深靜脈血栓關鍵基因AP2B1和miRNAs及其相關通路的篩選

祁莎莎 曹鑫 徐寧寧 陳靜

0 引言

深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)是常發(fā)生在下肢深靜脈的血栓栓塞性疾病，在臨床較為常見，起病隱匿，發(fā)病兇險。然而目前診斷DVT的金標準為有創(chuàng)血管顯影，患者接受度低，并且增加術(shù)前緊張度，影響手術(shù)效果。因此及時準確、有效特異地診斷DVT并給予干預措施，在臨床工作中具有重要意義。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一種穩(wěn)定存在于血清中的高度保守的內(nèi)源性非編碼小RNA，含量豐富，且不易被降解，在靜脈血栓栓塞性疾病中起重要作用[1]，其參與到血栓形成的多個環(huán)節(jié)[2]，作為一種新型非侵入性診斷標志物用于血栓性疾病的診斷及預后。越來越多的研究證實，miRNAs參與到DVT的形成發(fā)展中，有研究表明上調(diào)miR-664b-3p表達抑制Caspase-1介導細胞的焦亡，保護血管內(nèi)皮，抑制深靜脈血栓形成[3]；同樣地，在DVT動物模型中發(fā)現(xiàn)miR-5189-3p 與JAG1、Notch1和 Hes1的表達量呈正相關，通過激活Notch信號通路促進內(nèi)皮細胞增殖分化，抑制DVT形成[4]；在混合型 DVT 患者中檢測到miR-374a-5p存在高表達，可增加患者遠期血栓后綜合征的發(fā)生率及嚴重水平[5]。近年來，生物信息學技術(shù)迅速發(fā)展，不僅可以預測靶基因及miRNAs，還可通過在線數(shù)據(jù)庫進行KEGG信號通路富集分析，可以提供潛在精確的生物靶標。鑒于目前對miRNAs參與靜脈血栓形成進展的作用尚處于探索階段，如何精準靶定關鍵基因，得出相應的miRNAs，可為后續(xù)臨床檢測提供快速精確的理論指導。因此，研究組基于GEO數(shù)據(jù)庫對DVT的關鍵基因及其相關miRNAs進行研究，并對其進行信號通路富集分析，以期為臨床診斷深靜脈血栓提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 深靜脈血栓關鍵基因預測

利用GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)在線數(shù)據(jù)庫中GSE17078數(shù)據(jù)集,將數(shù)據(jù)庫收錄的人深靜脈血栓病例分為NC組(正常對照組，27例)及DVT組(實驗組，3例)，篩選其中l(wèi)og2(fold change)>1的差異基因，其中P值最小的作為關鍵基因。

1.2 深靜脈血栓關鍵基因的器官富集分析

分析基因AP2B1在不同器官中的富集程度，通過Networkanalyst(www.networkanalyst.ca)網(wǎng)站對關鍵基因進行器官富集分析。

1.3 深靜脈血栓關鍵基因的miRNA預測

應用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRDB(http://mirdb.org/)及mirTARBASE(http://mirtarbase.cuhk.edu.cn/)在線數(shù)據(jù)庫預測AP2B1基因的miRNAs，并利用Venn圖對DVT關鍵基因的miRNAs取交集。

1.4 深靜脈血栓關鍵基因相關miRNA的信號通路預測

為進行miRNAs的功能分析，通過mirTARBASE在線數(shù)據(jù)庫對AP2B1相關的miRNAs的靶基因進行GO分析和信號通路KEGG富集分析。

1.5 深靜脈血栓關鍵基因AP2B1的PPI網(wǎng)絡構(gòu)建及PPI網(wǎng)絡中基因的GO和KEGG分析

通過STRING網(wǎng)站(https://string-db.org/)對DVT關鍵基因AP2B1進行PPI網(wǎng)絡構(gòu)建，得出與AP2B1基因編碼所對應的蛋白互作圖；并對PPI網(wǎng)絡中的基因進行GO分析、信號通路KEGG富集分析。

1.6 動物實驗驗證AP2B1及miRNA差異表達

利用RT-PCR法檢測DVT組和NC組大鼠的AP2B1及其相關miRNAs的表達量，以驗證生物信息學的預測結(jié)果。

1.6.1 DVT大鼠模型的建立和分組

10只SPF級雄性SD大鼠(年齡 8～12周,體質(zhì)量200～300 g)，購自山東第一醫(yī)科大學動物實驗中心。5只作為NC組，5只用于模型建立作為DVT組。適應性喂養(yǎng)1周后，使用“定量擊打+外部石膏固定”方法建立 DVT 大鼠模型。大鼠俯臥位固定，使用自制定量擊打裝置對雙側(cè)大腿近心端進行能量擊打引起股骨骨折，之后采用石膏固定。DVT組不進行任何治療，造模結(jié)束后對大鼠實施安樂死，取大鼠股靜脈組織進行檢測。

1.6.2 RT-PCR技術(shù)檢測兩組SD大鼠股靜脈組織中AP2B1基因及miRNA的表達量

根據(jù) Trizol 試劑的說明從大鼠股靜脈組織中提取總RNA。引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司設計和合成。使用Prime Script RT試劑盒(AG艾科瑞生物公司)將獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)RT-PCR試劑盒(AG艾科瑞生物公司)的說明，使用 Thermo Quant Studio 5定量 PCR 儀(美國 Thermo公司)對 cDNA 進行實時熒光定量 PCR。通過(2 -ΔΔCt)法計算相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 DVT關鍵基因分析

基于GEO數(shù)據(jù)庫匹配的差異基因分析工具GEO2R，依據(jù)log2(fold change)>1且P<0.05篩選差異基因，根據(jù)P值排序，最小的前10個基因如表1；P值最小的差異基因AP2B1擬定為DVT關鍵基因。差異基因分析的火山圖如圖1所示；關鍵基因AP2B1在每個病例中的表達量如圖2所示。

圖2 GSE17078數(shù)據(jù)集中各樣本的AP2B1的表達量統(tǒng)計Figure 2 Statistics of AP2B1 expression in each sample in GSE17078 data set

表1 排名前十的差異基因Table 1 The top ten differential genes

紅色點代表上調(diào)基因；藍色點代表下調(diào)基因；灰色點代表無顯著差異的基因。圖1 GSE17078差異基因分析火山圖Figure 1 Volcano map of GSE17078

2.2 DVT關鍵基因AP2B1在器官中富集分析

通過NCBI網(wǎng)站可知該基因在不同器官的表達量，發(fā)現(xiàn)其在人腦中表達量最高，如圖3所示；然后通過Networkanalyst網(wǎng)站對AP2B1基因與其他基因在腦中的共表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)海馬體中與AP2B1相互作用的基因數(shù)量最多，并構(gòu)建了該基因在海馬體中的基因共表達網(wǎng)絡，如圖4所示。

圖3 AP2B1基因在不同器官中的表達量Figure 3 Expression of AP2B1 in different organs

圖4 海馬體中與AP2B1基因共表達的基因互作圖Figure 4 Gene interaction map of co-expression with AP2B1 gene in hippocampus

2.3 DVT關鍵基因的miRNA預測結(jié)果

經(jīng)過TargetScan、miRDB及mirTARBASE 3個數(shù)據(jù)庫預測關鍵基因AP2B1的miRNAs，并通過Venn圖取交集后得出概率最大miRNAs分別是hsa-miRNA-4780、hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，如圖5所示。

圖5 miRNA的Venn圖分析Figure 5 Venn diagram analysis of miRNA

2.4 DVT關鍵基因相關的miRNA信號通路預測結(jié)果

通過mirTARBASE數(shù)據(jù)庫分析得出hsa-miRNA-4780相應的信號通路為0，推測其目前研究領域涉及極少，故僅對hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p進行mirTARBASE數(shù)據(jù)庫分析，結(jié)果涉及TGF-β信號通路、細胞周期、RNA運輸、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白加工等51個生物過程，其中顯著富集于TGF-β信號通路、細胞周期及脂肪酸生物合成等16個信號通路中，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，如圖6所示。

圖6 hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p的KEGG通路富集分析熱點圖Figure 6 Hotspots of KEGG pathway enrichment analysis of hsa-miRNA-106b-5p and hsa-miRNA-16-5p

2.5 DVT關鍵基因AP2B1的PPI網(wǎng)絡構(gòu)建及PPI網(wǎng)絡中基因的GO和KEGG分析

通過STRING網(wǎng)站(https://string-db.org/)對關鍵基因AP2B1進行PPI網(wǎng)絡構(gòu)建，PPI構(gòu)建圖分析出AP2B1基因編碼的蛋白質(zhì)與AP1M1等10種蛋白質(zhì)相互作用復雜，在體內(nèi)起著十分重要的作用，如圖7所示；并對PPI網(wǎng)絡進行基因本體論GO分析和信號通路KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)其主要參與的GO過程分為分子功能(molecular function)、生物過程(biological process)和細胞組成(cellular component)3個部分，其中在病毒防御、受體代謝等功能富集顯著，如圖8所示；其參與的KEGG通路為內(nèi)吞作用和內(nèi)分泌相關的鈣離子重吸收等，如圖9所示。

圖7 關鍵基因AP2B1相關蛋白PPI圖Figure 7 PPI map of key gene AP2B1 related proteins

圖8 關鍵基因AP2B1蛋白互作網(wǎng)絡基因的GO分析Figure 8 GO analysis of gene in protein interaction network of AP2B1

圖9 關鍵基因AP2B1蛋白互作網(wǎng)絡基因的KEGG分析Figure 9 KEGG analysis of gene in protein interaction network of AP2B1

2.6 DVT關鍵基因AP2B1及相應miRNA的RT-PCR結(jié)果

經(jīng)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，DVT組大鼠的股靜脈組織中的AP2B1表達量低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；并且DVT組經(jīng)預測得到的3種miRNAs的表達量顯著高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，如圖10所示。

圖10 關鍵基因AP2B1及相應miRNAs的RT-PCR結(jié)果Figure 10 Results of RT-PCR of key gene AP2B1 and related miRNAs

3 討論

DVT在手術(shù)患者中發(fā)生率較高，缺乏創(chuàng)傷小和特異性強的診斷方法。miRNA是天然存在的一種非編碼RNA，可以調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性，參與調(diào)節(jié)多種生物功能[6]，成為最新的研究熱點之一。近年來多項研究表明，miRNA參與血栓形成的多個環(huán)節(jié)，差異表達與DVT的癥狀有很強的相關性[7-8]。研究顯示miRNA可參與調(diào)控血小板的功能[9]；與凝血因子XI、組織因子[10]及纖維蛋白原水平均密切相關，最終導致血栓性疾病的發(fā)生。研究表明利用miRNA作為預測性生物標志物可以應用于血栓性疾病的檢測，其在DVT患者血液的表達存在明顯的表達失調(diào)[11]。DVT患者中miRNA-21的低表達水平與復發(fā)性DVT和血栓后綜合征的增加有關，聯(lián)合現(xiàn)有血栓性指標可提高血栓性疾病的診斷準確性[12]。Thibord等[13]研究提供了有關miRNAs變異性對止血作用的影響的新數(shù)據(jù)，以及支持少數(shù)miRNAs與靜脈血栓形成患者復發(fā)風險相關的新論點，產(chǎn)生了大量與血漿miRNAs和DVT相關的生物學/臨床特征相關的信息，這些信息對于產(chǎn)生和驗證新的假設非常有用。但研究的局限性在于miRNAs參與的信號通路介導的生物過程尚不明確，生物信息學可通過縮小目標范圍，篩選靶基因，預測相應的miRNA及其可能參與的信號轉(zhuǎn)導通路，并利用熒光標記、RT-PCR等實驗技術(shù)進行驗證，才能充分證明其可作為特異性生物標記物。

本研究利用在線數(shù)據(jù)庫得出深靜脈血栓的關鍵基因AP2B1，并預測與其密切相關的miRNAs分別是hsa-miRNA-4780、hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p，旨在探討AP2B1在DVT中的生物學功能，并分析與其相關的miRNAs 在DVT中的改變，探索其作為DVT診斷標志物的可能性。DVT對腦組織的損傷作用是最為嚴重的[14]，本研究結(jié)果顯示AP2B1在腦組織中含量最高，尤其在海馬體中與之相互作用的基因最多，與Koscielny等[15]的研究結(jié)果部分一致。除此之外，數(shù)據(jù)庫分析得出與AP2B1密切相關的hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p其KEGG分析的結(jié)果顯示，主要顯著富集于TGF-β信號通路、細胞周期及脂肪酸生物合成等16個信號通路中。miRNAs可以通過TGF-β信號通路調(diào)控基因的表達并參與腫瘤免疫微環(huán)境[16]；TGF-β信號通路包含miRNA通路，可作為其下游信號級聯(lián)的重要組成部分[17]。因此，研究組推測與DVT密切相關的hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p可通過TGF-β信號通路等信號通路調(diào)控AP2B1的表達，為臨床治療DVT提供新的靶向指導。為預測DVT關鍵基因AP2B1在體內(nèi)的可能作用機制，研究組進一步對AP2B1進行PPI網(wǎng)絡構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)其與AP1M1等10種蛋白質(zhì)存在相互作用，在機體內(nèi)起著重要作用；對其在PPI網(wǎng)絡中互作的基因進行GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)其主要的GO過程為病毒防御、受體代謝等功能；KEGG通路為內(nèi)吞作用、內(nèi)分泌相關的鈣離子重吸收等。據(jù)此研究組推測AP2B1與AP1M1等蛋白質(zhì)相互作用，可能與內(nèi)吞作用等信號通路密切相關，在DVT的形成發(fā)展中發(fā)揮重要作用。已有研究[18]發(fā)現(xiàn)與內(nèi)吞作用相關的AP2B1作為核心生物標記在帕金森病患者的腦脊液中顯著降低，推測功能失調(diào)的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)可能是帕金森病的病理生理機制。最后經(jīng)過動物實驗證實了DVT模型大鼠中AP2B1表達量低于對照組，同時hsa-miRNA-4780、hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p的表達量高于對照組，與本研究預測結(jié)果一致。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究通過生物信息學方法對DVT進行關鍵基因和miRNAs預測，并對其進行GO功能分析、KEGG富集分析，結(jié)果預測hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p可能通過TGF-β等信號通路調(diào)控關鍵基因AP2B1的表達，參與血栓形成的病理生理過程；同時預測出AP2B1與AP1M1等多種蛋白質(zhì)之間存在復雜的相互作用，可能與內(nèi)吞作用等功能有關，為進一步深入研究DVT發(fā)病機制及治療靶點提供新的思路。hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p可作為新型生物診斷標志物，在DVT有效的診斷與治療中具有重要的臨床價值。本研究在預測過程中難以避免存在一定的局限性，還需后續(xù)的生物學實驗證實預測結(jié)果。