貝萊斯芽孢桿菌對煙草白粉病的毒力與防效及對煙草的安全性評價

夏麗娟，梁竟宇，李 靖，許中懷，董雪娟，萬 莉*

(1.四川省農(nóng)藥檢定所，四川 成都 610041；2.四川百事東旺生物科技有限公司，四川 青白江；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌)

煙草白粉病病原菌為二孢白粉菌(ErysiphecichoracearumDC.)，屬子囊菌亞門[1]，為氣傳真菌性病害，二孢白粉菌通過分生孢子產(chǎn)生初生牙管、附著胞，并以吸器從煙草細(xì)胞中獲取營養(yǎng)而導(dǎo)致煙草枯葉、整株枯死、煙葉調(diào)制后缺乏彈性和香氣而導(dǎo)致商品性下降[2]。煙草白粉病寄主廣泛，對煙草生產(chǎn)危害性很強[3]，在中國華南、西南和華中煙區(qū)普遍發(fā)生，發(fā)病株率可達(dá)100%，發(fā)病葉率一般在10%～20%，嚴(yán)重的可達(dá)80%以上[4]。目前生產(chǎn)中防治煙草白粉病主要以三唑類殺菌劑等化學(xué)農(nóng)藥為主[5]。由于長期使用化學(xué)農(nóng)藥，抗性問題日益突出[6]，同時，由于化學(xué)農(nóng)藥的使用不但嚴(yán)重影響煙草的安全性，還會帶來農(nóng)藥殘留超標(biāo)和環(huán)境污染等方面的問題[7]，生物藥劑的開發(fā)使用是解決該問題的有效方法之一。

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)屬于芽孢桿菌屬的一個新種，是一種新型的微生物農(nóng)藥，在促進(jìn)植物生長、抗病蟲害、抗逆境和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗病性方面效果明顯[8-10]；其不易產(chǎn)生抗性、無殘留、對環(huán)境友好[11]，目前已有將貝萊斯芽孢桿菌應(yīng)用到農(nóng)業(yè)病害上的研究，如貝萊斯芽孢桿菌3A3-15對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)抑制率高達(dá)93.2%[12]，貝萊斯芽孢桿菌Y6產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)能夠抑制約60%的真菌孢子萌發(fā)[13]，貝萊斯芽孢桿菌V4能夠產(chǎn)生伊枯草菌素等抗菌物質(zhì)[14]，尚未見貝萊斯芽孢桿菌應(yīng)用于煙草白粉病的研究報道，本文測定并明確了貝萊斯芽孢桿菌對煙草白粉病的室內(nèi)活性、田間防效及對煙草植株的安全性，以期為煙草白粉病生物防治領(lǐng)域的進(jìn)一步研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試菌株和煙草：二孢白粉菌ErysiphecichoracearumDC.由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。煙草品種為紅大、K326、云煙、中川208、烤煙。

試驗藥劑：1 000億孢子/g貝萊斯芽孢桿菌Bacillusvelezensis(CGMCC No.14384)母藥、200億孢子/g貝萊斯芽孢桿菌可溶粒劑；1 000億孢子/g枯草芽孢桿菌B.subtilis母藥；200億孢子/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，吐溫-80(化學(xué)純)；6%嘧啶核苷類抗菌素水劑。

儀器：RXZ-430B人工氣候箱，寧波江南儀器廠；WS-16型背負(fù)式噴霧器，山東衛(wèi)士植保機械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 貝萊斯芽孢桿菌對煙草白粉病菌的室內(nèi)毒力測定 按盆栽法NY/T1156.11-2008測定毒力效果，煙草品種為紅大，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的吐溫-80水溶液將貝萊斯芽孢桿菌母藥和枯草芽孢桿菌母藥分別稀釋為0.1億孢子/mL、0.5億孢子/mL、1億孢子/mL、2億孢子/mL、5億孢子/mL的系列濃度菌液。將上述系列濃度菌液均勻噴施至煙草葉片，使其全部潤濕，每個濃度設(shè)4次重復(fù)，每個重復(fù)5盆煙草，以噴施含有等量0.1%吐溫-80的水溶液為空白對照，自然晾干，備用。將保存的煙草白粉病菌于25℃、12h光照(10000 lx)/12h黑暗交替條件下培養(yǎng)，促使新鮮孢子囊產(chǎn)生，制成濃度為1×105～1×107個/mL的孢子懸浮液。將孢子懸浮液噴霧至藥劑處理后24h的煙草葉面，于(20～24)℃溫度下培養(yǎng)10d，待空白對照組病葉率達(dá)到80%左右時分級調(diào)查各處理的發(fā)病情況，分級標(biāo)準(zhǔn)為：0級，無病斑；1級，病斑面積占葉片面積的5%以下；3級，病斑面積占葉片面積的6%～10%；5級，病斑面積占葉片面積的11%～20%；7級，病斑面積占葉片面積的21%～40%；9級，病斑面積占葉片面積的41%以上。根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)，計算病情指數(shù)和防治效果。病情指數(shù)=[Σ(各級病葉數(shù)×相應(yīng)級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×9)]×100，防治效果=(空白對照病情指數(shù)-藥劑處理病情指數(shù))/空白對照病情指數(shù)×100%。

1.2.2 貝萊斯芽孢桿菌對煙草白粉病的田間防效試驗 參照GB/T17980.30-2000開展田間藥效試驗，兩地分別為山東泰安市泰山區(qū)，煙草品種為中川208，栽種規(guī)格0.5×0.9m，砂壤土；四川崇州市，煙草品種為烤煙，栽種規(guī)格0.5×0.8m，中壤土。均在煙草白粉病發(fā)病期或發(fā)病初期噴霧1次，間隔7d第2次噴霧。試驗共設(shè)置5個處理：200億孢子/g貝萊斯芽孢桿菌可溶粒劑1 500、2 250、3 000g/hm2，6%嘧啶核苷類抗菌素水劑75g a.i./hm2，空白對照。小區(qū)隨機區(qū)組排列，每處理4次重復(fù)，小區(qū)面積30m2，小區(qū)間設(shè)保護(hù)行30cm。第2次藥后7、14d調(diào)查，每小區(qū)4點取樣，每點調(diào)查2株全部葉片，計算病情指數(shù)、防效。病情指數(shù)=[Σ(各級病葉數(shù)×相應(yīng)級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×9)]×100，防效=(1-空白對照施藥前病情指數(shù)×處理施藥后病情指數(shù)/空白對照施藥后病情指數(shù)×處理施藥前病情指數(shù))×100%。

1.2.3 貝萊斯芽孢桿菌對煙草植株的安全性試驗 根據(jù)農(nóng)藥對作物安全性評價準(zhǔn)則NY/T1965.1-2010，采用盆栽法，設(shè)置200億孢子/g貝萊斯芽孢桿菌可溶粒劑田間最高推薦劑量、2倍及4倍最高推薦劑量(3 000、6 000、12 000g/hm2)，在3個煙草品種(紅大、K326、云煙)3～4葉期噴霧，3個煙草品種各設(shè)1個空白對照，每處理30株，每處理4次重復(fù)。待煙草3～4葉期在每個重復(fù)中選取生長相對一致的10株煙草，測量從土表到煙草生長點的高度為株高，計算株高生長速率和株高生長抑制率，株高生長速率(mm/d)=(施藥后植株株高-施藥前植株株高)/施藥前植株株高×施藥前后間隔時間，株高生長抑制率=(空白對照株高生長速率-藥劑處理株高生長速率)/空白對照株高生長速率×100%。噴霧后7、14、21d調(diào)查煙草是否有變色、壞死、萎蔫、畸形、生長停滯等藥害癥狀及受害株數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析 按濃度對數(shù)-防治效果幾率值分析(Bliss)法，采用DPS7.05軟件計算毒力回歸方程、EC50、EC90及95%置信限。用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)的差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌對煙草白粉病菌的毒力 表1結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌對煙草白粉病菌的EC50值為0.322億孢子/mL，EC90值為2.052億孢子/mL，其毒力值是枯草芽孢桿菌對煙草白粉病菌的EC50值的3倍，EC90值的6倍，表現(xiàn)出較高活性。

表1 貝萊斯芽孢桿菌對煙草白粉病菌的室內(nèi)毒力

2.2 貝萊斯芽孢桿菌防治煙草白粉病田間藥效試驗 由表2可知，200億孢子/g貝萊斯芽孢桿菌可溶粒劑1 500、2 250、3 000g/hm2防治煙草白粉病，兩地第2次藥后7、14d防效均隨著貝萊斯芽孢桿菌用量的增加而增加。在山東的田間藥效試驗中，第2次藥后7d，200億孢子/g貝萊斯芽孢桿菌可溶粒劑1 500、2 250g/hm2與對照藥劑6%嘧啶核苷類抗菌素水劑75g a.i./hm2防效相當(dāng)，200億孢子/g貝萊斯芽孢桿菌可溶粒劑3 000g/hm2防效顯著高于對照藥劑。四川的試驗中，第2次藥后14d，200億孢子/g貝萊斯芽孢桿菌可溶粒劑1 500、2 250、3 000g/hm2防效差異顯著，2 250g/hm2與對照藥劑6%嘧啶核苷類抗菌素水劑75g a.i./hm2防效相當(dāng)。

表2 貝萊斯芽孢桿菌防治煙草白粉病田間藥效試驗結(jié)果

2.3 貝萊斯芽孢桿菌對煙草植株的安全性評價 由表3可知，在對3個煙草品種生長抑制作用方面， 200億孢子/g貝萊斯芽孢桿菌可溶粒劑3 000、6 000、12 000g/hm2對紅大的生長抑制率分別為-9.25%、-7.63%、-5.20%，對K26的生長抑制率分別為-8.43%、-7.88%、-5.43%，對云煙的生長抑制率分別為-5.39%、-6.69%、-7.26%，3個劑量對3個煙草品種的生長抑制率均無顯著性差異，對煙草生長有5.20%～9.25%的促進(jìn)作用。藥后7、14、21d調(diào)查，煙草植株生長健康，無藥害癥狀。

表3 貝萊斯芽孢桿菌對3種煙草植株生長的影響

3 結(jié)論與討論

目前生產(chǎn)中防治煙草白粉病仍以化學(xué)農(nóng)藥為主，但長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生的抗藥性、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題日趨嚴(yán)重[3]。生防菌株的研發(fā)與應(yīng)用對防治煙草白粉病具有重要意義，貝萊斯芽孢桿菌具有抗菌譜廣、生長快、易培養(yǎng)、抗逆性強和生物安全性高等優(yōu)點[15-16]，且含有多種菌肽基因組、聚酮類化合物[17-18]，能夠產(chǎn)生拮抗蛋白類的抗菌物質(zhì)，降解細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶，對真菌病原具有良好的拮抗作用[19-20]。

室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌對煙草白粉病菌的EC50值為0.322億孢子/mL，對煙草白粉病菌有較好的抑制效果，顯著優(yōu)于枯草芽孢桿菌。田間藥效試驗中，200億孢子/g貝萊斯芽孢桿菌可溶粒劑1 500、2 250、3 000g/hm2山東第2次藥后7d病指為0.9～1.9，防效為70.63%～82.44%，第2次藥后14d病指上升為1.4～2.7，防效為65.00%～77.45%，四川第2次藥后7d病指為5.1～6.7，防效為72.30%～78.82%，第2次藥后14d病指上升為7.5～9.4，防效控制在70.42%～76.71%，貝萊斯芽孢桿菌防治煙草白粉病持效期較長且防效穩(wěn)定。劉彩云[21]研究表明，噴霧生防菌株LB-1對煙草白粉病防效為44.90%，本文研究結(jié)果貝萊斯芽孢桿菌對煙草白粉病防效>65.00%，防效遠(yuǎn)高于生防菌株LB-1。

已有研究指出，雖然貝萊斯芽孢桿菌作為拮抗益生菌具有巨大的應(yīng)用潛力，但其生物安全評價相關(guān)的研究較少，目前只有貝萊斯芽孢桿菌對動物安全性的報道，還應(yīng)加強貝萊斯芽孢桿菌對應(yīng)用植株的安全性研究[22]。本研究中200億孢子/g貝萊斯芽孢桿菌可溶粒劑田間最高用量3 000g/hm2、田間最高用量2倍量6 000g/hm2、4倍量12 000g/hm2對3種煙草生長抑制率均無顯著性差異，對煙草還有5.20%～9.25%的促進(jìn)生長作用，煙草植株生長健康。

貝萊斯芽孢桿菌的使用可減少煙草白粉病殺菌劑的使用，對煙草白粉病菌抗藥性的減緩有一定作用。考慮到生產(chǎn)實際，可結(jié)合多種措施，如貝萊斯芽孢桿菌與其它卵菌化學(xué)殺菌劑交替使用、與天敵昆蟲或物理防治手段相結(jié)合，以達(dá)到持續(xù)控制煙草白粉病的目的。