氨芐西林和安普霉素對禽源沙門菌的體外聯(lián)合效果和耐藥突變選擇窗的研究

張靖菊 徐飛 劉靜 陳晨 張向陽 李秀波

(國家飼料藥物基準(zhǔn)試驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081)

沙門菌是一種人畜共患病原菌，給國內(nèi)肉雞養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，又因其在肉雞生產(chǎn)鏈上的持續(xù)存而威脅人類的食品安全。目前禽場預(yù)防沙門菌病用抗菌藥，但亂用濫用現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致新抗菌藥研發(fā)的速度遠(yuǎn)不及細(xì)菌發(fā)生耐藥突變的速度，甚至禽場產(chǎn)生的超級耐藥菌順著生產(chǎn)鏈傳播給人類，造成無藥可醫(yī)的嚴(yán)峻局面。為放慢細(xì)菌不斷獲得新耐藥基因的步伐，響應(yīng)國家提倡的獸用抗菌藥減量行動，一些專業(yè)人員提出老藥新用的新思路，其中一種方法就是選擇一些早期研發(fā)的經(jīng)典抗菌藥進(jìn)行聯(lián)合，提高藥效，降低用量，延緩?fù)蛔?。氨芐西林(Ampicillin，AMP)是Ⅰ類細(xì)菌繁殖期殺菌劑，屬于非限制使用級別抗菌藥，主要作用于細(xì)胞壁，干擾肽聚糖的合成，在畜禽細(xì)菌病防治中應(yīng)用廣泛，但其對β-內(nèi)酰胺酶不穩(wěn)定,細(xì)菌易產(chǎn)生耐藥性。安普霉素(Apramycin，APR)是Ⅱ類靜止期殺菌劑，屬于氨基糖苷類藥物，也是動物專用抗生素，其抑菌原理有二，一是作用于核糖體30S亞基，干擾蛋白質(zhì)的正常合成；二是使細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致胞內(nèi)離子、酶類等重要的物質(zhì)丟失，最終引起菌體死亡[1]。理論上，這兩種藥物聯(lián)用會產(chǎn)生不錯的協(xié)同效應(yīng)，但相關(guān)基礎(chǔ)性試驗研究尚未見發(fā)表，其聯(lián)用的合理性有待被證明。

防耐藥突變濃度(mutation preventive concentration，MPC)和耐藥突變選擇窗(mutant selection window,MSW)是Drlica等[2]提出的有關(guān)耐藥突變的新理論。MPC是指防止耐藥性突變菌株增殖所需的最低濃度，MPC理論認(rèn)為當(dāng)藥物濃度大于MIC時，大量敏感菌被殺滅，少量細(xì)菌會因耐藥突變而被選擇性增殖。MSW是指MIC～MPC之間的抗菌藥濃度范圍，MSW理論打破了傳統(tǒng)的MIC理論(即用藥濃度低于MIC時更易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥突變)，認(rèn)為抗菌藥濃度在MSW范圍內(nèi)細(xì)菌才會發(fā)生耐藥突變，該理論已得到諸多體內(nèi)體外試驗的驗證。因此臨床用藥時最好越過MSW，更能避免耐藥突變株的產(chǎn)生，但許多抗菌藥的MSW過大，輕易越過可能會導(dǎo)致動物機(jī)體中毒甚至死亡。María等[3]曾對野生型銅綠假單胞菌進(jìn)行磷霉素與妥布霉素的聯(lián)合用藥研究，發(fā)現(xiàn)這兩種作用機(jī)制不同的藥物可以互相關(guān)閉部分不耐藥菌株的MSW。Xu等[4]也通過3種藥物組合對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)聯(lián)合作用和MSW的研究發(fā)現(xiàn)，有協(xié)同效果且作用機(jī)制不同的聯(lián)合用藥組合能顯著縮小甚至關(guān)閉藥物的MSW。根據(jù)MPC理論，細(xì)菌發(fā)生一次耐藥突變的概率為10-6～10-10，同時發(fā)生兩次突變的概率為10-12～10-16(可視為不發(fā)生)，所以細(xì)菌在兩種不同作用機(jī)制的藥物作用下想要存活就必須同時發(fā)生兩次耐藥突變，這就大大降低了突變發(fā)生的概率。近年來，養(yǎng)殖業(yè)關(guān)于沙門菌對AMP耐藥的報導(dǎo)繁多[5-8]，有理由推測AMP的臨床用藥濃度可能落在了MSW范圍內(nèi)，本研究在進(jìn)行AMP和APR對禽源沙門菌的體外聯(lián)用效果評價的同時，也探索了AMP和APR聯(lián)用能否縮小甚至關(guān)閉AMP對沙門菌的MSW，達(dá)到預(yù)防和延緩耐藥的效果，以期為尋找合理的抗菌藥物減量、增效和預(yù)防耐藥配方提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)；22株禽源沙門菌均源自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所國家飼料藥物基準(zhǔn)試驗室菌庫(2018年自山東、北京地區(qū)采集)。

1.1.2 培養(yǎng)基

MH營養(yǎng)瓊脂、MH營養(yǎng)肉湯、沙門菌鑒別培養(yǎng)基XLT4瓊脂購自青島海博生物公司。

1.1.3 藥品和儀器

氨芐西林(AMP)和安普霉素(APR)購自北京博普欣公司。

1.2 方法

1.2.1 單藥MIC測定-微量肉湯稀釋法

參照2017年CLSI發(fā)布的M100s第27版[9]推薦的操作方法及判定標(biāo)準(zhǔn)(表1)，以大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株，使用微量肉湯稀釋法分別檢測AMP和APR對22株臨床沙門菌的最小抑菌濃度(MIC)。在96孔無菌微孔板上采用倍比稀釋法用生理鹽水將濃度為5120 μg/mL的抗菌藥母液稀釋至合適的梯度范圍，每孔為100 μL藥液+100 μL濃度為105CFU/mL左右的菌懸液，陰性對照為無菌有藥孔，陽性對照為有菌無藥孔。AMP的終濃度范圍為1/8～64 μg/mL，APR的終濃度范圍為1～128 μg/mL。整板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育16～20 h觀察結(jié)果。

表1 藥敏試驗判斷標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Determination criteria of drug sensitivity test

1.2.2 聯(lián)合藥敏試驗-微量肉湯棋盤稀釋法

在兩藥單藥MIC結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計聯(lián)合棋盤，棋盤規(guī)格為8×8，其中每種藥物的終濃度梯度為4MIC、2MIC、1MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC(X MIC表示X倍的原單藥MIC)。用生理鹽水將抗菌藥母液稀釋至所需濃度的抗菌藥工作液，隨后在96孔板每孔中加入兩種抗菌藥液各50 μL和5.0×105CFU/mL的沙門菌菌懸液100 μL，共計200 μL，以不加菌的純?nèi)鉁退幰鹤鳛殛幮詫φ?，整板置?7℃溫箱培養(yǎng)16～20 h觀察結(jié)果，記錄AMP聯(lián)用時的MIC值和APR聯(lián)用時的MIC值。

以部分抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)作為聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果的判斷依據(jù)。FICI=MICAMP聯(lián)合/MICAMP單獨+MICAPR聯(lián)合/MICAPR單獨。FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FICI≤1為相加作用，1＜FICI≤2為無關(guān)作用，F(xiàn)ICI＞2為拮抗作用[10]。

1.2.3 殺菌動力學(xué)試驗-試管法

取臨床菌株BJH8C002(北京某生鮮超市，S.typhimurium)和BJH8P020(北京某生鮮超市，S.thompson)進(jìn)行殺菌動力學(xué)試驗。根據(jù)菌株微量肉湯稀釋法和棋盤法結(jié)果將試驗分為4組：①1MIC濃度的AMP+菌液；②1MIC濃度的APR+菌液；③1/2MIC的AMP+1/2MIC的APR+菌液；④菌液+生理鹽水。(96孔板和試管同時進(jìn)行，設(shè)兩組平行：96孔板每孔加100 μL所需濃度藥液(兩藥聯(lián)用時各藥50 μL)和5.0×105CFU/mL菌液100 μL，并用酶標(biāo)儀進(jìn)行持續(xù)地動力學(xué)監(jiān)測；試管中則加入1 mL 5.0×105CFU/mL菌液和1 mL藥液并置于36℃±1℃恒溫?fù)u床孵育，在1、2、3、4、6、8、10和20 h取每組菌液進(jìn)行菌落計數(shù)。以菌落對數(shù)值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)繪制時間-殺菌曲線。

判斷標(biāo)準(zhǔn)[11]：觀察在孵育的過程中是否在某一或某些時間點出現(xiàn)聯(lián)合用藥菌落計數(shù)對數(shù)值較最有效的單藥組減少≥2 lgCFU/mL的情況，可定義為協(xié)同；2 lgCFU/mL＞減少量＞1 lgCFU/mL，可定義為相加；減少量≤1 lgCFU/mL時定義為無關(guān)；聯(lián)合后增加量≥2 lgCFU/mL時定義為拮抗[12]。

1.2.4 不同加藥順序試驗-微量肉湯棋盤稀釋法

以1.2.2的聯(lián)合藥敏試驗為同時加藥聯(lián)合組，另選擇6株臨床沙門菌以及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌ATCC25922為試驗對象，進(jìn)行AMP和APR不同加藥順序的聯(lián)合藥敏研究，分為①先AMP：先加AMP和菌液，孵育2h后再加APR；②先APR：先加APR和菌液，孵育2h后再加AMP。其余部分和同時藥敏試驗一致，計算FICI，并與同時聯(lián)合藥敏的FICI進(jìn)行比較。

1.2.5 AMP對臨床沙門菌防耐藥突變濃度(MPC)的測定

(1)菌懸液制備 取過夜培養(yǎng)的沙門菌單菌落接種于20 mL MH肉湯中，37℃振蕩過夜培養(yǎng)，離心后重懸于200 mL MH肉湯再振蕩培養(yǎng)4～6 h，菌液濃度可達(dá)約6×109CFU/mL，6000 r/min離心后富集，用生理鹽水將菌液濃度調(diào)至4×1010CFU/mL。

(2)AMP單藥的MPC值測定 用倍比稀釋法配制含AMP的MH瓊脂培養(yǎng)基，2 mL不同濃度的藥液與18 mL滅菌MH瓊脂混勻制成藥物濃度分別為1、2、……、128、256 μg/mL的單藥MH瓊脂培養(yǎng)基。取100μL菌懸液均勻涂布于每個加藥培養(yǎng)基上，每株菌每個濃度3個平板，以保證每株菌每個濃度的總接種量＞1010CFU/mL；37℃恒溫培養(yǎng)，觀察并記錄24、48和72h的細(xì)菌生長情況，以72h無菌落生長的最低藥物濃度為初測MPC值(provisional MPC，MPCpr)。以MPCpr為基準(zhǔn)，線性遞減10%～20%AMP的濃度，配制濃度范圍為MPCpr～1/2MPCpr的含藥平板，以上述方法測定72 h無菌生長的最低藥物濃度，即為精確的MPC值。

(3)AMP與APR聯(lián)用的MPC值測定 兩藥聯(lián)用時，含藥MH瓊脂板中APR的終濃度為其對應(yīng)每株菌的MIC；AMP則以2倍稀釋法從每株菌的1/16MIC稀釋到MPC。兩種藥各1 mL，與18 mL的MH瓊脂均勻混合配制成不同濃度配比組合的含藥培養(yǎng)基，每株菌每個濃度配制3個培養(yǎng)基，用與“1.2.5(2)”項下相同的方法測定AMP+APR聯(lián)合用藥時的MPC。

(4)SI的計算和MSW的判定 根據(jù)AMP單用及AMP+APR聯(lián)用對臨床沙門菌的MIC、MPC值計算SI和MSW，SI=MPC/MIC[13]，且SI≥1有效，MSW為單藥和聯(lián)合各自MIC至MPC之間的范圍。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析方法

使用IBM SPSS Statistics 25對結(jié)果進(jìn)行Shapiro-Wilk檢驗、Wilcoxon符號秩和檢驗及配對t檢驗等統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 單藥和聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果

表2顯示：對AMP和APR聯(lián)用對22株臨床沙門菌的FICI為0.375～1，表現(xiàn)為協(xié)同和相加效果；對表2中兩藥的單藥藥敏試驗組和聯(lián)合藥敏試驗組進(jìn)行配對樣本的Wilcoxon符號秩和檢驗，P＜0.05，有顯著性差異。圖1顯示：兩藥聯(lián)合的協(xié)同率為43.48%，相加率為56.52%，聯(lián)合效果較好。

表2 AMP和APR聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果Tab.2 The results of the combined drug sensitivity test of AMP and APR

2.2 時間-殺菌曲線

圖2顯示：隨著用藥時間的增加，第4小時2株菌的聯(lián)合用藥菌落計數(shù)對數(shù)值較最有效的單藥組分別減少了3.10和1.94 lgCFU/mL，前者表現(xiàn)為協(xié)同作用，后者表現(xiàn)為近似協(xié)同的相加作用。

2.3 不同加藥順序聯(lián)合作用結(jié)果

將表3中的3個試驗組兩兩配對進(jìn)行配對t檢驗，結(jié)果均為P＞0.05，無顯著性差異，因此加藥順序的不同對兩種藥物的聯(lián)合效果無影響。

表3 加藥順序不同的聯(lián)合藥敏試驗的FIC值Tab.3 FIC value of combined drug sensitivity test with different dosing order

2.4 AMP對臨床菌的MPC測定結(jié)果

表4顯示：AMP和APR聯(lián)用使得AMP的防耐藥突變濃度顯著降低，SI值降低為原來的7.7%～40.0%。圖3直觀的表現(xiàn)出AMP和APR聯(lián)用使得AMP對沙門菌的耐藥突變選擇窗范圍顯著縮小。

表4 AMP單用以及和APR聯(lián)用的MPC值和SI值Tab.4 MPC and SI values of AMP alone and in combination with APR

3 討論

3.1 AMP和APR聯(lián)合

繁殖期殺菌劑AMP和靜止期殺菌劑APR是禽場治療和預(yù)防沙門菌病的常用藥物，其聯(lián)合優(yōu)勢在于兩種抗菌藥物的作用機(jī)制不同，多數(shù)情況下繁殖期殺菌劑作用于細(xì)胞壁，靜止期殺菌劑作用于細(xì)胞壁內(nèi)，聯(lián)用時繁殖期殺菌劑破壞細(xì)胞壁可輔助靜止期殺菌劑進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，因此常會出現(xiàn)相加和協(xié)同效應(yīng)[14]。王新等[15]測定了APR與AMP聯(lián)用對金黃色葡萄球菌的體外抗生素后效應(yīng)(PAE)，結(jié)果表明，APR與AMP聯(lián)用對金黃色葡萄球菌的體外PAE呈現(xiàn)相加或協(xié)同作用。一般來說，革蘭陰性菌的細(xì)胞壁肽聚糖(繁殖期殺菌劑的靶點)含量遠(yuǎn)少于革蘭陽性菌，因此很多學(xué)者認(rèn)為繁殖期殺菌劑和靜止期殺菌劑聯(lián)用對革蘭陰性菌并沒有協(xié)同作用[16-17]，但本研究對22株沙門菌進(jìn)行AMP和APR聯(lián)合藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)有明顯的協(xié)同和相加效果，說明聯(lián)合效果較好。為獲得更全面的AMP和APR兩藥聯(lián)合使用對臨床沙門菌的殺菌動力學(xué)信息，又對其中兩株沙門菌進(jìn)行了殺菌動力學(xué)試驗，時間-殺菌曲線顯示出聯(lián)合組的殺菌速率明顯高于單獨用藥組，且至少表現(xiàn)出近似協(xié)同的相加作用。因此推測AMP和APR的聯(lián)合機(jī)制可能并不是或者并不僅僅是常見繁殖期和靜止期殺菌劑的協(xié)同機(jī)制，可能存在其他機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

3.2 不同加藥順序

臨床上為了更好地發(fā)揮聯(lián)合藥效，需考慮到兩藥的半衰期、抗菌機(jī)制等，從而安排合理的給藥順序。細(xì)菌在繁殖期需要大量合成以供分裂的細(xì)胞壁，先在繁殖期加入繁殖期殺菌劑破壞細(xì)胞壁更有利于后加入的靜止期殺菌劑發(fā)揮作用，承曉京等[18]進(jìn)行了阿奇霉素與頭孢噻肟對大腸埃希菌的不同加藥順序的聯(lián)合研究，發(fā)現(xiàn)先使用頭孢噻肟(繁殖期殺菌劑)或同時給藥的體外聯(lián)合效果更好。因此本研究參照時間-殺菌曲線殺菌動力學(xué)結(jié)果對AMP和APR進(jìn)行不同加藥順序的聯(lián)合?？紤]到AMP和APR在雞體內(nèi)的半衰期均為2 h左右[19]，選用的前后加藥間隔時間為2 h，并比較其組間差異。結(jié)果表明不同加藥順序?qū)ι抽T菌的殺菌效果無明顯差異，這與預(yù)期結(jié)果出入較大，同時也從側(cè)面反映了在“3.1”中的猜想，即可能存在非常規(guī)的協(xié)同機(jī)制。

3.3 縮小耐藥突變選擇窗

AMP是時間依賴型抗菌藥(即藥物效果與其在體內(nèi)達(dá)到殺菌效果濃度的時間長短有關(guān))，耐藥突變窗理論對其十分適用，因此本研究測定了AMP對10株臨床菌的MSW，范圍為8～13 μg/mL不等。劉志亮等[19]對10%氨芐西林混懸液在雞體內(nèi)的藥動學(xué)及生物利用度進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，10%氨芐西林的絕對生物利用度為35.27%，而禽場臨床使用的氨芐西林可溶性粉的給藥劑量為35～50 μg/mL，對比本次實驗結(jié)果可以看出，臨床用藥時雞體內(nèi)血藥濃度落在MSW的可能性很大，這也與AMP耐藥突變株增多的報道逐年增加相對應(yīng)[20-22]。接著測定了MIC濃度的APR與AMP聯(lián)用的MPC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅MIC濃度的APR就能顯著縮小甚至關(guān)閉AMP對禽源沙門菌的的MSW?？梢夾PR和AMP聯(lián)用不僅能增加抗菌效果，還能通過增加菌株的選擇性壓力而預(yù)防和延緩耐藥。

3.4 小結(jié)

總體而言，本研究證明了AMP和APR聯(lián)合用藥對禽源沙門菌有顯著的相加和協(xié)同效果，不同的用藥順序?qū)β?lián)合效果無影響，并且能顯著縮小AMP對沙門菌的MSW范圍，同時也對AMP和APR的協(xié)同機(jī)制提出一些猜想。這些初步探索可作為進(jìn)一步研究AMP和APR體內(nèi)聯(lián)合用藥時PK/PD模型的理論依據(jù)，為最終研制出既減少抗菌藥用量又延緩耐藥的復(fù)方制劑提供宏觀研究基礎(chǔ)。