離子溫度雙敏感型黏膜創(chuàng)面保護(hù)膠性能及黏膜修復(fù)有效性體外評價研究

楊敏一 王涵 曾行，2 孟珠 王春仁

0 引言

中國每年新增食道癌、胃癌、結(jié)腸癌病例約25萬、41萬和37萬，在腫瘤病病例中位居第4位、第2位和第3位[1]。內(nèi)鏡黏膜下切除術(shù)(endoscopic submucosal dissection,ESD)已成為早期腫瘤或癌前病變主要的治療手段，因其微創(chuàng)、可一次性切除病變組織等優(yōu)點，在消化道黏膜病變治療中應(yīng)用越來越多[2]。但是，該方法能夠造成較大的潰瘍創(chuàng)面，又因結(jié)直腸壁肌組織較薄，黏膜下層有豐富的血供等因素，ESD術(shù)后出血、穿孔等病發(fā)率也隨之增高，其中胃部延遲性出血率約4.6%～15.6%[3-4]，穿孔率6.1%～9.6%[5]，并發(fā)癥較高的發(fā)生率阻礙了ESD的廣泛應(yīng)用。人工潰瘍愈合慢，消化道內(nèi)一些物質(zhì)對創(chuàng)傷面的二次傷害是術(shù)后并發(fā)癥的主要原因。因此構(gòu)建一種能夠粘附于創(chuàng)傷表面，阻擋有害物質(zhì)，并能促進(jìn)潰瘍愈合的材料，能夠有效減少ESD術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生，促進(jìn)ESD術(shù)后的推廣使用。聚乙二醇[6]、纖維蛋白膠[7]、聚乙酸補片[8]等可以止血和保護(hù)受傷組織，但是很少有生物材料在防護(hù)的同時還具有促進(jìn)損傷修復(fù)的作用。

理想的生物材料應(yīng)無毒、細(xì)胞相容性良好，在低溫下具有很好的流動性。羥丙甲基纖維素和海藻酸鈉是《中華人民共和國藥典》所列的藥用輔料。海藻酸鈉是一種天然材料，是從天然藻類中提取的由β-D甘露糖醛酸(M)和α-L古洛糖醛酸(G)組成的多糖化合物[9]，在體內(nèi)具有較好的生物相容性[10]和組織黏附性，羥丙甲基纖維素是一種多糖衍生物，具有可逆熱凝膠性質(zhì)，也可用于內(nèi)鏡黏膜下注射[11-12]。本研究引入一種離子溫度雙敏感的凝膠(產(chǎn)品來自杭州英健生物科技有限公司，專利號：202010292915.X，論文中涉及產(chǎn)品內(nèi)容部分已獲專利負(fù)責(zé)人同意)，由膠體液和固定液雙組分組成，膠體液主要是由海藻酸鈉、羥丙基甲基纖維素、泊洛沙姆等材料組成，固定液主要由氯化鈣組成。該凝膠在低溫下為液體狀態(tài)，在生理溫度下轉(zhuǎn)化為凝膠狀。通過對其理化性能和生物學(xué)有效性進(jìn)行研究從而判斷其在ESD術(shù)后修復(fù)的作用。本研究的主要目標(biāo)是開發(fā)一種生物材料，在內(nèi)鏡黏膜剝離中既能解除損傷又能促進(jìn)傷口修復(fù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

掃描電子顯微鏡(Hitachi S-4800)；流變儀(MCR92，安東帕生產(chǎn))；細(xì)胞培養(yǎng)瓶(康寧)；酶標(biāo)儀(Thermo Fisher)；冷凍干燥機(jī)(北京立德泰科技有限公司)；恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher)；細(xì)胞計數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(kokusan H-80R)。

高糖培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium/F12，DMEM,上海源培生物科技股份有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco)；抗生素(Gibco)；Cell Counting Kit-8(CCK-8，日本同仁)；胰酶(Gibco)；CCD 841 CoN 細(xì)胞(廣州吉尼歐生物科技有限公司)。

1.2 樣品制備

取0.5 mL膠體液于培養(yǎng)皿中，加入1 mL固定液，靜置30 min，棄去固定液。

1.3 凝膠物化性能

1.3.1 結(jié)構(gòu)表征

微觀結(jié)構(gòu)：將干燥至恒重的凝膠樣品表面噴金箔，用掃描電子顯微鏡觀察干燥樣品微觀結(jié)構(gòu)[13]。

宏觀結(jié)構(gòu)：取2 mL膠體液于10 mL透明西林瓶中，分別在4 ℃、室溫(25 ℃)及37 ℃靜置15 min，觀察膠體液在不同溫度下的狀態(tài)。

1.3.2 凝膠成膠時間

采用“倒瓶法”觀察樣品在37℃成膠時間[14]。將含有膠體液的透明西林瓶放入37℃恒溫水浴鍋中，每隔30 s取出，瓶口傾斜45°，觀察樣品流動性。若膠體液15 s內(nèi)不流動，將瓶口倒置，樣品不流動則說明樣品已達(dá)凝膠化，實驗重復(fù)3次。

1.3.3 初始成膠溫度

流變儀對凝膠的初始成膠溫度進(jìn)行測定[15]。采用溫度掃描模式，固定頻率1 Hz，應(yīng)變力1%，升溫速率2 ℃/min，掃描溫度范圍：0 ℃～70 ℃。

1.3.4 凝膠溶脹率(swelling rate，SR)

該凝膠屬于生物部分解離材料，在室溫下很難達(dá)到平衡溶脹比，因此采用經(jīng)典的重量法測定凝膠在解離前的最大溶脹比[16]。將干燥至恒重的凝膠稱重并放入24孔板中，加入2 mL生理鹽水，每隔一段時間取出部分凝膠用濾紙吸去表面游離水并稱重，計算凝膠溶脹率。

式中：W為溶脹后凝膠質(zhì)量；W0為初始質(zhì)量。

1.4 黏膜修復(fù)有效性

1.4.1 凝膠浸提液對CCD 841 CoN細(xì)胞增殖的影響

浸提時間對CCD 841 CoN細(xì)胞增殖的影響：用CCK-8法測不同浸提時間浸提液對細(xì)胞增殖的影響[17]。將浸提24 h、48 h、72 h的凝膠浸提液用DMEM培養(yǎng)基稀釋為50%濃度，無血清培養(yǎng)基作為對照，樣品組為浸提不同時間稀釋后的浸提液。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后加入CCK-8溶液，2.5 h后在450 nm處測吸光度，計算細(xì)胞相對增殖率，探究最佳浸提時間。

濃度對CCD 841 CoN細(xì)胞增殖的影響：樣品浸提24 h,以DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照組，實驗組分別為100%組、50%組、25%組、12.5%組、6.25%組，培養(yǎng)不同時間后加入CCK-8溶液，2.5 h后在450 nm處測吸光度，計算細(xì)胞相對增殖率，探究其促進(jìn)細(xì)胞增殖的最佳濃度。

1.4.2 浸提液對細(xì)胞遷移能力的影響

采用細(xì)胞劃痕的方法觀察樣品浸提液對CCD 841 CoN細(xì)胞遷移的影響[18]。細(xì)胞以2×105/mL接種于24孔板中,細(xì)胞融合80%左右后用200 μL槍頭劃痕，加入分組培養(yǎng)液培養(yǎng)。含10%FBS培養(yǎng)基作為陽性對照，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為陰性對照，樣品組為稀釋不同濃度的浸提液，在0 h、12 h、24 h、36 h用倒置熒光顯微鏡拍照，Image J計算劃痕面積并計算細(xì)胞遷移率，從而確定不同濃度浸提液對細(xì)胞遷移能力的影響。

式中：St為th視野中劃痕面積；S0為0 h視野中劃痕面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)表征

掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)(圖1)凝膠表面粗糙，呈波紋狀，分布均勻且保持致密無孔洞結(jié)構(gòu)。波紋狀可能是樣品冷凍干燥后親水區(qū)留下的痕跡。波紋形狀分明但保持均勻表明凝膠中的成分是有序聚集而非溶解不均引起的團(tuán)聚。

圖1 掃描電鏡圖Figure 1 SEM image

該溫敏凝膠主要用于ESD術(shù)后修復(fù)，液體的流動性是評價指標(biāo)之一。從圖2可以看出，凝膠在4℃和室溫下保持液態(tài)且具有較好的流動性，在生理溫度下形成凝膠，方便保存的同時避免反復(fù)凍融。當(dāng)凝膠用于ESD時，需要通過內(nèi)鏡管道送至創(chuàng)面點，常溫下具有很好的流動性，便于凝膠的輸送。在37℃下原位成膠粘附于創(chuàng)面表面，可以精準(zhǔn)定位并阻擋有害物質(zhì)進(jìn)一步損傷創(chuàng)面。

2.2 凝膠成膠時間

凝膠成膠時間結(jié)果如圖3，凝膠在37 ℃靜置1 min，樣品傾斜45°，凝膠流動性較好，隨著時間的延長凝膠開始逐漸凝膠化，在3 min時，凝膠傾斜45°，瓶內(nèi)液體不流動，將瓶口倒置15 s內(nèi)液體未有掛壁現(xiàn)象產(chǎn)生，說明此刻凝膠已完全固化。

圖3 凝膠在37 ℃不同時間凝膠流動性Figure 3 Gel fluidity at 37℃ for different time

2.3 初始成膠溫度

初始化凝膠溫度結(jié)果見圖4。G′和G″分別是儲能模量和損耗模量,儲能模量G′代表與應(yīng)變一致的部分，可以衡量一個循環(huán)中以彈性形式儲存的能量,損耗模量G″代表與應(yīng)變不一致的部分，即黏性部分，表示循環(huán)中損失的能量[19]。隨溫度的升高，G′逐漸增大隨后與G″相交并逐漸超過G″。當(dāng)G″>G′時，樣品處于液體狀態(tài)；當(dāng)G′=G″，樣品由溶膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，此刻的溫度為初始凝膠溫度，在35 ℃左右。當(dāng)G″

圖4 溫敏凝膠在不同溫度下掃描的流變圖Figure 4 Rheological diagram of thermo-sensitive gel at different temperatures

2.4 凝膠體外溶脹實驗

溶脹度是評價水凝膠表征的重要指標(biāo)之一。研究發(fā)現(xiàn)(圖5)，樣品的溶脹度先升高后降低，在24 h達(dá)到最大值238%，而后溶脹度逐漸降低，在48 h后趨于穩(wěn)定，60 h溶脹率降至180%。在溶脹初期，凝膠的吸水溶脹能力大于降解能力，凝膠的溶脹度呈升高趨勢。在24 h時達(dá)到最大值。隨后凝膠解離速率大于溶脹速率，凝膠的溶脹度開始降低。48 h后凝膠的解離速率變緩，吸水溶脹能力和降解能力接近平衡，凝膠的溶脹度逐漸趨于穩(wěn)定。

圖5 樣品在不同時間的溶脹度Figure 5 Swelling of gel at different times

2.5 凝膠浸提液對CCD 841 CoN細(xì)胞增殖的影響

2.5.1 浸提時間對CCD 841 CoN細(xì)胞增殖的影響

如圖6所示，樣品浸提24 h與浸提48 h和72 h相比有顯著性差異(P<0.05)，而浸提48 h和72 h二者之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，凝膠在浸提24 h時，對CCD 841 CoN細(xì)胞的增殖效果最好，因此選用浸提24 h后的浸提液用于后續(xù)實驗。

圖6 凝膠浸提不同時間對細(xì)胞增殖的影響Figure 6 Effect of different extraction time on cell proliferation

2.5.2 濃度對CCD 841 CoN細(xì)胞增殖的影響

用CCK-8法測不同濃度凝膠浸提液對細(xì)胞活性的影響(圖7)。研究發(fā)現(xiàn)，與無血清對照組相比，在培養(yǎng)1 d時，各實驗組無明顯差異(P>0.05)，培養(yǎng)2～3 d時，實驗組細(xì)胞活力相較于對照組明顯增高，其中50%組相較于25%、12.5%、6.25%組在2～3 d均具有顯著差異(P<0.001)，而與100%組相比無明顯變化，由此發(fā)現(xiàn)，凝膠浸提液促進(jìn)CCD 841 CoN細(xì)胞增殖效果的最佳濃度為50%。

圖7 樣品浸提24 h對細(xì)胞增殖影響Figure 7 Effect of gel extraction for 24 h on cell proliferation

2.6 浸提液對細(xì)胞遷移能力的影響

由圖8和圖9可知，培養(yǎng)不同時間對照組和樣品組細(xì)胞遷移率均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；培養(yǎng)24 h時，12.5%組細(xì)胞遷移率達(dá)54.9%，而陰性對照組僅為19.6%；培養(yǎng)36 h,12.5%組細(xì)胞遷移率達(dá)到67.5%，陰性對照組遷移率為27.1%。通過以上研究發(fā)現(xiàn)不同濃度浸提液促進(jìn)細(xì)胞遷移具有濃度依賴性，隨著濃度的升高而降低，浸提液濃度為12.5%時促進(jìn)細(xì)胞遷移效果最好。

圖8 樣品浸提24 h對細(xì)胞遷移影響Figure 8 Effect of gel extraction for 24 h on cell migration

圖9 不同濃度浸提液對CCD 841 CoN細(xì)胞遷移的影響Figure 9 Effects of different concentrations of extracts on CCD 841 CoN cells migration

3 討論

內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)后創(chuàng)面直徑<2 cm，可以使用止血夾關(guān)閉，當(dāng)直徑>2 cm時，目前無任何保護(hù)措施，裸露的創(chuàng)面導(dǎo)致并發(fā)癥發(fā)生率明顯增加，如食道狹窄、出血、穿孔、創(chuàng)面愈合不良，胃腸道出血、穿孔、腹痛、感染等并發(fā)癥。ESD術(shù)后會暴露出較大的創(chuàng)面，當(dāng)黏膜受損嚴(yán)重時，黏膜的保護(hù)力度不足以抵抗攻擊因子的攻擊；當(dāng)機(jī)械力切除黏膜層時，機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激，副交感神經(jīng)-垂體-腎上腺素系統(tǒng)興奮性提高，消化道消化液的分泌增加等都會加重潰瘍的產(chǎn)生[20-21]。目前存在的材料停留在保護(hù)創(chuàng)面損傷方面，尚未出現(xiàn)同時滿足保護(hù)創(chuàng)面和促進(jìn)黏膜愈合的生物材料。因此課題組制備了一種復(fù)合型的材料，并對其理化性能和有效性進(jìn)行研究。離子溫度雙敏型黏膜保護(hù)膠是通過內(nèi)窺針噴灑到創(chuàng)面，因此需要有很好的流動性。根據(jù)對其流變性進(jìn)行研究(圖2、圖3)，發(fā)現(xiàn)該凝膠具有溫度敏感性，低于室溫的溫度時流動性較好。要使凝膠能夠在黏膜剝離后保護(hù)并修復(fù)傷口，水凝膠必須能夠在生理溫度下迅速原位成膠。研究發(fā)現(xiàn)，初始凝膠溫度在35℃左右(圖4)，凝膠內(nèi)部是一個致密結(jié)構(gòu)，它能夠在生理溫度下原位成膠且能夠有效阻擋有害物質(zhì)進(jìn)一步侵襲。作為一種修復(fù)材料，凝膠的吸水溶脹度對細(xì)胞生長也有一定的影響。體外溶脹度實驗表明，該樣品凝膠溶脹度最大值達(dá)到238%，可吸收一定量的浸出液，除此之外具有一定的保濕效果，有利于細(xì)胞的生長。重要的是，該凝膠能夠促進(jìn)CCD 841 CoN細(xì)胞增殖(圖7)和遷移(圖8)。潰瘍產(chǎn)生后修復(fù)效果主要包含兩個方面，其一是受損細(xì)胞脫落，健康未受損的細(xì)胞向受損部位遷移，其二是正常細(xì)胞的增殖，重新建立新的組織結(jié)構(gòu)[22-25]，而該凝膠浸提液在增殖和遷移方面均有很好的效果，因此可以認(rèn)為該凝膠對ESD術(shù)后創(chuàng)面損傷有一定的修復(fù)效果。

4 結(jié)論

離子溫度雙敏感型黏膜保護(hù)膠是一種細(xì)胞相容性較好的高分子生物材料，該凝膠具有很好的低溫流動性且在生理溫度下能迅速原位成膠，制備的水凝膠可滿足消化道傷口治療和修復(fù)的要求。該水凝膠顯示出極好的前景，可以作為一種術(shù)中生物材料，用來解除病變并促進(jìn)ESD的修復(fù)。