉[25]等木霉，但有關(guān)擬康寧木霉生防枯萎病的報道還相對較少。本研究利用擬康寧木霉T-51菌株防治番茄枯萎病，其生防效果顯著，并在生理、激素和基因水平均有所體現(xiàn)。

本研究通過平板對峙試驗和苗期接種試驗，發(fā)現(xiàn)擬康寧木霉T-51菌株對引起枯萎病的尖孢鐮刀菌生長有顯著的抑制效果，并且在環(huán)境溫度20 ℃、pH為7～9時對致病菌的抑制效果顯著，說明T-51對酸堿環(huán)境適應(yīng)能力強，并且更適用于中低溫環(huán)境，這一特點更有利于T-51應(yīng)用于實際栽培生產(chǎn)中番茄枯萎病病害防治。

首先，葉綠素?zé)晒夂糠从沉酥参锕夂献饔玫膹娙鮗26]，宋明霞等[27]研究表明綠色木霉與枯草芽孢桿菌混合菌液能夠激活番茄光合系統(tǒng)活性，提高光合效率。本試驗中，擬康寧木霉T-51菌株通過顯著提高番茄幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、ETR和qP的同時顯著降低NPQ，有效減緩尖孢鐮刀菌對番茄葉片中PSⅡ的破壞，從而提高植株葉片的光合能力，保障植株正常進行光化學(xué)能量轉(zhuǎn)化。

同時，植物抗氧化酶如 SOD、POD、CAT 等活性與植物抗病性是正相關(guān)關(guān)系，而H2O2含量與植物抗病性呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系。木霉菌能夠誘導(dǎo)植物抗病相關(guān)防御酶活性發(fā)生變化，增強植物體的抗病防御能力[28]?；钚匝鹾亢涂寡趸锩富钚允欠从持参锸苊{迫和抗逆能力的重要指標(biāo)。本研究中T-51菌株處理可以顯著提高番茄植株體內(nèi)防御性酶CAT、POD和SOD活性，降低H2O2含量。H2O2含量越高，氧化脅迫程度越高，對植物體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和細胞器的損傷越大；而POD、SOD、CAT等抗氧化物酶的活性越高，則對活性氧的清除能力越強，抗逆能力越強。以上結(jié)果說明T-51菌株通過提高防御性酶活性以抵抗病原菌侵染植株帶來的生物逆境脅迫，從而增強番茄植物抗病性。

另外，木霉菌株誘導(dǎo)番茄體內(nèi)抗病相關(guān)基因表達，激活番茄系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性，從而對番茄枯萎病產(chǎn)生防御能力[17]。茉莉酸與水楊酸在植物抗病中處于不同的信號通路，SA途徑激發(fā)植物的系統(tǒng)獲得性抗病(systemic acquired resistanc, SAR)通路，而JA/ET信號通路激發(fā)的是植物誘導(dǎo)性抗病信號通路[22,29]。研究發(fā)現(xiàn)木霉可以激活植株體內(nèi)茉莉酸通路提高植物的抗病性[30]，哈茨木霉突變體Thc6對玉米葉斑病菌的抗病性研究，發(fā)現(xiàn)木霉通過誘導(dǎo)植物茉莉酸依賴性途徑增強植物的抗病性[8]。本試驗通過測定與植物抗病性相關(guān)的兩個內(nèi)源植物激素SA和JA含量發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單獨用尖孢鐮刀菌孢子液處理番茄材料時，其葉片中的SA含量顯著上調(diào)，JA含量顯著下調(diào)，而混合孢子液和單施T-51菌株處理的番茄葉片中SA、JA含量與對照相比均上調(diào)，但JA上調(diào)幅度較大。推測尖孢鐮刀菌侵染植株的過程中激活了番茄幼苗SAR信號通路，植株進行自我保護；但SAR途徑不是木霉防治枯萎病的主要信號通路，擬康寧木霉T-51菌株主要是通過誘導(dǎo)番茄幼苗調(diào)控JA合成，激活植株ISR防御信號通路，從而防治番茄枯萎病。SA和JA相關(guān)基因表達水平的變化也證明了這一點。

綜上所述，本研究利用生理生化和分子生物學(xué)等手段，明確了擬康寧木霉T-51菌株對尖孢鐮刀菌引起的番茄枯萎病防治上具有顯著的生防效果，該菌株是對番茄枯萎病具有生防潛力的菌株，該工作為研發(fā)番茄枯萎病生物防治制劑提供了優(yōu)良菌株和可靠的理論依據(jù)。