網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合臨床探討接骨七厘膠囊對(duì)腰椎骨折的療效及作用機(jī)制

馮 莉 商 勛 趙小超 徐 盛 李 進(jìn)

江蘇省宿遷市中醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇宿遷 223800

接骨七厘膠囊（JGQLC）由大黃、當(dāng)歸、骨碎補(bǔ)、硼砂、乳香、沒(méi)藥、血竭、土鱉蟲(chóng)和自然銅9味中藥組成，被《國(guó)家基本藥物目錄·基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)配備使用部分》收錄記載，具有活血祛瘀、接骨止痛的功效。JGQLC還具有抗炎，促進(jìn)骨折愈合的作用[1-2]。腰椎骨折臨床較為常見(jiàn)，主要通過(guò)椎板切除減壓，對(duì)脊柱內(nèi)固定進(jìn)行治療，腰椎骨折患者后期伴隨許多并發(fā)癥，發(fā)展復(fù)雜，致殘率較高[3]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。本研究通過(guò)臨床病例回顧性分析JGQLC對(duì)腰椎骨折的療效，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)其對(duì)腰椎骨折的作用靶點(diǎn)及通路，討論分析其作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取宿遷市中醫(yī)院骨科2020年6月至2021年8月收治的腰椎骨折術(shù)后患者63例進(jìn)行回顧性分析研究，按用藥情況分為兩組，單用復(fù)方骨肽注射液患者為對(duì)照組（n=27），聯(lián)合使用JGQLC為觀察組（n=36）。對(duì)照組男10例，女17例，年齡24～69歲，平均（48.87±13.08）歲，胸腰椎（L1～L2）骨折14例、腰椎（L3～L5）骨折13例。觀察組男17例，女19例，年齡22～68歲，平均（50.84±11.85）歲，胸腰椎（L1～L2）骨折21例、腰椎（L3～L5）骨折15例。兩組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①影像檢查確診為L(zhǎng)1～L5骨折且為初次腰椎骨折患者；②病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不能遵從治療方案或有嚴(yán)重精神疾病者；②具有原發(fā)性免疫缺陷疾病者或休克、惡性心律失常者；③有惡性腫瘤者；④對(duì)本研究藥物過(guò)敏者；⑤處于孕期或哺乳期者；⑥合并心、肝、腎等重要臟器功能障礙者。

1.2 方法

對(duì)照組術(shù)后愈合采用復(fù)方骨肽注射液（智同生物制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字H20052314，批號(hào)：22101042）靜脈滴注，每次150 mg溶于250 ml 0.9%氯化鈉注射液中，1次/d。觀察組在對(duì)照組基礎(chǔ)上聯(lián)合口服JGQLC（金沙藥業(yè)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20053999，批號(hào)：211202），2 次 /d，2 片 /次，治療 20 d。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

①臨床療效判定標(biāo)準(zhǔn)[4-5]，治愈：疼痛消失、外形及功能基本恢復(fù)，骨折處愈合良好；顯效：有輕微疼痛，外形及功能恢復(fù)欠佳，臨床癥狀基本好轉(zhuǎn)，骨折處愈合較好；無(wú)效：臨床癥狀仍存在，骨折處畸形或不愈合。總有效率=（治愈+顯效）例數(shù)/總例數(shù)×100%；②檢查骨代謝指標(biāo)，采用羅氏CobasE601系統(tǒng)測(cè)定患者治療前后空腹?fàn)顟B(tài)下血清中鈣、堿性磷酸酶和Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列（β-CTX）指標(biāo)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以 [n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 藥物-疾病間靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及相互作用分析

通過(guò) TCMSP（http: //tcmspw.com/tcmsp.php）及Batman-TCM（http: //bionet.ncpsb.org.cn/batmantcm/）檢索JGQLC活性成分及靶點(diǎn)基因，條件為OB≥ 30%、DL≥ 0.18。經(jīng) DrugBank（https: //go.drugbank.com/）將化合物結(jié)構(gòu)與靶點(diǎn)再次確認(rèn)。利用UniProt（http: //beta.uniprot.org/）檢索，選擇“Homo sapiens”，剔除不符合條件、非人源的靶點(diǎn)，得到JGQLC的基因靶點(diǎn)。通過(guò)Gene Cards（https: //auth.lifemapsc.com/）和 OMIM（https: //www.omim.org/）檢索腰椎骨折基因靶點(diǎn)，Venny 2.1.0軟件獲得交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.6 藥物-靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系及核心靶點(diǎn)篩選

將交集靶點(diǎn)基因復(fù)制到String PPI 11.0軟件，以人為研究對(duì)象，設(shè)置條件為mendium confidence＞0.9，剔除游離蛋白靶點(diǎn)，構(gòu)建蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)。將獲取的所有蛋白利用Cytoscape 3.7.1軟件、CytoNCA插件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯远戎行男裕―C）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC）和特征向量中心性（EC）的值表示重要節(jié)點(diǎn)，值越大，節(jié)點(diǎn)越大，相互作用的靶點(diǎn)就越多，說(shuō)明該網(wǎng)絡(luò)存在關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。輸入關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的參數(shù)值繪制成三線表，再將重要的靶點(diǎn)和化合物導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1中完善顏色并調(diào)整節(jié)點(diǎn)大小構(gòu)建拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 GO功能富集與KEGG通路分析

利用 Bioconductor軟件，借助 clusterprofiler、pathview、Dose包，通過(guò)R語(yǔ)言獲得基因本體及通路富集數(shù)據(jù)并可視化，進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析，獲得JGQLC在腰椎骨折中的關(guān)鍵性通路。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床療效比較

2.1.1 兩組總有效率比較 觀察組總有效率為97.22%，高于對(duì)照組的88.89%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表 1。

表1 兩組總有效率比較[n（%）]

2.1.2 兩組骨代謝指標(biāo)水平比較 治療前兩組鈣、堿性磷酸酶、β-CTX水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。治療后兩組鈣、β-CTX水平高于治療前，堿性磷酸酶水平低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。治療后觀察組鈣水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），觀察組堿性磷酸酶水平低于對(duì)照組，β-CTX水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表 2。

表2 兩組骨代謝指標(biāo)水平比較（）

表2 兩組骨代謝指標(biāo)水平比較（）

注 β-CTX：Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列

組別 n 鈣（mmol/L） 堿性磷酸酶（U/L） β-CTX（ng/ml）治療前 治療后 t值 P值 治療前 治療后 t值 P值 治療前 治療后 t值 P值觀察組 36 2.28±0.102.31±0.094.9080.000 87.72±5.19 67.63±4.37 66.285 0.000 93.49±5.39 130.95±6.56 126.7720.000對(duì)照組 27 2.29±0.092.30±0.078.0390.000 89.37±4.78 71.78±6.18 38.818 0.000 94.02±3.35 126.00±5.20 93.946 0.000 t值 0.391 0.476 2.632 -5.009 1.299 5.247 P值 0.699 0.638 0.098 0.000 0.204 0.000

2.2 藥物-疾病間靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及相互作用分析

共篩選出91個(gè)活性較高成分，大黃16個(gè)、當(dāng)歸2個(gè)、骨碎補(bǔ)18個(gè)、沒(méi)藥39個(gè)、乳香8個(gè)、土鱉蟲(chóng)1個(gè)、血竭6個(gè)、自然銅1個(gè)。通過(guò)Venny 2.1.0軟件獲得藥物-疾病交集靶點(diǎn)216個(gè)，Cytoscape構(gòu)建藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，見(jiàn)圖1。長(zhǎng)方形代表疾病靶點(diǎn)，圓形代表有效成分。數(shù)圖結(jié)合分析的JGQLC針對(duì)腰椎骨折靶點(diǎn)孕酮受體（PGR）、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶1（PTGS1）、重組人視網(wǎng)酸X受體α（RXRA）、雄激素受體（AR）、細(xì)胞色素氧化酶基因（CYP1A1）、雌激素受體1（ESR1）、熱休克蛋白90α家族A類成員 1（HSP90AA1）、白介素 -13（IL-13）、白介素 -1B（IL-1B）、氧化氮合酶（NOS2）等，預(yù)測(cè)JGQLC可能通過(guò)調(diào)控以上基因靶點(diǎn)對(duì)腰椎骨折發(fā)揮治療作用。

圖1 藥物-疾病-靶點(diǎn)關(guān)系圖

2.3 藥物-靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系及核心靶點(diǎn)篩選

將交集基因?qū)隨tring PPI 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，來(lái)源選擇Homo sapiens得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。同時(shí)將交集基因?qū)隒ytoscape 3.7.1軟件，獲得216個(gè)節(jié)點(diǎn)和4158條邊（圖3），設(shè)置條件DC≥29、BC≥66.46、CC≥0.51和EC≥0.04、LAC≥16.74，篩選出標(biāo)黃的75個(gè)靶點(diǎn)，繼續(xù)設(shè)置條件BC≥15.46、CC≥0.74、DC≥48、EC≥0.11、LAC≥37.54，篩選標(biāo)黃的核心靶點(diǎn)31個(gè)。預(yù)測(cè)JGQLC可能通過(guò)以上核心靶點(diǎn)對(duì)腰椎骨折發(fā)揮治療作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、ESR1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、蘇氨酸蛋白激酶 1（Akt1）、長(zhǎng)應(yīng)答蛋白 2（EGR2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）靶點(diǎn)與骨折存在相關(guān)性。

圖2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 篩選核心靶點(diǎn)過(guò)程圖

2.4 GO功能富集和KEGG通路分析

GO-BP共有2900個(gè)條目，設(shè)置P-value＜0.01，取校正P值前10的條目，主要涉及類固醇代謝過(guò)程、抗生素的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)、金屬離子的響應(yīng)、氧化應(yīng)激的反應(yīng)等。GO-CC共有68個(gè)條目，主要涉及質(zhì)膜筏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、核染色質(zhì)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等（圖6）。GO-MF共有173個(gè)條目，主要與脫氧核糖核酸-結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性/特殊的RNA聚合酶Ⅱ、四吡咯結(jié)合、血紅素結(jié)合、類固醇結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性等緊密關(guān)聯(lián)。KEGG通路分析見(jiàn)圖7，主要涉及脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、白介素-17（IL-17）信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通、MAPK信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等。

圖6 GO功能富集分析

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為血循環(huán)于脈中，運(yùn)行不息，濡養(yǎng)全身。骨折后，必傷血，故有“跌打損傷之癥，專從血論”之說(shuō)?；钛铕?，續(xù)筋接骨是腰椎骨折的治療原則，JGQLC以土鱉蟲(chóng)為君藥，破瘀血，續(xù)筋骨，以骨碎補(bǔ)接骨續(xù)筋、活血療傷，當(dāng)歸養(yǎng)血活血，血竭活血散瘀止痛為臣藥，佐以大黃、沒(méi)藥、乳香活血散瘀，自然銅續(xù)筋接骨，硼砂消腫止痛，合眾藥之力，發(fā)揮續(xù)筋接骨療傷、活血止痛之功效。臨床證明，JGQLC對(duì)腰椎骨折有一定的促進(jìn)愈合作用，可減少臨床并發(fā)癥[6]。

通過(guò)臨床與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合的方法探討JGQLC對(duì)腰椎骨折的療效及機(jī)制，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)、核心蛋白以及信號(hào)通路等重要信息。其中多個(gè)靶點(diǎn)、蛋白、信號(hào)通路已有研究證明與骨折存在一定關(guān)系。如通過(guò)調(diào)控雌激素受體α基因（ESR1）PvuII（C/T）和XbaI（A/G）多態(tài)性可降低骨折風(fēng)險(xiǎn)[7]。Jana等[8]發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，可降低老年人的骨折風(fēng)險(xiǎn)。另有研究表明，骨折的愈合與血清因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、胰島素樣生長(zhǎng)因子1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β密切相關(guān)[9-10]。

GO分析顯示，JGQLC治療腰椎骨折主要涉及類固醇代謝過(guò)程、類固醇激素的反應(yīng)、脂多糖的反應(yīng)。吳昊[11]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌脂多糖可激活JAK2/STAT5信號(hào)通路，進(jìn)而干擾成骨細(xì)胞正常的分化功能。王顯威等[12]發(fā)現(xiàn)地塞米松（類固醇藥物）對(duì)大鼠下頜骨折的愈合具有延緩作用。KEGG分析顯示IL-17、AGE-RAGE、PI3K-Akt、MAPK 和腫瘤壞死因子等信號(hào)通路與腰椎骨折密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)激活PI3K-Akt通路可促進(jìn)骨折愈合，激活MAPK通路可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)[13-14]，李文鋒[15]發(fā)現(xiàn)NBD多肽通過(guò)與NEMO結(jié)合改善腫瘤壞死因子對(duì)成骨細(xì)胞的抑制作用。

綜上所述，JGQLC對(duì)腰椎骨折的愈合具有促進(jìn)作用，大數(shù)據(jù)分析提示其作用機(jī)制與多個(gè)信號(hào)通路及核心靶點(diǎn)有關(guān)，為今后進(jìn)一步深入研究提供參考依據(jù)。