LncRNA NEAT1在心力衰竭中的臨床意義及其對心肌細胞損傷的影響

彭思思，陳 喬，王鵬云

心力衰竭是心臟疾病發(fā)展的終末階段，常見于中老年人，但近年來在年輕群體中越來越常見[1-2]。研究顯示，全球心力衰竭的發(fā)病率高達1%～3%，近年來呈現(xiàn)不斷上升的趨勢[3-4]。心力衰竭可引起不同程度的呼吸衰竭、咳血、失眠無力及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，更有嚴重者存在一定的猝死風險[5]。目前，臨床發(fā)現(xiàn)心力衰竭主要由高血壓、糖尿病或者基礎(chǔ)心臟病等引起，且通常存在反復發(fā)作的情況[6]。對于心力衰竭的診斷，需要依靠X線檢查、超聲心動圖等影像技術(shù)[7]。雖然其診斷準確性較好，但并不利于早期心力衰竭大范圍的臨床篩查。而對于心力衰竭的治療，目前尚無有效的完全根治方案，臨床主要通過長時間的保守控制治療降低心力衰竭的潛在威脅[8]。因此，充分了解心力衰竭的發(fā)病機制，尋找到新的診治方案將是降低其潛在威脅的關(guān)鍵。

近年來，研究學者將目光聚焦在長鏈非編碼RNA(LncRNA)[9]。LncRNA作為一種已被證實參與了多項慢性疾病、心臟疾病的重要因素，具有成為疾病診斷標志物、分子治療靶點的重要意義[10-12]。其中，LncRNA NEAT1是近年來被發(fā)現(xiàn)的家族成員之一，最早被證實參與了冠心病的發(fā)生[13]。隨后，陸續(xù)有研究指出NEAT1還與心肌梗死、心肌細胞缺氧也密切相關(guān)[14-15]，但與心力衰竭的關(guān)系尚不清楚。推測NEAT1可能同樣參與了心力衰竭的發(fā)生，且有望成為未來心力衰竭的診治突破口。本研究將通過探究NEAT1在心力衰竭中的價值，為未來臨床診治心力衰竭提供新的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病人信息與納入、排除標準 選取2019年8月—2020年10月江漢大學附屬醫(yī)院武漢市第六醫(yī)院收治的高血壓合并心力衰竭病人87例(觀察組)及同時期高血壓病人95例(對照組)為研究對象。心力衰竭病人中左心衰竭54例，右心衰竭28例，全心衰竭5例。兩組臨床資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。觀察組入選標準：高血壓病人；確診為慢性心力衰竭；年齡20～70歲；病例資料完整。觀察組排除標準：合并多項心腦血管疾病、免疫性缺陷疾病、感染性疾病、精神障礙疾病、腫瘤疾病病人；肝腎功能不全病人；藥物過敏病人；入院前半年內(nèi)接受了手術(shù)、放療、化療、抗生素類藥物治療病人；轉(zhuǎn)院病人。對照組入選標準：高血壓病人；病例資料完整；無重大既往病史；年齡20～70歲。對照組排除標準：合并其他心腦血管疾病病人。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準，病人均簽署知情同意書。

1.2 細胞信息 人心肌細胞AC16，購自American type culture collection(ATCC)。培養(yǎng)于90% DMEM高糖培養(yǎng)液中，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.3 治療方法 兩組病人入院后均進行常規(guī)降血壓、降血脂治療，觀察組給予常規(guī)強心-、利尿及擴張血管治療，連續(xù)2周。此外，口服卡維地洛(齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20000100)，初始劑量為每次3.125 mg，每日2次；耐受性良好則在服用7 d后增加至每次6.250 mg，每日2次；每2周增加1倍劑量，目標劑量25 mg/d，持續(xù)治療3個月。并對病人進行為期1年的隨訪，記錄病人治療后疾病復發(fā)情況。

1.4 樣本采集 抽取觀察組治療前(入院時)、治療后(治療3個月時)以及對照組治療前空腹靜脈血4 mL于促凝管中，室溫下靜置30 min后離心(1 505×g，10 min)，取得上層血清放入-80 ℃冰箱中待測。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)檢測 TRIzol提取待測物總RNA，按照說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進行擴增，以β-actin與U6為內(nèi)參(美國Invitrogen設(shè)計)，2-△△ct法計算基因表達。引物序列詳見表1。

表1 引物序列

1.6 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期AC16接種于12孔板，Lipofectamine?2000將靶向升高NEAT1表達載體(NEAT1-sh)及對照空載體(NEAT1-sh-NC)、靶向沉默NEAT1表達載體(NEAT1-si)及對照空載體(NEAT1-si-NC)；miR-342-3p模擬物序列(miR-342-3p-mi)及陰性對照(miR-342-3p-mi-NC)、miR-342-3p抑制物序列(miR-342-3p-in)及陰性對照(miR-342-3p-in-NC)分別轉(zhuǎn)染至AC16中。

1.7 CCK-8實驗 取轉(zhuǎn)染后AC16接種于96孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h時取一孔加入10 μL CCK-8，用酶標儀檢測吸光度值(450 nm)。

1.8 流式細胞計數(shù) 取轉(zhuǎn)染后AC16胰酶消化，加入Binding Buffer重懸，隨后依次加入5 μL的Annexin Ⅴ-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)與碘化丙啶(PI)，流式細胞儀檢測凋亡率。

1.9 雙熒光素酶報告實驗 在線靶基因預(yù)測網(wǎng)站ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn/)分析NEAT1與miR-342-3p的關(guān)系；構(gòu)建NEAT1雙熒光素酶報告質(zhì)粒(WT與MUT)，將miR-342-3p-mi與miR-342-3p-mi-NC與之共轉(zhuǎn)染到AC16中。溫育48 h后，測定熒光活性。

2 結(jié) 果

2.1 NEAT1、miR-342-3p的臨床意義 觀察組NEAT1表達高于對照組，而miR-342-3p表達則低于對照組(P<0.05)。ROC曲線分析顯示，當NEAT1取截斷值為1.785時，預(yù)測高血壓病人發(fā)生心力衰竭的靈敏度為67.82%，特異度為78.95%，曲線下面積(AUC)為0.800，95%CI(0.737，0.864)；而當miR-342-3p取截斷值為4.315時，預(yù)測高血壓病人發(fā)生心力衰竭的靈敏度為72.41%，特異度為70.53%，AUC為0.751，95%CI (0.681，0.822)。詳見圖1。

圖1 NEAT1、miR-342-3p的臨床意義

2.2 NEAT1、miR-342-3p的預(yù)后意義 觀察組治療后 NEAT1降低(P<0.05)，miR-342-3p升高(P<0.05)。預(yù)后隨訪中成功隨訪到所有病人，22例出現(xiàn)心力衰竭復發(fā)，總復發(fā)率為25.29%。預(yù)后復發(fā)病人治療后 NEAT1明顯高于未復發(fā)病人(P<0.05)，而miR-342-3p低于未復發(fā)病人(P<0.05)。ROC曲線分析顯示，當治療后NEAT1取截斷值為1.670時，預(yù)測心力衰竭復發(fā)的靈敏度為90.91%，特異度為84.62%，AUC為0.917，95%CI(0.860，0.974)；而當治療后miR-342-3P取截斷值為4.560時，預(yù)測病人心力衰竭復發(fā)的靈敏度為95.45%，特異度為83.08%，AUC為0.896，95%CI(0.823，0.969)。詳見圖2。

圖2 NEAT1、miR-342-3p的預(yù)后意義

2.3 NEAT1對AC16的影響 NEAT1-sh組NEAT1水平較NEAT1-sh-NC組升高(P<0.05)，而NEAT1-si組則較NEAT1-si-NC組降低(P<0.05)，證實轉(zhuǎn)染成功。生物學行為檢測結(jié)果顯示，NEAT1-sh組增殖能力低于NEAT1-sh-NC組(P<0.05)，凋亡率高于NEAT1-sh-NC組(P<0.05)；而NEAT1-si組則增殖能力高于NEAT1-si-NC組(P<0.05)，凋亡率低于NEAT1-si-NC組(P<0.05)。詳見圖3。

圖3 NEAT1對AC16的影響

2.4 miR-342-3p對AC16的影響 miR-342-3p-mi組miR-342-3p水平較miR-342-3p-mi-NC組升高，miR-342-3p-in組則較miR-342-3p-in-NC組降低(P<0.05)，證實轉(zhuǎn)染成功。miR-342-3p-mi組增殖能力高于miR-342-3p-mi-NC組(P<0.05)，且凋亡率低于miR-342-3p-mi-NC組(P<0.05)；miR-342-3p-in組增殖能力低于miR-342-3p-mi-NC組(P<0.05)，且凋亡率高于miR-342-3p-mi-NC組(P<0.05)。詳見圖4。

圖4 miR-342-3p對AC16的影響

2.5 NEAT1與miR-342-3p的關(guān)系 ENCORI顯示，NEAT1與miR-342-3p存在可結(jié)合的互補位點，NEAT1-WT的熒光活性在轉(zhuǎn)染了miR-342-3p-mi后可見明顯降低(P<0.05)。而PCR檢測顯示NEAT1-sh組miR-342-3p表達水平低于NEAT1-sh-NC組(P<0.05)，而NEAT1-si組則高于NEAT1-si-NC組(P<0.05)。詳見圖5。

圖5 NEAT1與miR-342-3p的關(guān)系

3 討 論

心力衰竭作為臨床中的高發(fā)、高危疾病，深入了解其發(fā)病機制是未來診治心力衰竭的關(guān)鍵[16]。LncRNA作為目前臨床研究的熱點，其優(yōu)勢在于不僅可以成為疾病的特異性標志物，還可能通過基因靶向治療取得優(yōu)于目前臨床治療現(xiàn)狀的效果[17]。目前，NEAT1與心力衰竭的關(guān)系還有待證實，且本研究在收集實驗資料時發(fā)現(xiàn)miR-342-3p在心力衰竭小鼠中存在異常表達[18]，且Wang等[19]研究認為miR-342-3p與NEAT1可能存在一定關(guān)系。一方面可以從側(cè)面驗證NEAT1對于心力衰竭有著重要意義；另一方面也提示NEAT1在心力衰竭中的作用機制可能與miR-342-3p存在關(guān)系。

本研究首先對NEAT1與miR-342-3p在心力衰竭中的表達進行了初步檢測，結(jié)果顯示，NEAT1在心力衰竭中呈高表達，而miR-342-3p呈低表達，提示兩者可能參與了心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展。而在既往研究中發(fā)現(xiàn)糖尿病病人NEAT1也升高[20]，miR-342-3p在阿爾茨海默病病人中降低[21]，可初步佐證本實驗結(jié)果。隨后，ROC曲線分析顯示NEAT1與miR-342-3p對于預(yù)測心力衰竭的發(fā)生有著較好的效果，其中NEAT1的診斷特異度更是達到了78.95%。相較現(xiàn)臨床中對于心力衰竭的診斷方案(以影像結(jié)果為主)，不僅檢查過程較為復雜，且對于結(jié)果的判定主要是依據(jù)閱片醫(yī)師的主觀意識判斷，對于不典型的心力衰竭可能存在誤診、漏診風險[22]。而NEAT1與miR-342-3p作為在血液、體液、組織、細胞中均可以被檢測到的分子標志物[23]，不僅檢測樣本獲取、保存簡單，且可以實施大范圍、大數(shù)據(jù)的臨床篩查，提高心力衰竭的早期診斷率。本研究還發(fā)現(xiàn)觀察組病人治療后NEAT1明顯降低，miR-342-3p升高，更進一步證實了兩者參與了心力衰竭的病情發(fā)展。且預(yù)后隨訪顯示，NEAT1與miR-342-3p對于預(yù)測病人的疾病復發(fā)同樣具有較好的效果，為未來兩者作為心力衰竭標志物奠定了良好的基礎(chǔ)。

心力衰竭的發(fā)生與心肌細胞的活性降低，加速凋亡密切相關(guān)[24-25]，而目前NEAT1與miR-342-3p參與心力衰竭的機制仍不清楚，本研究通過心肌細胞AC16進行了體外實驗進行探究，結(jié)果顯示，在AC16中沉默NEAT1與過表達miR-342-3p均可以造成細胞活性的增強，凋亡降低，而升高NEAT1與抑制miR-342-3p則反之，初步證實了NEAT1與miR-342-3p在心力衰竭中的作用機制。且高表達的NEAT1與低表達的miR-342-3p可以促進心力衰竭發(fā)展的情況也與上述檢測結(jié)果符合。最后，通過雙熒光素酶報告實驗可知NEAT1-WT的熒光活性明顯受到miR-342-3p-mi的抑制，證實了兩者間存在靶向調(diào)控的關(guān)系。在升高NEAT1后，可以發(fā)現(xiàn)AC16中miR-342-3p明顯降低，而沉默NEAT1則可使miR-342-3p升高，可知在心力衰竭病人中NEAT1靶向抑制miR-342-3p。

本研究對NEAT1與miR-342-3p在心力衰竭中的作用進行了初步分析，仍存在諸多不足之處有待改進。首先，本研究納入的研究對象均為慢性心力衰竭病人，尚不清楚NEAT1與miR-342-3p在急性心力衰竭中的情況是否與本研究結(jié)果一致。而對于NEAT1靶向調(diào)控miR-342-3p影響AC16的相關(guān)信號通路目前還不清楚，有待更完善的實驗確認。且由于實驗周期較短，無法評估病人的遠期預(yù)后情況。

NEAT1在心力衰竭中呈高表達，通過靶向抑制miR-342-3p促進心肌細胞的凋亡，從而參與心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展，兩者對于未來臨床診治心力衰竭有著重要的意義。