小球藻-菌劑聯(lián)合處理氨氮廢水的實驗研究

鄭思米，魏 群，馬湘蒙，陳如歌，袁思涵，黃宇菲，李淑媛

(廣西大學(xué) 資源環(huán)境與材料學(xué)院，廣西 南寧 530004)

0 引 言

隨著工業(yè)化進(jìn)程的加快，人類生活中產(chǎn)生的廢水逐漸增多，導(dǎo)致環(huán)境水質(zhì)變差[1]，其中氨氮是致使水質(zhì)變差的重要因素之一。氨氮含量過高具有很多危害，比如水體中溶解氧降低，影響水生生物生存、對生態(tài)環(huán)境和人類健康都有不同程度的影響[2-3]。目前對氨氮廢水的處理技術(shù)主要有物理化學(xué)法和生物法兩大類，而這些傳統(tǒng)氨氮廢水的處理技術(shù)存在一定的缺陷，如物理化學(xué)方法具有二次污染的缺點，傳統(tǒng)生物法中具有曝氣量大、污泥產(chǎn)量高等缺點[4]。因此，尋求一種節(jié)能環(huán)保的氨氮廢水處理技術(shù)顯得尤為重要。

藻菌共生體系可以通過微藻與細(xì)菌之間的協(xié)同作用來處理廢水，其操作簡單且無二次污染，還有利于微藻生物質(zhì)收獲，具有重要的環(huán)境效益和經(jīng)濟效益。目前,藻菌體系處理氨氮廢水的研究主要是通過單因素實驗進(jìn)行分析。該方法具有較大的局限性，且對藻菌共生生長的內(nèi)在機制及去除氨氮的機理分析也相對甚少。本文以蛋白核小球藻和菌劑構(gòu)建的藻菌體系為對象，探究了光照強度、菌藻接種比以及初始氨氮濃度等因素對該體系處理氨氮廢水的影響，利用響應(yīng)面實驗優(yōu)化了影響因素參數(shù)，通過計算氨氮的去除途徑分析了微藻和細(xì)菌對氨氮去除的貢獻(xiàn)程度，測定體系pH和EPS中的氮素變化，對藻菌體系的共生機制進(jìn)行了探究，最后采用高通量測序分析了藻菌體系中的微生物群落變化，證明了該體系的優(yōu)越性，為該體系處理氨氮廢水的實際工程應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗藻種：蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)，購自中國科學(xué)院武漢水生生物所。在25 ℃下使用BG11培養(yǎng)基對蛋白核小球藻進(jìn)行培養(yǎng)[5]。將配制好的培養(yǎng)基用1 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.1±0.2后，在121 ℃下高壓滅菌30 min，冷卻至室溫后用紫外線消毒30 min。在無菌條件下，將藻液接種到裝有BG11培養(yǎng)基的1 L錐形瓶中，用白色熒光燈進(jìn)行連續(xù)光照培養(yǎng)[6]，光照強度為4 000 lux，溫度為(25±2)℃。每天搖晃錐形瓶3次。

實驗菌種：微生物菌劑(含硝化細(xì)菌、微量元素，呈粉末狀)，購自南京賽爾特生物技術(shù)有限公司。細(xì)菌接種于滅菌的培養(yǎng)基中(葡萄糖10 g·L-1、去離子水1 L)，于250 mL錐形瓶內(nèi)振蕩培養(yǎng)，溫度為(30±2) ℃。

實驗廢水：采用模擬氨氮廢水，模擬廢水配方見表1。接種方式：藻液和菌液經(jīng)4 000 r·min-1離心10 min，棄上清液后獲得藻泥和菌泥，用去離子水沖洗3次殘余培養(yǎng)基后，接種至模擬氨氮廢水中[7]。

表1 模擬廢水配方Table 1 Simulated wastewater formula

1.2 實驗方法

所有實驗組中，單一小球藻組初始接種濃度為0.2 g·L-1、藻菌體系的總接種濃度為0.2 g·L-1。在初始氨氮濃度為100 mg·L-1、菌藻比為3∶1的條件下，考察不同光照強度對氨氮廢水的處理效率，設(shè)置光強為2 000、4 000、6 000 lux；在初始氨氮濃度為100 mg·L-1、光強為4 000 lux的條件下，考察不同菌藻比對氨氮廢水的處理效果，設(shè)置菌藻比(質(zhì)量比)為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，并設(shè)置單一的蛋白核小球藻組為對照組；在3∶1菌藻比、光強為4 000 lux的條件下，研究小球藻菌體系處理不同初始氨氮濃度的氨氮去除效率，設(shè)置初始氨氮濃度為50、100、150、300、600 mg·L-1。藻菌接種至1 L(體積為700 mL)的錐形瓶中，在無曝氣條件下處理模擬氨氮廢水，溫度控制在(25±2) ℃，每日取樣測定氨氮、pH、葉綠素a。

響應(yīng)面實驗：以藻菌體系處理模擬氨氮廢水的各項單因素最適范圍值為基礎(chǔ)，進(jìn)行響應(yīng)面燒杯實驗(見表2)。利用Design Expert 8.0.6響應(yīng)面軟件設(shè)計響應(yīng)面Box-Behnken實驗方案進(jìn)行17組燒杯實驗，以氨氮去除率為響應(yīng)值。

表2 響應(yīng)面實驗各影響因素最適范圍值輸入表Table 2 Input table of optimum range values of each influencing factor for the response surface experiment

1.3 分析方法

氨氮：納氏試劑分光光度法；硝態(tài)氮：紫外分光光度法；亞硝態(tài)氮：分子吸收分光光度法；葉綠素a：分光光度法[8]；pH：多參數(shù)水質(zhì)測定儀；光照強度：照度計；微生物群落：高通量測序(上海美吉生物有限公司)；T-EPS和L-EPS提取方法如下[9]：取10 mL樣品至15 mL離心管，以4 000 r·min-1離心10 min，離心去上清液后，沉淀物中加入0.05%NaCl溶液至10 mL，并以8 000 r·min-1離心10 min，收集上清液得到松散型EPS(L-EPS)。剩余沉淀物中加入0.05%NaCl溶液至10 mL，然后在60 ℃水浴中放置30 min，再以15 000 r·min-1離心20 min，收集上清液獲取緊密型EPS(T-EPS)。

游離氨揮發(fā)所占比例用式(1)計算[10]：

由表2可以看出，硬度不同的橡膠套對推力桿的整體強度存在一定的影響，隨著硬度的增大，管柱的應(yīng)力值變化較小，銷軸受力一端的應(yīng)力變化也不明顯，約束一端的應(yīng)力值小幅度上升，推力桿頭的部分應(yīng)力值上升明顯。綜合考慮對推力桿的強度和剛度要求及橡膠本身的強度要求，橡膠的硬度選擇HS50為宜。

(1)

式(1)中：T為實驗過程中體系的溫度，℃。

硝化作用所占比例用式(2)計算[11]：

(2)

式(2)中：C0(NH3-N)為初始氨氮濃度，mg·L-1；C(NO3-N)和C(NO2-N)反應(yīng)結(jié)束后體系的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮濃度，mg·L-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 光照強度、菌藻接種比及初始氨氮濃度對藻菌體系去除氨氮的影響

圖1(a)為實驗組在不同光照強度下氨氮濃度變化曲線。由圖1(a)可知，實驗組中氨氮濃度在前三天都迅速下降，隨后緩慢下降至穩(wěn)定狀態(tài)，其中2 000 lux組最終穩(wěn)定在46 mg·L-1，4 000 lux 和6 000 lux組最終穩(wěn)定在10.22 mg·L-1和23 mg·L-1，低光強條件下(2 000 lux)的藻菌體系對氨氮的處理效果明顯不如高光強條件(4 000 lux 和6 000 lux)。光強為4 000 lux組對氨氮的去除效果最好，六天內(nèi)將氨氮下降至10.22 mg·L-1，氨氮的去除率達(dá)到89.57%；6 000 lux 組對氨氮的去除率為76.67%；2 000 lux組對氨氮的去除效果最差，六天內(nèi)的去除率僅為57.41%。當(dāng)光強增加時，藻菌體系對氨氮的去除率也會增加，但增加到6 000 lux時，體系對氨氮的去除率會下降，這說明當(dāng)光強繼續(xù)提高時，超過了小球藻生長所需的飽和光強[12]。因此，本研究中選擇光強為4 000 lux為藻菌體系去除氨氮的最佳光照條件。

圖1(b)為不同菌藻比條件下氨氮變化曲線。由圖1(b)可知，菌藻比3∶1組對氨氮的去除效果最好，六天后將氨氮降至13.16 mg·L-1，對氨氮的去除率達(dá)到了89.61%；單一的小球藻實驗組對氨氮的去除效果最差，六天后氨氮降至85.31 mg·L-1，去除率僅為31.84%。從氨氮變化的曲線下降趨勢可以看出，實驗組在第一天對氨氮的去除速率最快，藻菌實驗組處理量均大于單一小球藻組。這說明藻菌共生體系與單一的微藻相比，去除氨氮的優(yōu)勢明顯，因此選擇菌藻比3∶1為該體系處理氨氮廢水的最佳菌藻接種比。

圖1 不同光照強度和不同菌藻比條件下的氨氮變化曲線Fig.1 Variation curves of ammonia nitrogen concentration under different light intensities and bacteria-to-algae ratios

不同初始氨氮濃度組的氨氮去除率如圖2(a)所示。初始氨氮濃度50 mg·L-1的實驗組在整個實驗過程中對氨氮的去除率最高，為94.92%，50、100、150 mg·L-1實驗組對氨氮的去除率均大于70%，而大于150 mg·L-1的兩組藻菌體系對氨氮去除率分別為48.44%和18.76%。圖2(b)為不同初始氨氮濃度組氨氮削減量圖，初始氨氮為300 mg·L-1組的氨氮削減量最大，為143.07 mg·L-1，而初始氨氮600 mg·L-1組的氨氮削減量為112.74 mg·L-1。這說明在初始氨氮濃度為300 mg·L-1的條件下，微藻仍然能夠正常生長且吸收氨氮，當(dāng)氨氮的濃度繼續(xù)增加時，由于氨氮過高對微藻產(chǎn)生毒害，導(dǎo)致微藻吸收氨氮量減少[13]。

圖2 不同初始濃度對氨氮去除率和削減量的影響Fig.2 Removals (%) and reduction amounts of ammonia nitrogen with different initial concentrations

2.2 響應(yīng)面分析

續(xù)表

從響應(yīng)面的曲線圖進(jìn)行分析，圖3為基于中心組合設(shè)計(BBC)的氨氮去除率響應(yīng)面和等高線圖，可反映兩因素交互作用的強弱[14-15]。從圖3(a)和圖3(c)響應(yīng)曲面圖可知，隨著光強的增加，氨氮的去除率也會隨之增加，但是當(dāng)光強增大到一定程度后，氨氮去除率則會有下降的趨勢。從圖3(b)和圖3(d)的等高線圖可以看出，當(dāng)光強較小時，其等高線表現(xiàn)為平緩，說明菌藻比和初始氨氮濃度對氨氮去除率的影響不顯著，在光強為4 000 lux 附近時較顯著，因此在響應(yīng)面曲線圖中表現(xiàn)為陡峭。從圖3(e)的響應(yīng)曲面可以看出，隨著初始氨氮濃度和菌藻比的增加，氨氮去除率變化不明顯；從圖3(f)等高線圖可知，菌藻比和初始氨氮濃度兩因素之間的交互作用不明顯。最終由響應(yīng)曲面的陡峭程度可以看出，光強對氨氮去除率的影響最顯著，其次是初始氨氮濃度，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖3 不同的兩種因素之間對氨氮去除率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface diagram and contour diagram of the influence of two different factors on ammonia nitrogen removal (%)

為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，以確定的最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)實驗，根據(jù)實際情況進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，具體選擇的參數(shù)如下：光強4 700 lux、菌藻比3∶1、初始氨氮濃度56 mg·L-1。結(jié)果取3次平行實驗平均值，得到氨氮去除率為87.96%，與模型預(yù)測值的87.31%非常接近，證明響應(yīng)面法參數(shù)優(yōu)化結(jié)果具有有效性。

2.3 氨氮去除機理分析

2.3.1 氨氮去除途徑

通過計算氨氮去除途徑分析藻菌體系中小球藻和細(xì)菌對氨氮去除的貢獻(xiàn)程度。在藻菌體系中，氨氮的主要去除途徑包括氨揮發(fā)、硝化作用及微藻吸收[16]。計算數(shù)據(jù)基于初始氨氮濃度為50 mg·L-1實驗組。通過計算，在實驗過程中由于pH維持在8.5左右，氨揮發(fā)所占的比例很小，僅為6.64%；而在體系中，最終剩余的氨氮含量為2.9 mg·L-1，硝態(tài)氮的剩余含量為0.88 mg·L-1，無亞硝態(tài)氮的產(chǎn)生。因此通過硝化作用去除氨氮所占比例為17.50%；體系中還有少量氨氮儲存在EPS中，可忽略不計；微藻吸收氨氮占比為75.86%。這說明在氨氮去除的過程中，小球藻的貢獻(xiàn)程度大于細(xì)菌。

圖4為藻菌體系和單一小球藻的pH變化。通過圖4的pH變化曲線淺析了藻菌體系去除氨氮過程的機理和優(yōu)越性。單一小球藻中的pH從第二天開始便迅速降到4以下，隨后整個體系始終處于酸性環(huán)境中，小球藻也迅速失活。造成這種現(xiàn)象的原因是小球藻去除氨氮的方式是通過同化吸收作用，首先將氨同化為谷氨酰胺并釋放H+，然后在谷氨酰胺合成酶的作用下，利用三磷酸腺苷(ATP)作為電子供體與谷氨酸合成氨基酸谷氨酰胺[17]。在這個過程中，小球藻向水體中釋放出了大量H+，導(dǎo)致廢水pH下降[18-19]。在藻菌體系中，pH可以保持在8左右，也是適合小球藻生長的pH范圍，因此體系得以持續(xù)去除廢水中的氨氮，其原因在于體系中溶于水的CO2會與碳酸氫鹽保持動態(tài)平衡，見式(3)，而來自細(xì)菌產(chǎn)生的CO2平衡見式(4)。由于小球藻的活性高于細(xì)菌，故小球藻光合作用吸收的CO2就會大于細(xì)菌硝化作用釋放出來的CO2，導(dǎo)致式(3)的反應(yīng)速度大于式(4)。因此，小球藻所需的CO2就需要依靠碳酸氫鹽的水解補充，這樣就導(dǎo)致體系OH-濃度增加，中和了微藻在同化吸收氨氮過程中產(chǎn)生的氫離子，使得pH保持較為穩(wěn)定。

(3)

(4)

圖4 藻菌體系和單一小球藻的pH變化Fig.4 pH changes of the Chlorella-bacteria systemand single Chlorella

2.3.2 藻菌體系共生機制

藻菌體系之所以能夠持續(xù)保持穩(wěn)定、高效去除污染物，其中主要的原因之一在于EPS在體系中發(fā)揮了重要的作用。EPS是藻菌互利共生的關(guān)鍵介質(zhì)。研究表明，EPS在藻菌體系中是重要的營養(yǎng)物質(zhì)儲存和轉(zhuǎn)化場所[20]。

通過測定松散型EPS(L-EPS)和緊密型EPS(T-EPS)中的氨氮、硝態(tài)氮濃度變化，分析了藻菌共生體系中物質(zhì)交換的機理。由圖5可以看出，在T-EPS中，氨氮始終處于下降趨勢，且沒有硝態(tài)氮的生成，說明T-EPS是氮元素的轉(zhuǎn)移場所而不是轉(zhuǎn)化場所。因此，在T-EPS中，吸附的氨氮和游離在廢水中的氨氮一樣，都被微藻直接吸收。由圖5可知，氨氮在L-EPS中的含量逐漸升高，一天后到最高點，然后開始下降，第三天后基本穩(wěn)定，而硝態(tài)氮在L-EPS中逐漸增加后趨于穩(wěn)定，說明廢水中的氨氮一部分被微藻直接吸收利用，一部分被細(xì)菌硝化過程轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮且儲存在了EPS中，還有一部分直接存至EPS中。另外，在廢水中存在Ca2+和Mg2+，這兩種離子是微藻用于自身細(xì)胞壁的合成和葉綠素的形成的關(guān)鍵元素，Ca2+和Mg2+會主動轉(zhuǎn)運至微藻細(xì)胞，且微藻周圍帶負(fù)電荷的EPS與帶正電荷的離子(主要是Ca2+和Mg2+)也會充分接觸，這使得EPS上會吸附大量Ca2+和Mg2+，讓微藻細(xì)胞產(chǎn)生更多的葉綠素，從而增強了微藻細(xì)胞的光合作用活性[21]。因此，微藻會產(chǎn)生更多的氧氣提供給細(xì)菌，而細(xì)菌產(chǎn)生二氧化碳讓微藻生長得到充分的碳源，同時，微藻和細(xì)菌的活性增強又進(jìn)一步促進(jìn)了EPS的分泌，形成了良性循環(huán)，藻菌與EPS間的關(guān)系如圖6所示?？傊寰w系通過EPS這個關(guān)鍵紐帶維持著較高的穩(wěn)定性，從而保證該體系可以高效地去除氨氮。

圖5 L-EPS和T-EPS中氨氮和硝態(tài)氮的變化Fig.5 Changes of ammonia nitrogen and nitrate nitrogen in L-EPS and T-EPS

圖6 藻菌與EPS間的關(guān)系Fig.6 Relationship between Chlorella,bacteria and EPS

2.4 藻菌體系微生物多樣性分析

生物群落多樣性可用Shannon和Simpson指數(shù)來評價。Shannon指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高，而Simpson值指數(shù)越大，表明群落的Alpha多樣性越差[22-23]。測序結(jié)果表明三組的覆蓋度均為0.999，說明本次測序結(jié)果能很好地代表樣本中微生物的真實情況，見表4。由Shannon和Simpson指數(shù)可知，隨著時間的增加，藻菌體系的微生物Alpha多樣性增加，大于初始階段，到第七天時，其多樣性指數(shù)保持相對穩(wěn)定，證明該體系的群落結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。

表4 藻菌體系中不同時期的微生物多樣性分析Table 4 Analysis of microbial diversity in the Chlorella-bacteria system at different periods

圖7(a)為屬(Genus)水平上藻菌體系在第一天、第三天、第七天時處理模擬氨氮廢水后的微生物群落豐度分布。第一天，產(chǎn)卟啉桿菌屬(Porphyrobacter)的相對豐度為26.57%，是體系中的優(yōu)勢菌屬，其次為根瘤菌屬(Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium)的19.06%、短波單胞菌屬(Brevundimonas)的12.14%，這幾種菌屬均為變形菌門(Proteobacteria)；第三天，體系中的優(yōu)勢菌屬發(fā)生了變化，Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium成為了優(yōu)勢菌屬，相對豐度變?yōu)?6.03%，Porphyrobacter的相對豐度降至15.13%；第七天，優(yōu)勢菌屬依然是Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium，其次是Porphyrobacter，兩者的相對豐度幾乎保持穩(wěn)定，分別為40.24%和17.39%。結(jié)合體系溶解氧(見圖7(b))和生物群落變化分析，第一天到第三天，體系內(nèi)的溶解氧從最高點迅速下降，此時Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium的活性最高，因為該菌屬生長主要依賴的氮源為氨氮[24]，所以在此階段該菌屬對氨氮的硝化作用增強，在這個過程中消耗了體系中大量的氧氣供自身生長。因此，該菌屬的相對豐度增加。Porphyrobacter的相對豐度的減少可能是由于該菌屬是光合不產(chǎn)氧細(xì)菌[25]，會與微藻競爭光照，而微藻的生長導(dǎo)致了該菌屬相對豐度的下降。隨著時間的推移，Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium和Porphyrobacter兩種菌屬的相對豐度保持穩(wěn)定，這可能是由于EPS在體系中能持續(xù)提供營養(yǎng)物質(zhì)，使得細(xì)菌與小球藻能很好地共生生長。有研究表明，Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium具有促進(jìn)微藻生長的作用[26]，而Porphyrobacter能促進(jìn)微藻的絮凝[27]，這也證明了該體系有利于微藻的生物質(zhì)收獲，同時能改善水環(huán)境水質(zhì)。

圖7 藻菌體系在不同時期的屬水平群落結(jié)構(gòu)和DO變化曲線Fig.7 Genus level community structure and curve of DO chang ofthe Chlorella-bacteria system in different periods

3 結(jié) 論

(1)單因素實驗結(jié)果表明：光照強度為4 000 lux時，藻菌體系對氨氮去除效果最好；菌藻比為3∶1 是該體系處理氨氮廢水的最佳菌藻接種比；當(dāng)初始氨氮濃度為50 mg·L-1時，氨氮去除率最高，為94.92%。

(2)藻菌體系去除氨氮的因素影響主次關(guān)系為：光照強度 > 初始氨氮濃度 >菌藻比。通過響應(yīng)面進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化后得出，在光強4 700 lux、菌藻比3∶1、初始氨氮濃度56 mg·L-1的最佳組合下得到氨氮去除率的結(jié)果(87.96%)與預(yù)測值(87.31%)接近。

(3)當(dāng)系統(tǒng)內(nèi)氨氮濃度較低時，小球藻對氨氮的去除起主要作用，而氨氮能夠得到有效去除可能是由于細(xì)菌的存在維持了體系內(nèi)的pH，從而使小球藻保持一定的活性；EPS作為藻菌間進(jìn)行物質(zhì)交換，互利共生的關(guān)鍵介質(zhì)，維持著體系的良性循環(huán)。

(4)在藻菌體系中，根瘤菌屬(Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium)和產(chǎn)卟啉桿菌屬(Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium)的相對豐度保持穩(wěn)定，前者具有促進(jìn)微藻生長的作用，而后者能促進(jìn)微藻的絮凝，證明了該體系不僅能促進(jìn)微藻生長，還有利于微藻的生物質(zhì)收獲，同時改善水環(huán)境水質(zhì)。