蒙古族藥孟根烏蘇（水銀）燥“協(xié)日烏素”功效的免疫調(diào)節(jié)機制研究進展△

王得慧，王燦，武世奎*，王英澤，王敏杰，王敏，張燕芳

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；

2.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018

在食品和藥品中汞（Hg）元素有嚴格的限量要求[1]，但一些含汞礦物，如朱砂、孟根烏蘇等在傳統(tǒng)醫(yī)藥中可作為藥品使用，并且對一些難治疾病有獨特療效[2]。在蒙古族藥（以下簡稱蒙藥）中，孟根烏蘇及其復(fù)方制劑孟根烏蘇-18 味丸（以下簡稱18 味丸）具有燥“協(xié)日烏素”的獨特功效?！皡f(xié)日烏素”可直譯為黃水病。蒙古族醫(yī)（以下簡稱蒙醫(yī)）認為，黃水病是由黃水失衡、功能紊亂引起的以局部腫脹、疼痛、流黃水、瘙癢為臨床特征的疾病，主要指牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病[3]。18 味丸是含孟根烏蘇復(fù)方制劑中最具代表性的制劑之一，為消除黃水病之良藥[4]。佟海英等[5]對18味丸治療效果進行分析，結(jié)果表明，其治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有效率為90%以上，甚至可達到100%；治療銀屑病有效率達到85%以上，甚至可達到100%。包勒朝魯?shù)萚6]對18 味丸進行長期毒性研究發(fā)現(xiàn)，各組大鼠一般觀察情況、血液學(xué)指標、血液生化指標均無顯著性變化，且一段時間后高劑量組臟器病變情況逐漸恢復(fù)，18 味丸用藥較為安全，且大鼠灌胃給藥基本安全劑量為0.92 g·kg-1（相當(dāng)于臨床擬用劑量的25 倍）。18 味丸中含汞藥物的大量使用及對疾病的確切療效表明，汞元素可能對免疫系統(tǒng)具有一定的調(diào)節(jié)作用[7]。本文從汞元素的形態(tài)和汞在動物個體及細胞水平的免疫調(diào)節(jié)機制等方面進行論述，進一步說明蒙藥孟根烏蘇燥“協(xié)日烏素”的功效及其機制。

1 汞元素形態(tài)

民族藥中的汞元素主要以硫化汞形態(tài)入藥，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、溶解度極低、口服吸收度較差，經(jīng)過復(fù)雜的形態(tài)演化才能以可溶形態(tài)被人體吸收[8]。汞的不同形態(tài)在體內(nèi)的吸收、分布、代謝情況不一樣。汞的可吸收形態(tài)主要包括無機態(tài)、有機化合物態(tài)和生理活性物質(zhì)結(jié)合態(tài)。無機態(tài)的汞主要以游離態(tài)Hg2+和Hg+形式存在，游離態(tài)Hg2+具有較高的化學(xué)活性；有機化合物態(tài)主要為短鏈烷基汞，如甲基汞；生物活性分子常與汞以共價、配位或超分子形式結(jié)合，稱為生理活性物質(zhì)結(jié)合態(tài)。汞在藥物中和體內(nèi)的存在形態(tài)及其協(xié)同和拮抗作用是藥理和毒理研究的基礎(chǔ)[9-10]。Shi等[11]分析了氯化汞（HgCl2）、甲基汞和朱砂安宮丸的神經(jīng)毒性，結(jié)果表明，朱砂安宮丸的神經(jīng)毒性明顯比HgCl2和甲基汞小。Tsoi 等[12]報道，朱砂和雄黃為安宮牛黃丸中神經(jīng)保護的中藥成分，且對短暫性腦缺血、腦損傷大鼠不存在肝腎毒性，但普通砷和汞單獨使用時不僅沒有神經(jīng)保護作用且具神經(jīng)毒性。因此，討論汞的形態(tài)演化過程對汞元素毒性和作用機制研究具有重要意義。

1.1 無機配體對汞的形態(tài)演化的作用

目前，硫化汞的溶解過程研究主要集中在鹽酸和硫化物溶液或含有厭氧微生物的環(huán)境中，這與人體消化道環(huán)境類似，對于研究朱砂、孟根烏蘇等礦物藥的代謝和生物轉(zhuǎn)化具有一定參考意義。Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)，細菌對汞甲基化有很大影響，汞甲基化細菌特別是脫硫弧菌產(chǎn)生的脫硫弧菌胞外聚合物（EPSND132）將大大提高納米微粒汞的甲基化潛力。曾克武等[14]系統(tǒng)研究了朱砂在人體消化道環(huán)境內(nèi)的溶解和形態(tài)轉(zhuǎn)化。結(jié)果顯示，含巰基的氨基酸對朱砂的促溶作用有限，而硫化鈉和鹽酸對朱砂中汞溶出量的影響較大。據(jù)此推測，朱砂在胃腸道中的溶出物可能主要是汞的含硫配合物。此外，Zhou等[15]在模擬腸和胃條件下討論了腸道細菌對朱砂轉(zhuǎn)化形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)朱砂在腸道內(nèi)主要是以硫化汞為溶解成分，具有較好的藥理作用。這些結(jié)果對于解釋民族藥中含汞礦物藥多與硫化物配伍使用，而不能與鹵化物配伍，具有一定的參考價值。

1.2 生物分子配體對汞形態(tài)的作用

生物體內(nèi)，汞與含硫配體、氨基、羧基、咪唑、嘌呤和嘧啶形成配合物，這對于汞形態(tài)的體內(nèi)演化和代謝研究具有重要意義。汞與含硫配體的結(jié)合性最強。汞化合物可同時靶向肽和蛋白質(zhì)中的半胱氨酸（Cys）和硒代半胱氨酸（Sec）殘基[16]。在Stricks等[17]報道了汞與谷胱甘肽（GSH）和Cys配位化合物后，汞與多種氨基酸、多肽、嘌呤、大環(huán)多胺等生物小分子形成穩(wěn)定配合物的情況也相繼報道。由于汞（Ⅱ）-硫醇化合物有很高的熱力學(xué)穩(wěn)定性，汞和Cys、GSH 的結(jié)合常數(shù)遠大于其他配體，但其在生理體系中仍然是不穩(wěn)定的，根據(jù)蛋白質(zhì)的游離基團不同，汞將在酶和其他分子的硫醇基間交換結(jié)合[18]。Cheesman 等[19]研究了汞與GSH、Cys 和青霉胺的結(jié)合形式及其存在壽命。結(jié)果顯示，汞首先與上述配體形成二巰基汞［Hg（SH）2］絡(luò)合物，然后通過1個三巰基汞［Hg（SH）3］形式的絡(luò)合物，硫醇配體在游離汞和［Hg（SH）2］之間迅速交換。2 種配位化合物的平均壽命分別為1.10、0.15 ms。其中與GSH的結(jié)合是人體內(nèi)最主要的結(jié)合形式（圖1）。

圖1 汞的體內(nèi)形態(tài)演化過程

氨基酸可以多種形式與甲基汞配位，包括終端-NH3+、-NH+、-OH、-C（=O）NH2，終端-COO-、-SH、-SCH3，側(cè)鏈-NH3+、-COO-等[20]。Mokrzan等[21]研究了甲基汞以各種配位形態(tài)穿透血腦屏障，發(fā)現(xiàn)甲基汞與L-Cys 形成絡(luò)合物后，通過氨基酸傳輸系統(tǒng)進入腦毛細內(nèi)皮細胞，其血腦屏障的穿透能力較強。其他含硫配體，如L-高半胱氨酸、L-青霉胺、二巰基丁二酸、N-乙酰-L-Cys 和GSH 的結(jié)合物對血腦屏障的穿透能力分別僅有L-Cys 的82%、57%、19%、10%和8%。這為合理選擇含巰基配體，從而減少甲基汞對血腦屏障的穿透提供了依據(jù)。

汞與生物大分子的結(jié)合研究由于缺乏較有力的研究手段而進展甚微，僅有汞與蛋白質(zhì)、DNA 及汞與細胞結(jié)合情況的報道。例如，Vieira等[22]對魚類肝臟組織中的蛋白質(zhì)進行二維聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，發(fā)現(xiàn)含有汞結(jié)合蛋白，并采用石墨爐原子吸收法進行定量分析。Buncel 等[23]發(fā)現(xiàn)，汞可與DNA 的胸苷（Thy）和鳥苷（Guo）以混合配位的形式結(jié)合，穩(wěn)定性次序為Thy-Hg-Thy ＞Guo-Hg-Guo ＞Thy-Hg-Guo，并提出汞作用于DNA 后以Thy-Hg-Thy 內(nèi)鏈螯合的形態(tài)存在。

2 汞在動物個體水平的免疫調(diào)節(jié)機制

2.1 誘導(dǎo)自身免疫系統(tǒng)易感性

通常認為，汞攝入會誘導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生，甚至有研究發(fā)現(xiàn)，通過對正常動物使用含汞化學(xué)物質(zhì)可形成具自身免疫性疾病的動物模型[24]。Hultman等[25]發(fā)現(xiàn)，通過汞誘導(dǎo)的全身性自身免疫性疾病嚴格依賴于T 細胞，特別是輔助性T 細胞，且在停止治療后，汞誘導(dǎo)的抗核抗體水平會維持很長一段時間。為了確定炎性T 細胞和輔助性T 淋巴細胞比例（Th1/Th2）失衡是否能直接導(dǎo)致汞誘導(dǎo)自身免疫易感性，Kono 等[26]用白細胞介素-4（IL-4）和γ-干擾素（INF-γ）基因敲除小鼠研究原型Th2 介導(dǎo)的汞引起自身免疫系統(tǒng)易感性。結(jié)果表明，Th1/Th2失衡并不會直接導(dǎo)致汞誘導(dǎo)自身免疫易感性。Hu等[27]通過研究抗干擾素抗體和汞治療對IL-4 基因敲除小鼠的作用，發(fā)現(xiàn)小鼠的基因類型與汞誘導(dǎo)的自身免疫易感性高度相關(guān)。

2.2 誘導(dǎo)產(chǎn)生自身免疫性疾病或?qū)е虏∏榧又?/h3>

Pamphlett 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，妊娠小鼠在妊娠后期每天暴露于無毒劑量的汞蒸氣中，其新生兒的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞和內(nèi)皮細胞的核膜中可見汞。并發(fā)現(xiàn)汞可誘導(dǎo)自由基形成，增加變性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病率。Caruso 等[29]認為，汞會加劇宿主對微生物或者其他因素的觸發(fā)反應(yīng)。他們將有傳染性的體外抗柯薩奇病毒（CVB3）心臟組織提取物接種在正常Balb/c 小鼠體中，發(fā)現(xiàn)小鼠會出現(xiàn)自身免疫性心肌炎，用低劑量汞處理后疾病的嚴重程度和患病率增加。同樣Penta等[30]采用易感染CVB3的雌性Balb/c小鼠，在感染前每天給予200μg·kg-1HgCl2，連續(xù)處理2周，并于感染6 h后從脾臟和腹膜分離免疫細胞，進行流式細胞術(shù)、基因表達和細胞因子分析。感染35 d 后，對心臟進行免疫細胞浸潤的組織學(xué)檢測。結(jié)果顯示，汞暴露顯著增加自身免疫性心肌炎和心臟免疫性浸潤。在早期6 h的感染后，汞增加了腹膜巨噬細胞的共刺激分子和天然免疫受體的表達。同時，選擇性活化的巨噬細胞基因、精氨酸水平增加，而經(jīng)典活化的巨噬細胞基因、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶不受影響。汞暴露時，腹膜B 細胞上的活性標記物表達降低，而T 細胞不受影響。汞暴露后感染CVB3會導(dǎo)致巨噬細胞招募的趨化因子和活化的細胞因子，如IL-6、趨化因子2（CCL2）、CCL4 水平增加。且汞增加脾臟中促炎介質(zhì)的產(chǎn)生。研究結(jié)果顯示，汞可誘導(dǎo)嚙齒類動物形成自身免疫性疾病模型或?qū)е虏∏榧又亍?/p>

2.3 不同攝入劑量引起的自身免疫系統(tǒng)平衡變化

盡管在動物模型上汞具有免疫毒性，但汞是否也會誘導(dǎo)人類自身免疫疾病這一問題尚不清楚。因此，汞對自身免疫系統(tǒng)的影響需要進一步確認。Hultman等[31]研究了基因敏感雌性SJL/N小鼠的汞攝入劑量與誘導(dǎo)自身免疫疾病和免疫復(fù)合物疾病的關(guān)系。結(jié)果顯示，以平均腎汞濃度（1.25×10-6）的劑量連續(xù)給藥10 周，即可觀察到免疫球蛋白G（IgG）的血清抗核抗體。當(dāng)劑量達到5×10-6時，所有的小鼠均出現(xiàn)IgG的血清抗核抗體，并且IgG和免疫復(fù)合物在腎血管出現(xiàn)沉積，進而引起腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞的增殖和腎小球膜增生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臟器中汞濃度和自身免疫性疾病發(fā)生與攝入劑量是正相關(guān)的。

高劑量的汞具有高毒性，而中低劑量的汞具有免疫調(diào)節(jié)的作用。汞劑量在15 ng·mL-1以上可顯著降低細胞活力（P＜0.05），低劑量對Th1 和Th2 細胞因子的表達有不同的影響，取決于細胞激活途徑。在單克隆抗體MoAb刺激的細胞中，IFN-γ、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-6 的產(chǎn)生會減少。汞劑量分別達到0.150、0.500 μg·mL-1時會增加IL-10 和IL-4，從而顯著降低Th1/Th2 比值。但IFN-γ和IL-10 誘導(dǎo)刺激熱滅活腸炎沙門氏菌HK-SE，會導(dǎo)致Th1/Th2 的比值升高[32]。綜上所述，可以認為低劑量的汞攝入，在無炎癥的情況下，免疫反應(yīng)向Th2 極化，但與沙門氏菌抗原引起的Th1極化反應(yīng)不同。

上述研究表明，攝入劑量和個體差異對由汞刺激引起的Th1/Th2平衡改變有不同的影響，這對理解民族醫(yī)藥中含汞藥材入藥具有重要的實驗和科學(xué)意義。

3 汞在細胞水平的免疫調(diào)節(jié)機制

研究汞在細胞水平上的分子機制可以更好地理解其體內(nèi)作用機制，從而合理利用該藥物。汞離子可以和血漿蛋白的巰基、GSH 和金屬硫蛋白形成巰基化合物[33]。巰基化合物具有許多重要的生理功能，包括維持細胞內(nèi)氧化還原平衡，且含有巰基的GSH和Cys 是體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)。汞的吸收、蓄積和毒性依賴于細胞內(nèi)GSH 水平。因此，研究汞與GSH和Cys相互作用將有助于了解汞免疫調(diào)節(jié)機制。

Becker等[34]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的HgCl2會直接刺激細胞內(nèi)GSH合成，細胞內(nèi)GSH水平與含汞量呈負相關(guān)，暴露于低濃度HgCl2的細胞中GSH 的合成受到刺激較小。Shenker 等[35]發(fā)現(xiàn)，在汞離子濃度高達1250 ng·mL-1時，T細胞的GSH含量減少了近70%；用HgCl2處理的B細胞也顯示出GSH水平下降情況，但當(dāng)暴露于低濃度汞時，細胞內(nèi)GSH 會增加。

與此相反，多數(shù)報道顯示，Hg2+暴露將以時間和劑量依賴的方式耗盡細胞內(nèi)GSH 的儲存量[36]。細胞內(nèi)GSH儲存量耗盡，會導(dǎo)致Th1/Th2細胞比例失衡，引起免疫細胞的Th2 反應(yīng)[37]。硫柳汞暴露于樹突細胞，會導(dǎo)致T 細胞增加Th2 細胞因子IL-5 和IL-13，降低Th1 細胞因子INF-γ[38]。由于硫柳汞在體內(nèi)會迅速分解為Hg2+，因此Hg2+引起的免疫系統(tǒng)內(nèi)GSH 耗盡可能是較強Th2反應(yīng)的潛在原因。

近年來，汞與含巰基化合物的體外活性和結(jié)構(gòu)研究取得了一定的進展。Qiao 等[39]研究發(fā)現(xiàn)，GSH能參與體內(nèi)硒（Se）與汞的代謝，促進低毒汞硒配合物的形成。GSH-Se-Hg 的相克作用機制包括2 個過程：GSH 與汞和Se 競爭性結(jié)合及形成（HgxSey）n（GSH）m復(fù)合物。這一過程解釋了Se 與汞的拮抗作用可以降低汞在生物體內(nèi)的毒性。此外，汞會對細胞造成嚴重損傷，可引起各種亞細胞效應(yīng)。Yuan等[40]以斑馬魚細胞ZF4 作為模型，采用聚集誘導(dǎo)發(fā)射聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針，發(fā)現(xiàn)Hg2+和甲基汞都降低了平均溶酶體pH，具有相反的作用和機制，且Hg2+的影響較大。Ajsuvakova等[41]發(fā)現(xiàn)，汞與Cys的結(jié)合產(chǎn)生了汞的許多毒性反應(yīng)，尤其是對含有游離Cys 殘基的酶和其他蛋白質(zhì)的抑制作用。特別是，汞-巰基可能通過干擾蛋白激酶B/環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白通路（Akt/CREB）、Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1/核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Keap1/Nrf2）信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）和線粒體途徑促進細胞凋亡調(diào)節(jié)。

林秀武等[42]研究表明，甲基汞對紅細胞膜及腦、肝和腎微粒體膜上的總?cè)姿嵯佘眨═-ATP）酶、Mg2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP 酶活性有顯著的抑制作用，同時，甲基汞使細胞膜及腦微粒體膜中巰基含量顯著下降，導(dǎo)致膜的構(gòu)象和功能改變。熒光偏振技術(shù)測定表明，汞使紅細胞膜及腦、肝、腎微粒體膜的流動性降低。高劑量的甲基汞對DNA 修復(fù)能力和合成能力有抑制作用，而低劑量的甲基汞有顯著的刺激作用。上述結(jié)果對揭示含汞礦物藥在細胞水平上的藥效作用有重要參考價值。

4 討論

復(fù)方中藥物成分可能首先與硫化汞形成配合物，促進了汞以低毒的形式溶出，進入體內(nèi)后與巰基化合物快速地進行一系列轉(zhuǎn)化，最終在細胞膜與巰基配體結(jié)合，進入細胞。汞可能通過與GSH 和Cys 作用調(diào)節(jié)免疫細胞的細胞因子水平，誘導(dǎo)Th1/Th2 分型變化，引起了自身免疫調(diào)節(jié)的變化。上述發(fā)現(xiàn)可知，汞的形態(tài)、攝入劑量及個體差異對于免疫機制研究具有重要作用，且汞的形態(tài)演化機制研究對民族藥汞代謝研究具有重要的參考價值。當(dāng)前，自身免疫性疾病的治療主要依靠免疫抑制劑來糾正免疫失調(diào)和抑制變態(tài)反應(yīng)性炎癥，但會造成極大的不良反應(yīng)，如頭痛、抑郁、視覺障礙、敗血癥、急性腎功能衰竭等。蒙醫(yī)研究表明，孟根烏蘇對自身免疫性疾病的治療有積極的效果，且不良反應(yīng)小，故詳細研究蒙藥孟根烏蘇燥“協(xié)日烏素”的治療機制對于闡釋蒙藥用汞的科學(xué)內(nèi)涵具有重要意義。采用蒙醫(yī)藥理論結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)研究結(jié)論進行探索論證，使孟根烏蘇可以發(fā)揮最佳治療效果，合理利用、開發(fā)藥物新劑型，對蒙醫(yī)藥發(fā)展具有極大推動作用。