從無到有：構(gòu)建精子發(fā)生障礙診療體系)

歐寧靜 姚晨成 李 錚

針對精子發(fā)生障礙，依靠多學(xué)科研究團(tuán)隊，指導(dǎo)規(guī)范化樣本收集，深入開展轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究，建立體內(nèi)體外干細(xì)胞分化的研究模型。以此為基礎(chǔ)，制訂精子發(fā)生障礙診療新路徑，解析精子發(fā)生障礙表觀遺傳診療新靶點，建立人精原干細(xì)胞向單倍體精子細(xì)胞定向分化新體系，提出睪丸顯微手術(shù)取精“三步法”，建立稀少或單精子凍存新方法。本研究團(tuán)隊的主要創(chuàng)新成果如下。

1 提出生精障礙診療新路徑，制訂男性不育診療指南與共識

男性不育的病因復(fù)雜，國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的診療流程，治療效果參差不齊。在深入研究男性生殖系統(tǒng)病理生理學(xué)基礎(chǔ)，總結(jié)男性不育臨床診療經(jīng)驗后，李錚教授提出了無精子癥“三分法”診療路徑(圖1)，并編寫《無精子癥規(guī)范化診療專家共識》[1]。同時，在男性生殖系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ)研究方面，本研究團(tuán)隊編寫了高等教育教材《生殖系統(tǒng)》、全國高等學(xué)校醫(yī)學(xué)規(guī)劃教材《組織學(xué)與胚胎學(xué)》，主譯《精子細(xì)胞：生成-成熟-受精-再生》。在臨床方面，本研究團(tuán)隊總結(jié)相關(guān)文獻(xiàn)及臨床經(jīng)驗，編寫了《精索靜脈曲張診療專家共識》[2]，建議將顯微鏡下精索靜脈結(jié)扎術(shù)作為精索靜脈曲張手術(shù)治療金標(biāo)準(zhǔn)。2016年組織編寫《Y染色體微缺失專家共識》，2017年組織成立中國Y染色體篩查質(zhì)控聯(lián)盟，2018年進(jìn)行了全國第1次質(zhì)控篩查，為國內(nèi)Y染色體篩查的質(zhì)控工作提供了標(biāo)準(zhǔn)。對于梗阻性無精子癥，本研究團(tuán)隊組織編寫了《射精管梗阻與精道內(nèi)鏡技術(shù)專家共識》[3]，是該領(lǐng)域第1本診療共識，為國內(nèi)單位開展此類項目提供了規(guī)范化診療流程。

圖1 男性不育“三分法”診療路徑

2 構(gòu)建生精障礙臨床數(shù)據(jù)庫， 解析精子發(fā)生障礙表觀遺傳診療新靶點

精子發(fā)生包括精原干細(xì)胞自我更新與分化、精母細(xì)胞減數(shù)分裂、精子細(xì)胞變形3個主要階段[4]，其中任一環(huán)節(jié)異常都可導(dǎo)致精子發(fā)生障礙。由于精子發(fā)生過程中調(diào)節(jié)機制相對復(fù)雜，目前關(guān)于人生精障礙的分子機制尚未被完全闡明。對于生精障礙主要集中于以小鼠為模型的研究中，但在臨床實踐過程中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致人生精障礙的主要原因與小鼠存在差異；且人群之間亦存在異質(zhì)性，增加了生精障礙的診治難度。因此，建立5 000余例生精障礙的臨床樣本數(shù)據(jù)庫(圖2)，為揭示人精子發(fā)生障礙和男性不育分子機制提供了更好的研究平臺，也為解決實際臨床問題奠定了基礎(chǔ)。

圖2 精子健康資源庫信息化管理體系建立流程

表觀遺傳學(xué)調(diào)控在精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用，本研究團(tuán)隊基于前期建立的生精障礙臨床樣本數(shù)據(jù)庫，探索精子發(fā)生障礙的表觀遺傳調(diào)控新位點。采用梯度密度方法，優(yōu)化分選精子發(fā)生障礙患者的精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞系統(tǒng)(發(fā)明專利名稱為“一種分離人精原干細(xì)胞的方法”，授權(quán)專利號為ZL201110321189.9)，與精子發(fā)生正常者的同類細(xì)胞進(jìn)行比較；經(jīng)RNA深度測序后驗證，在精原細(xì)胞中有顯著差異的微RNA(microRNA)有396種，初級精母細(xì)胞中有395種，單倍體精子細(xì)胞中有375種，同時預(yù)測了重要microRNA調(diào)控基因靶點，并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)驗證。本研究項目基于人精子發(fā)生研究平臺，從表觀調(diào)控方面進(jìn)一步認(rèn)識了精子發(fā)生過程和無精子癥的病因?qū)W機制，為男性不育的治療提供新靶點[5]。

3 建立人精原干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化新體系，并證實其具有受精潛能

基于精子發(fā)生障礙睪丸組織庫，建立干細(xì)胞與支持細(xì)胞相互作用的研究平臺，探索精原干細(xì)胞定向分化模型。對于精子發(fā)生障礙患者的治療，從其睪丸中獲取精原干細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化獲取具有受精功能的精子，為精子發(fā)生障礙的研究建立體外分化新體系。本研究項目從隱睪患者的睪丸中獲取干細(xì)胞，經(jīng)視黃酸(RA)與干細(xì)胞因子(SCF)等條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，分選獲取精子細(xì)胞；行精子細(xì)胞卵母細(xì)胞注射，證明其具備受精能力，并能發(fā)育至囊胚階段[6]；證明人精原干細(xì)胞能夠體外分化為單倍體精子，并具備受精潛能(圖3)。本研究團(tuán)隊在國際上首次報道，將隱睪患者的精原干細(xì)胞體外誘導(dǎo)定向分化為精子細(xì)胞，并證明其具備受精潛能，為臨床治療精子發(fā)生障礙提供了新的理論基礎(chǔ)。

A 雙原核胚胎 B 2細(xì)胞 C 4細(xì)胞 D 8細(xì)胞圖3 隱睪患者精原干細(xì)胞培養(yǎng)為圓形精子卵泡內(nèi)單精子注射(ICSI)后具備胚胎發(fā)育潛能

4 構(gòu)建精子發(fā)生障礙治療新技術(shù)

4.1 提出“三步法”取精手術(shù)體系 顯微外科取精技術(shù)是近年無精子癥治療的里程碑，目前顯微鏡下睪丸取精術(shù)(micro-testicular sperm extraction，micro-TESE)是無精子癥患者手術(shù)取精的“金標(biāo)準(zhǔn)”。相對于睪丸穿刺取精(testicular sperm aspiration，TESA)和睪丸活組織檢查(簡稱活檢)取精(testicular sperm extraction，TESE)，micro-TESE的取精成功率較高，但睪丸切開大范圍尋找精子，不可避免地會損傷部分血管及睪丸間質(zhì)組織，可能影響睪丸血供，甚至導(dǎo)致睪丸內(nèi)分泌功能減退，同時對于二次取精影響較大。通過回顧病例的資料及相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，不同病因非梗阻性無精子癥(non-obstructive azoospermia, NOA)患者顯微手術(shù)取精成功率的差異較大，如睪丸炎、克氏綜合征、Y染色體AZFc區(qū)缺失患者顯微手術(shù)取精成功率顯著高于特發(fā)性無精子癥患者[7-8]。因此，對于不同病因的患者選擇不同的取精方式，以期在保證手術(shù)取精成功的同時，盡可能地減少手術(shù)給患者造成的損傷。本研究團(tuán)隊提出“三步法”取精手術(shù)體系(圖4)，對于手術(shù)取精成功率較高的患者，首先進(jìn)行穿刺取精或小切口表面活檢，穿刺找到精子，即停止進(jìn)一步擴大切口；如穿刺取精未成功，則進(jìn)行多點活檢取精(multiple-testicular sperm extraction，multiple-TESE)，其為傳統(tǒng)切開取精的改良方法，于睪丸橫軸同一平面不同部位多個小切口行活檢取精，可在減少睪丸組織、血管損傷的同時，提高取精成功率；如multiple-TESE未成功，再進(jìn)行micro-TESE，以期盡可能地提高取精成功率。

A TESA B multiple-TESE C micro-TESE圖4 “三步法”取精手術(shù)體系

4.2 建立稀少精子凍存新方法 嚴(yán)重稀少精子實施冷凍保存是世界性難題，對于嚴(yán)重少精子癥患者或經(jīng)過治療得到少量精子的NOA患者而言，稀少精子冷凍是結(jié)合輔助生殖技術(shù)，幫助患者生育健康子代的關(guān)鍵手段。精子對溫度變化非常敏感，精子細(xì)胞膜容易在冷凍復(fù)蘇過程中受損，本研究團(tuán)隊通過研究精子冷凍損傷機制，改進(jìn)精子冷凍保存的方法和裝置(發(fā)明專利名稱為“液氮熏蒸冷凍及儲運配子一體化裝置”，授權(quán)專利號為ZL201210058038.5)，探索出適合稀少精子冷凍保存的方法，即使用一種新型超細(xì)麥管結(jié)合稀少精子體外培養(yǎng)液，實現(xiàn)了對稀少精子冷凍保存(發(fā)明專利名稱為“一種稀少精子體外培養(yǎng)液”，授權(quán)專利號為ZL201410270739.4)。與0.25 mL和0.5 mL麥管相比，超細(xì)麥管使稀少精子冷凍復(fù)蘇后活力更高(超細(xì)麥管、0.25 mL麥管、0.5 mL麥管分別為38.5%、27.4%、25.6%)，這種方法為嚴(yán)重少精子癥及經(jīng)過治療精液中出現(xiàn)少量精子的“從無到有”患者提供了更好的生育力保存方法。

綜上所述，本研究項目著眼于男性不育的基礎(chǔ)與臨床研究，主要針對嚴(yán)重少弱精子癥、無精子癥患者的生育力檢測、診斷、治療及精道重建等關(guān)鍵問題。找到新病因，闡明新機制，為推動中國男性不育患者的診斷和治療提供更多的依據(jù)和方法。路漫漫其修遠(yuǎn)兮，本研究團(tuán)隊將上下求索，幫助患者實現(xiàn)從無精到有精。