玉米芯降解復(fù)合菌劑的構(gòu)建及其發(fā)酵效果初探

韓曉云，胡長(zhǎng)林，許 可，鄭桂華，郭宇豪，孫慶申

（1黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；3黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黑龍江省普通高等學(xué)校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

0 引言

農(nóng)業(yè)廢棄物如玉米芯、秸稈等是重要的生物質(zhì)資源，對(duì)其進(jìn)行深度開(kāi)發(fā)利用具有重要的理論意義及實(shí)踐價(jià)值[1]。黑龍江省是農(nóng)業(yè)大省，每年秋季產(chǎn)生大量包括玉米芯在內(nèi)的農(nóng)業(yè)廢棄物[2]，這些玉米芯除了少部分被回收利用生產(chǎn)吸附劑、餐具、多酚、納米纖維素、催化劑、糠醛及糠醇[3-8]，大部分都被焚燒掉，不僅造成環(huán)境污染，而且燃燒釋放的氮、硫氧化物對(duì)人體健康也構(gòu)成威脅[9]。隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，以焚燒包括玉米芯在內(nèi)的農(nóng)業(yè)廢棄物已經(jīng)被嚴(yán)令禁止，因此，尋求快速降解玉米芯的方案，提高其生物可利用性是迫切需要解決的問(wèn)題。

玉米芯主要由木質(zhì)素和纖維素組成，結(jié)構(gòu)堅(jiān)實(shí)，難降解[10]，為此，目前采用化學(xué)、生物學(xué)方法來(lái)降解纖維素。其中生物法，特別是微生物降解法因其對(duì)環(huán)境友好，不會(huì)造成二次污染而備受青睞[11]。在生物法降解纖維素木質(zhì)素方面，目前用的較多的是各種真菌如嗜熱毛殼菌[10]，利用其產(chǎn)酶性來(lái)降解木質(zhì)纖維素[1,10-14]?；谖⑸锝到饽举|(zhì)纖維素的優(yōu)良特性，本課題組自2013年開(kāi)始開(kāi)展了以牛糞玉米芯為發(fā)酵基質(zhì)，培育巴西菇項(xiàng)目的研究，并獲得國(guó)家技術(shù)發(fā)明專利一項(xiàng)[15]。但是牛糞富集、曬干，再與玉米芯混合發(fā)酵，過(guò)程繁瑣，且也存在著污染環(huán)境的問(wèn)題。牛屬于反芻動(dòng)物，牛瘤胃的微生物大多都是細(xì)菌，本研究是從牛糞體系中篩選出纖維素降解菌，研制出可有效降解玉米芯的復(fù)合菌劑，代替牛糞發(fā)酵降解玉米芯的纖維素、半纖維素，從而提高其生物利用度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用到的牛糞和玉米芯均來(lái)自黑龍江省銀沐生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)試劑：羧甲基纖維素鈉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)在黑龍江大學(xué)工業(yè)發(fā)酵分析實(shí)驗(yàn)室，于2019年12月—2020年11月進(jìn)行。

1.2 菌株的富集培養(yǎng)

按照本課題組專利[15]的方法制備牛糞玉米芯發(fā)酵料，采用二次發(fā)酵法，即分別于37℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵3天，57℃發(fā)酵2天，每隔36 h進(jìn)行翻堆和補(bǔ)水。將37℃發(fā)酵3天、57℃發(fā)酵2天的牛糞玉米芯發(fā)酵料以及干牛糞各5 g，分別加入95 mL的無(wú)菌生理鹽水制成懸液，分別利用PDA平板和LB平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3 纖維素降解菌株的篩選及鑒定

初步形態(tài)學(xué)觀察，確定上述純化菌株為細(xì)菌，將上述純化菌株用LB液體培養(yǎng)基，37℃，120 r/min搖床培養(yǎng)12 h待用。

1.3.1 初篩 參考文獻(xiàn)[16-17]，使用剛果紅法對(duì)菌株進(jìn)行初篩。

1.3.2 復(fù)篩 采用改良后的濾紙酶活法[18]對(duì)初篩結(jié)果中具有纖維素酶活的菌株進(jìn)行復(fù)篩，參考文獻(xiàn)[19]的方法制備液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，將初篩得到的菌株以濾紙酶活為指標(biāo)測(cè)定菌株的纖維素酶活力。

1.3.3 菌株鑒定 將復(fù)篩后得到的目標(biāo)菌株接種于LB平板上，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h，觀察記錄菌落形態(tài)、顏色等特征，革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。并根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[20]及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[21]，設(shè)計(jì)了甲基紅實(shí)驗(yàn)，淀粉水解實(shí)驗(yàn)，吲哚實(shí)驗(yàn)，V-P實(shí)驗(yàn)，過(guò)氧化氫實(shí)驗(yàn)和糖酵解實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定。最后將純化的目標(biāo)菌株樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行鑒定，所得序列提交NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對(duì)，并獲得NCBI序列號(hào)。

1.4 復(fù)合菌劑構(gòu)建

1.4.1 菌株拮抗實(shí)驗(yàn) 將復(fù)篩獲得的菌株于LB平板上兩兩相交劃線，37℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌株相交處是否有菌落生長(zhǎng)，菌落生長(zhǎng)完好表示菌株間沒(méi)有拮抗作用，可進(jìn)行復(fù)合菌劑的制備。

1.4.2 復(fù)合菌劑酶活力測(cè)定 根據(jù)前期平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，將沒(méi)有拮抗作用的目標(biāo)菌株以等菌落數(shù)加入至50 mL的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)配，參照文獻(xiàn)[18]的方法對(duì)優(yōu)勢(shì)降解菌單一菌株和復(fù)合菌劑分別進(jìn)行羧甲基纖維素酶(CMCase)、β-葡萄糖苷酶(β-Gase)和濾紙酶活(FPA)測(cè)定。

1.5 復(fù)合菌劑對(duì)玉米芯的發(fā)酵效果評(píng)價(jià)

1.5.1 牛糞玉米芯發(fā)酵料的制備 參考本實(shí)驗(yàn)室的方法[15]進(jìn)行。

1.5.2 復(fù)合菌劑玉米芯發(fā)酵料的制備 對(duì)牛糞玉米芯發(fā)酵料配方進(jìn)行改良，因使用了復(fù)合菌劑代替牛糞，本實(shí)驗(yàn)將其他配料加入量修改為：玉米芯88.24%、復(fù)合菌劑為10.59 log CFU/g、石膏1.18%、石灰1.18%、尿素0.47%和麩皮8.93%，混合后，加水?dāng)嚢?，用力握緊發(fā)酵料有水從指縫滲出，然后放入37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵，每間隔36 h進(jìn)行翻堆和補(bǔ)水。

發(fā)酵料的取樣采樣點(diǎn)為堆料的四角和中心點(diǎn)處，采樣點(diǎn)的深度為3～4 cm，各點(diǎn)取樣50 g混勻。每隔6天取樣，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5.3 纖維素降解率測(cè)定 使用纖維素測(cè)定儀（SLQ-202型，上海纖檢儀器有限公司）測(cè)量樣品中的纖維素含量并計(jì)算其降解率。試樣中的纖維素含量，按公式(1)進(jìn)行計(jì)算。

式中：CF—纖維素的百分含量(%)；A1—坩堝+纖維+殘?jiān)盎曳仲|(zhì)量(g)；A2—坩堝+殘?jiān)盎曳仲|(zhì)量(g)；S1—試樣質(zhì)量(g)。

然后按照公式(2)計(jì)算纖維素降解率。

式中Y—纖維素降解率(%)；X0—初始玉米芯纖維素含量；X1—試樣中玉米芯纖維素含量。

1.5.4 木質(zhì)素降解率測(cè)定 使用范式測(cè)定法[22]測(cè)定樣品中木質(zhì)素含量，按公式(3)進(jìn)行計(jì)算。

式中：X—試樣中木質(zhì)素的含量(g/100 g)；m1—烘干恒重后的試樣和濾紙質(zhì)量(g)；m2—濾紙質(zhì)量(g)；m3—試樣的質(zhì)量(g)；100—單位換算系數(shù)。

1.5.5 發(fā)酵料的結(jié)構(gòu)表征測(cè)定 X-Ray分析將發(fā)酵后發(fā)酵料粉碎，過(guò)60目篩，利用D/max-r B型X射線衍射儀（D/max-r B型，日本理光光學(xué)電機(jī)公司）測(cè)定其X-射線衍射圖譜。根據(jù)衍射圖譜強(qiáng)度，利用高度法計(jì)算纖維素結(jié)晶度，見(jiàn)公式(4)。

式中I002—002晶面衍射強(qiáng)度；Iam—無(wú)定型區(qū)衍射強(qiáng)度。

紅外光譜檢測(cè)稱取發(fā)酵后發(fā)酵料粉末2 mg，與200 mg在105℃條件下烘干至恒重的溴化鉀粉末混合均勻，研磨后壓片，利用傅里葉紅外光譜儀（Magna-560型，美國(guó)尼高力公司），掃描范圍為4000～370 cm-1，得到紅外光譜圖。

掃描電鏡觀察將發(fā)酵前后的玉米芯顆粒水洗至表面沒(méi)有雜質(zhì)，將玉米芯顆粒切成0.3 mm厚的均勻薄片，貼在導(dǎo)電膠上，加速電壓為15 kV，樣品表面進(jìn)行60 s噴金處理，采用QUANTA200掃描電鏡（QUANTA200型，荷蘭FEI公司），觀測(cè)發(fā)酵前后玉米芯表面結(jié)構(gòu)的破壞程度和結(jié)構(gòu)的變化情況。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

本研究中利用PDA平板從干牛糞中分離到4株菌（BC-1、BC-6、BC-8和BC-9），從牛糞和玉米芯37℃發(fā)酵料和57℃發(fā)酵料中分別分離到9株和4株菌，但是在之后的形態(tài)學(xué)觀察（鏡檢）和革蘭氏染色后，初步判定都是細(xì)菌，所以后來(lái)培養(yǎng)都采用LB培養(yǎng)基，不再使用PDA培養(yǎng)基。對(duì)干牛糞，37℃發(fā)酵3天牛糞玉米芯發(fā)酵料和57℃發(fā)酵2天的牛糞玉米芯發(fā)酵料分離純化得到菌株56株，將干牛糞中分離出的菌株編號(hào)為BC，37℃發(fā)酵3天牛糞玉米芯發(fā)酵料命名為B1，57℃發(fā)酵2天的牛糞玉米芯發(fā)酵料命名為B2。其中有17株其菌落較為干燥，39株較為濕潤(rùn)；14株菌落顏色為黃色或深黃色，42株為乳白色。

2.1.1 纖維素降解菌篩選結(jié)果 如圖1剛果紅培養(yǎng)基初篩結(jié)果所示，56株菌中，能產(chǎn)生透明圈的菌株共35株，可以證明這35株菌株都能產(chǎn)生纖維素酶，屬于纖維素降解菌。

圖1 纖維素降解菌利用剛果紅培養(yǎng)基初篩結(jié)果

2.1.2 濾紙酶活復(fù)篩結(jié)果 在初篩所篩選出的35株菌株中有14株菌株的濾紙酶活力均在9.0 U/mL以上，分別為BC-2W，BC-2Y，BC-7W，BC-7Y，BC-12W，BC-12Y，BC-15W，BC-15Y，B1-2，B1-11，B2-1，B2-7，B2-8，B2-9。其中最高為B2-9，酶活為18.40 U/mL。在接下來(lái)的復(fù)合菌劑的制備中，將以這14株菌株作為目標(biāo)菌株。

2.2 纖維素降解菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定 如圖2和表1所示，除BC-12Y和BC-15Y為革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)外，其余菌株均為革蘭氏陰性菌(G-)。菌體大小(μm)范圍在(0.8±0.65)×(0.60±0.04)～(3.48±0.78)×(0.86±0.07)之間。生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，初步判斷B1-2、B1-11、B2-7、B2-8、B2-9、BC-2Y、BC-2W、BC-7Y、BC-7W、BС-12W、BC-15W和B2-1為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，BC-12Y和BC-15Y為微小桿菌科(Microbacillaceae)。

表1 纖維素降解菌生理生化鑒定結(jié)果

圖2 纖維素降解菌革蘭氏染色圖片(1000×)

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果如表2所示。菌株B1-2、B1-11、B2-7、B2-8、B2-9、BС-2W、BС-2Y、BС-7W、BС-7Y、BС-12W、BС-15W均屬于腸桿菌屬，同源序列相似性達(dá)到99%，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，最后確定菌株B1-2、B1-11、BС-2W、BС-2Y、BС-7W、BС-7Y為阿氏腸桿菌(Enterobacter asburiae)；B2-7為路德維希腸桿菌(Enterobacter ludwigii)；B2-8、B2-9、BC-15W為霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei)，BС-12W為陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)。與B2-1相似性最高的菌株屬于克雷伯氏菌屬，同源序列相似性達(dá)到99%，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，最后確定菌株B2-1為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。BС-12Y和BС-15Y與微小桿菌屬相似性最高，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，最后確定菌株BC-12Y為微小桿菌(Exiguobacterium)，BС-15Y 為 乙 酰 微 小 桿 菌(Exiguobacterium acetylicum)。因?yàn)?BС-12W，B2-1為致病菌，因此在復(fù)合菌劑的制備中不使用此兩株菌株。

表2 菌株16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果

2.3 復(fù)合菌劑構(gòu)建結(jié)果

2.3.1 菌株拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果 為了得出各個(gè)菌株之間的拮抗作用，用平板劃線法將不同的菌株進(jìn)行兩兩相交劃線，然后得到菌株之間的拮抗關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖3。在3個(gè)劃線交點(diǎn)處都可見(jiàn)菌落正常生長(zhǎng)，沒(méi)有空斑出現(xiàn)，表明兩兩菌株相遇后其生長(zhǎng)不受抑制，從而證明所選12株菌株相互之間均沒(méi)有拮抗作用，它們均可以進(jìn)行下一步復(fù)配實(shí)驗(yàn)。

圖3 部分菌株劃線拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 復(fù)合菌劑酶活力測(cè)定結(jié)果 復(fù)合菌劑CM與單菌株酶活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4，復(fù)合菌劑CM的濾紙酶活(FPA)、β-葡萄糖苷酶活(β-Gase)和羧甲基纖維素酶活(CMCase)分別為15.72±0.37 U/mL、1.26±0.20 U/mL和2.61±0.20 U/mL。其中FPA活力均顯著高于其他單菌株酶活力(P＜0.01)，結(jié)果表明復(fù)合菌劑CM的3種酶活強(qiáng)于其他單菌株酶活，證明復(fù)合菌劑構(gòu)建有效。

圖4 單一菌株與復(fù)合菌劑CM酶活比較圖

2.4 復(fù)合菌劑對(duì)玉米芯的發(fā)酵效果

2.4.1 纖維素及木質(zhì)素降解率測(cè)定結(jié)果 發(fā)酵料中玉米芯纖維素與木質(zhì)素降解率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 玉米芯纖維素及木質(zhì)素降解率

在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，復(fù)合菌劑對(duì)纖維素的降解效果均高于牛糞，復(fù)合菌劑發(fā)酵后的纖維素降解率為(55.63±2.21)%，牛糞發(fā)酵后的纖維素降解率為(51.34±0.60)%。說(shuō)明復(fù)合菌劑CM可有效降解玉米芯。

3組樣品在相同條件下發(fā)酵，木質(zhì)素降解率隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，復(fù)合菌劑發(fā)酵玉米芯后木質(zhì)素降解率(41.56±4.17)%，高于牛糞發(fā)酵玉米芯后木質(zhì)素降解率(38.90±2.57)%，通過(guò)對(duì)木質(zhì)素的測(cè)定可知，復(fù)合菌劑CM可以有效降解木質(zhì)素。有研究顯示，木質(zhì)素酶通過(guò)首先降解木質(zhì)素，使得纖維素酶更能夠靠近底物，從而促進(jìn)纖維素的降解[14]。因此，對(duì)于玉米芯等農(nóng)業(yè)廢棄物，木質(zhì)素與纖維素的降解存在一定的協(xié)同作用，在降解這類生物質(zhì)能源時(shí)，需要降解菌劑能夠?qū)δ举|(zhì)素和纖維素進(jìn)行聯(lián)合作用[1]，這也是本研究的主要依據(jù)之一。

2.4.2 發(fā)酵料的結(jié)構(gòu)表征測(cè)定 化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變是反應(yīng)木質(zhì)纖維素降解過(guò)程的直觀表現(xiàn)[1]，因此，本研究對(duì)不同處理玉米芯材料的降解效果通過(guò)不同的結(jié)構(gòu)表征手段進(jìn)行了分析，如圖6所示。

圖6 發(fā)酵料X-射線衍射、FTIR及掃描電鏡結(jié)果

X-射線衍射檢測(cè)結(jié)果纖維素由結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形區(qū)構(gòu)成，而半纖維素和木質(zhì)素均為無(wú)定形區(qū)。結(jié)晶區(qū)占纖維素整體的百分率稱作結(jié)晶度，它反映了纖維素聚集時(shí)形成結(jié)晶的程度[23]。一般認(rèn)為，在22°出現(xiàn)的衍射峰代表纖維素結(jié)晶區(qū)的晶面衍射強(qiáng)度峰，而在18°左右的峰代表的是無(wú)定形區(qū)衍射強(qiáng)度峰。經(jīng)計(jì)算，發(fā)酵前的玉米芯，結(jié)晶度為33.13%；自然發(fā)酵的玉米芯，結(jié)晶度為31.20%；經(jīng)牛糞發(fā)酵后的玉米芯，結(jié)晶度為29.29%；經(jīng)復(fù)合菌劑發(fā)酵后的玉米芯結(jié)晶度為28.30%。由于結(jié)晶纖維素大分子排列緊密，水分子一般不能進(jìn)入。水分子只能進(jìn)入到結(jié)構(gòu)松散的無(wú)定形區(qū)，又因?yàn)樗肿佑幸欢ǖ臉O性，所以與無(wú)定形區(qū)中的羥基以氫鍵結(jié)合，發(fā)生結(jié)晶區(qū)之間的潤(rùn)脹。導(dǎo)致發(fā)酵前的玉米芯在22°與18°的相對(duì)衍射強(qiáng)度均較高。玉米芯經(jīng)發(fā)酵后，對(duì)于纖維素的作用主要集中于無(wú)定型區(qū)，對(duì)于纖維素結(jié)晶區(qū)的破壞程度很有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于非結(jié)晶區(qū)的降解，因而結(jié)晶度下降程度不明顯。相比較，復(fù)合菌劑對(duì)于玉米芯纖維素結(jié)晶區(qū)的破壞作用略高于牛糞。

結(jié)果表明，在3413 cm-1處為玉米芯中—OH的伸縮振動(dòng)峰，在2920 cm-1處為CH3的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，在1637 cm-1處為C=C的伸縮振動(dòng)峰。在1377、1733 cm-1處的振動(dòng)峰分別屬于纖維素與半纖維素C-H變形鍵和木聚糖C=O鍵特征峰[1]，經(jīng)過(guò)不同發(fā)酵處理的玉米芯在1733 cm-1處的振動(dòng)峰都完全消失，表明木聚糖被完全降解。經(jīng)復(fù)合菌劑發(fā)酵后的玉米芯在1637 cm-1處的C=C伸縮振動(dòng)峰相對(duì)增強(qiáng)，這是由玉米芯中C—C鍵斷裂形成C=C鍵所致，表明復(fù)合菌劑降解玉米芯中木質(zhì)纖維素的C—C鍵，形成不穩(wěn)定的C=C鍵，從而有效降解玉米芯。上述結(jié)果表明玉米芯中半纖維素和纖維素都得到了不同程度地降解。

掃描電鏡觀察可以更為直觀地反應(yīng)出明顯的降解效果[1]，對(duì)不同處理的發(fā)酵后的玉米芯進(jìn)行電鏡掃描觀察，結(jié)果如圖6所示。發(fā)酵前的玉米芯有較完整的外壁結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)有規(guī)律的孔狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，孔洞緊密排列，玉米芯自然發(fā)酵后孔洞變得疏松，外壁結(jié)構(gòu)變薄。經(jīng)過(guò)復(fù)合菌劑發(fā)酵后的玉米芯外壁結(jié)構(gòu)基本被破壞裂解，說(shuō)明微生物對(duì)玉米芯起到了降解作用，且比牛糞發(fā)酵后的玉米芯表面結(jié)構(gòu)破壞更加明顯。

3 討論與結(jié)論

玉米芯的結(jié)構(gòu)致密，主要由木質(zhì)素、纖維素及半纖維素組成，難于降解，利用度低，為此，本課題組前期利用牛糞通過(guò)二次發(fā)酵法降解玉米芯，效果好[15]。由此推測(cè)，牛糞中的微生物對(duì)玉米芯的降解起到關(guān)鍵的作用。因?yàn)槔门＜S直接發(fā)酵需要對(duì)牛糞進(jìn)行收集、晾曬、保存等，操作復(fù)雜，而將牛糞中的微生物分離出來(lái)，基于其對(duì)木質(zhì)素和纖維素的降解能力對(duì)其進(jìn)行初篩，再將篩選到的菌株進(jìn)行復(fù)配，實(shí)現(xiàn)不同菌株在降解玉米芯方面的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，具有重要的理論及應(yīng)用價(jià)值。

為此，本研究從牛糞與牛糞玉米芯發(fā)酵料中分離纖維素降解菌，其中從干牛糞中分離到了微小桿菌(BC-12Y)，乙酰微小桿菌(BC-15Y)，霍氏腸桿菌(B2-8、B2-9、BC-15W)，和阿氏腸桿菌(B1-2、B1-11、BС-2 W、BС-2Y、BС-7W、BС-7Y)，與前人[24-28]分別從板栗苞殼堆積物，土壤中，白蟻體內(nèi)，腐木、稻桿堆積的土壤，豬床40 cm墊料樣品中分離得到的菌株相同。但與文獻(xiàn)報(bào)道的菌株相比，本實(shí)驗(yàn)中阿氏腸桿菌，微小桿菌及霍氏腸桿菌的纖維素降解能力較低，而路德維希腸桿菌的FPA酶活較高，可能是因?yàn)槲⑸锷L(zhǎng)環(huán)境不同，底物不同，其產(chǎn)酶能力不同。本研究從牛糞及牛糞玉米芯發(fā)酵體系中分離纖維素降解菌，因此所篩選出的菌株可能更適用于降解玉米芯。

對(duì)生物質(zhì)材料如秸稈、玉米芯等進(jìn)行生物處理不僅對(duì)環(huán)境友好，而且成本低，所以已成為對(duì)生物質(zhì)原料進(jìn)行轉(zhuǎn)化的首選[1]。大多數(shù)研究采用真菌來(lái)降解木質(zhì)素，如Xu等[1]利用樺褐孔菌產(chǎn)木質(zhì)素酶來(lái)降解秸稈生物質(zhì)。而本研究采用的菌株均為細(xì)菌，且復(fù)配后的復(fù)合菌劑對(duì)玉米芯木質(zhì)素降解率可達(dá)(41.56±4.17)%，對(duì)玉米芯的纖維素降解率為(55.63±2.21)%，高于黃穎婕等[29]與劉曉飛等[30]分別從牛糞堆肥與寒地黑土中分離出的解淀粉芽孢桿菌與放線菌GS-3-39的纖維素降解率。這可能因?yàn)閱尉昝富钣邢?，而?fù)合菌劑由不同微生物復(fù)配到一起，協(xié)同分泌纖維素酶來(lái)降解，此外，復(fù)合菌劑的加入，會(huì)使發(fā)酵基質(zhì)的pH進(jìn)一步降低，有利于纖維素的降解[14]。

本實(shí)驗(yàn)復(fù)合菌劑發(fā)酵后的玉米芯結(jié)晶度降低，玉米芯的纖維素、木質(zhì)素、半纖維素特征峰相對(duì)吸光度減弱，外壁結(jié)構(gòu)基本被破壞，這與孫玲等[31]，劉曉飛等[30]所做研究結(jié)果一致，證明本研究中所復(fù)配的復(fù)合菌劑可有效降解玉米芯。

本實(shí)驗(yàn)以牛糞及牛糞玉米芯發(fā)酵料為菌源進(jìn)行分離純化，最終鑒定14株纖維素降解菌株，分別屬于7個(gè)菌種，這些菌株酶活力范圍在(9.15±0.81)U/mL～(12.06±1.43)U/mL之間。將其中12株菌種等菌落數(shù)復(fù)配，獲得的復(fù)合菌劑纖維素酶活力為(15.72±0.37)U/mL，對(duì)玉米芯纖維素降解率為(55.63±2.21)%，木質(zhì)素降解率為(41.46±0.87)%，有較強(qiáng)的纖維素及木質(zhì)素降解能力。結(jié)構(gòu)分析結(jié)果證明復(fù)合菌劑發(fā)酵后的玉米芯結(jié)晶度最低，玉米芯的纖維素、木質(zhì)素、半纖維素特征峰相對(duì)吸光度減弱，破壞程度最明顯，外壁結(jié)構(gòu)基本被破壞。本研究為新型玉米芯降解菌劑的開(kāi)發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)，也為后續(xù)復(fù)合菌劑的優(yōu)化與研發(fā)提供了理論依據(jù)。但是本研究中僅對(duì)具有降解纖維素和木質(zhì)素能力的菌株進(jìn)行等比例復(fù)配，初步驗(yàn)證了這些菌株之間的協(xié)同作用，后續(xù)將進(jìn)一步研究這些菌株中降解纖維素和木質(zhì)素的關(guān)鍵菌株，并根據(jù)降解貢獻(xiàn)率優(yōu)化復(fù)配比例。