基于網(wǎng)絡藥理學探討三子養(yǎng)親湯治療慢性阻塞性肺疾病的作用機制

馬馨蕊 呂曉東 龐立建 劉勇明 梁元鈺

(1 遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽，110847； 2 遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，沈陽，110032)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是一種常見，可預防和可治療的疾病，其特征在于持續(xù)的呼吸道癥狀和氣流受限，這是由于氣道和(或)肺泡異常所致，通常是由于長期暴露于有害顆?；驓怏w所引起，最常見的呼吸系統(tǒng)癥狀包括呼吸困難、咳嗽和(或)咳痰[1]。COPD的高發(fā)病率、高病死率、高致殘率以及所帶來的沉重的疾病負擔，使其成為全球重要的公共衛(wèi)生問題之一[2]。COPD的最主要危險因素為吸煙，除此之外研究發(fā)現(xiàn)還包括室外空氣污染、職業(yè)暴露、呼吸道感染、哮喘和氣道高反應性、結核、肺發(fā)育不良、遺傳因素、貧窮和較低社會經(jīng)濟地位、室內(nèi)生物燃料及人類免疫缺陷病毒感染等危險因素[3]。臨床上可根據(jù)患者病史及臨床表現(xiàn)進行診斷，并通過肺功能檢查以明確診斷。如支氣管擴張劑后第1秒鐘用力呼氣容積(Forced Expiratory Volume in One Second，F(xiàn)EV1)/用力肺活量(Forced Vital Capacity，F(xiàn)VC)<0.70，可確定存在持續(xù)氣流受限[4]。在西醫(yī)治療與預防過程中，因吸煙是COPD首要的危險因素，因此戒煙是其主要的治療和預防方法之一。同時臨床常使用支氣管擴張劑，同時還可應用糖皮質(zhì)激素和祛痰劑[5]。

網(wǎng)絡藥理學提供了一種系統(tǒng)性地尋找中藥復方活性成分和作用靶點的新方式，契合于中藥多成分-多靶點的作用關系，有利于挖掘中藥整體調(diào)控的分子機制[6]。為研究傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代藥理學之間的相互關系搭建了橋梁[7]。本研究是通過運用網(wǎng)絡藥理學的研究方法，通過在數(shù)據(jù)庫中搜索三子養(yǎng)親湯的有效成分和靶點以及COPD相關的基因和蛋白，構建出藥物-靶點-基因三者之間相互關聯(lián)的網(wǎng)絡，對該網(wǎng)絡進行功能富集分析，分析三子養(yǎng)親湯治療COPD的作用機制和作用通路，為其在現(xiàn)代化的研究中提供新方向。

1 資料與方法

1.1 三子養(yǎng)親湯有效成分及對應靶點篩選與預測 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)檢索三子養(yǎng)親湯中紫蘇子、白芥子、萊菔子3味中藥的化學成分的分子信息。檢索過程中，加入口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18 2個篩選條件，篩選出這3味中藥各自的有效成分，并在TCMSP獲取得到中藥有效成分相對應的靶點。

1.2 COPD靶點獲取 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫以“chronic obstructive pulmonary disease”為關鍵詞檢索，選擇物種為“Homo sapiens”，篩選出與COPD疾病相關的基因。

1.3 三子養(yǎng)親湯治療 COPD的靶點預測將三子養(yǎng)親湯有效成分靶點和COPD疾病靶點取交集得出藥物與疾病的共同核心靶點，并繪制韋恩圖。

1.4 網(wǎng)絡圖的構建 首先利用Cytoscape 3.7.0軟件構建三子養(yǎng)親湯有效成分-核心靶點-COPD相關基因的網(wǎng)絡圖，并建立三子養(yǎng)親湯藥物-靶點-COPD相關基因的網(wǎng)絡。將獲取的疾病與成分的共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為homo sapiens，最高置信度設置為0.7，去掉游離在外的節(jié)點，構建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡圖。并對PPI網(wǎng)絡結果進行分析，得到網(wǎng)絡圖中的核心基因。

1.5 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 將藥物與疾病的共同核心靶點轉換為entrezID，對其進行富集分析，包括GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。通過2種富集分析，找出三子養(yǎng)親湯治療COPD的關鍵靶點蛋白和三子養(yǎng)親湯治療COPD的相關重要信號通路。取排名前20的結果。分別以柱狀圖和氣泡圖進行展現(xiàn)。

2 結果

2.1 三子養(yǎng)親湯的有效成分及靶點預測 得到的三子養(yǎng)親湯有效成分共22個，其中包括的有效成分中紫蘇子16個、白芥子3個、萊菔子3個。三子養(yǎng)親湯有效成分靶點預測共得到231個作用靶點,并得到其靶點的symbol。COPD靶點預測結果的5 737個基因。

2.2 COPD靶點預測 收集到COPD的相關基因5 737個。

2.3 三子養(yǎng)親湯有效成分-核心靶點-COPD基因的網(wǎng)絡構建 共有關鍵靶點115個，包括PGR、PTGS2、ADRB2、MAOB、PRSS1、NR3C2、NCOA2、ADH1C、RXRA、NCOA1等。見圖1。

圖1 三子養(yǎng)親湯與COPD靶點的韋恩圖

網(wǎng)絡中紅色菱形代表COPD疾病，黃色代表三子養(yǎng)親湯，藍色三角形為115個共有靶點，天藍色長方形為三子養(yǎng)親湯有效成分，線條為成分與靶點之間相互作用關系。見圖2。

圖2 三子養(yǎng)親湯-有效成分-共同靶點網(wǎng)

2.4 三子養(yǎng)親湯治療COPD的PPI網(wǎng)絡 網(wǎng)絡中節(jié)點數(shù)量115,邊數(shù)606，平均節(jié)點度10.5。調(diào)整最高置信度為0.7，去掉游離的節(jié)點后，其核心靶點數(shù)為107個。見圖3。PPI網(wǎng)絡中心的蛋白質(zhì)顯示其前20個結果包括AKT1、MAPK1、IL6、JUN、CASP3、EGFR、VEGFA、EGF。見表1。

表1 三子養(yǎng)親湯治療COPD的核心靶點

圖3 三子養(yǎng)親湯治療COPD的PPI網(wǎng)絡

2.5 GO功能富集分析與KEGG信號通路富集分析GO功能富集分析 得出了170個相關條目，主要涉及有DNA-binding Transcription Factor Binding(DNA結合轉錄因子結合)、Ubiquitin-like Protein Ligase Binding(泛素樣蛋白連接酶結合)、RNA Polymerase Ⅱ-specific DNA-binding Transcription Factor Binding(RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合)、Ubiquitin Protein Ligase Binding(泛素蛋白連接酶結合)、Amide Binding(酰胺綁定結合)、Endopeptidase Activity(肽鏈內(nèi)切酶活性)等方面。并篩選其主要20個條目。見圖4。KEGG信號通路富集分析結果共得到162個信號通路，由結果分析得到三子養(yǎng)親湯治療COPD主要通過Lipid and Atherosclerosis、PI3K-AKT Signaling Pathway、Human Cytomegalovirus Infection、AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications和Endocrine Resistance等信號通路表達，并通過柱狀圖(圖5)和氣泡圖(圖6)顯示其主要的20個信號通路。參與Lipid and Atherosclerosis信號通路的基因包括MMP1、AKT、PKCα、ERK、IL-6、CD40L等，參與PI3K-AKT信號通路涉及RTK、GF、AKT、GPCR等基因(圖7)。

圖4 三子養(yǎng)親湯治療COPD的GO富集分析氣泡圖

圖5 三子養(yǎng)親湯治療COPD的KEGG信號通路柱狀圖

圖6 三子養(yǎng)親湯治療COPD的KEGG信號通路氣泡圖

圖7 PI3K-AKT信號通路

3 討論

在古代中醫(yī)學中，沒有具體記載慢性阻塞性肺疾病的中醫(yī)命名，現(xiàn)代醫(yī)家主要將其歸屬于“肺脹”“咳嗽”“喘證”“痰飲”等疾病范疇?！胺蚊洝弊钤缬凇饵S帝內(nèi)經(jīng)》中所提出，其中原文記載“肺脹者，滿而喘咳”。有關肺脹的癥狀表現(xiàn)，張仲景在《金匱要略》中提出“咳而上氣，此為肺脹，其人喘，目如脫狀，脈浮大”。現(xiàn)代醫(yī)家總結了肺脹的病因病機，認為痰邪伏肺是肺脹的夙根，本虛標實是該病的主要機制，肺脹多因久病肺虛，復感外邪，引動夙根，使痰濁阻肺，久而化熱，形成痰熱壅肺，進一步演變至肺氣郁滯，腑氣不通，使痰濁閉竅[8]。COPD可分為穩(wěn)定期和發(fā)作期?，F(xiàn)代醫(yī)家在分別對于穩(wěn)定期和發(fā)作期的治療過程中，穩(wěn)定期以肺脾腎三臟氣陽虛衰為主，兼夾標實之證，臨床上以補益肺脾腎為主，辨治時各有偏重，在補虛的同時少佐化痰活血泄實邪等藥物，發(fā)作期時，氣滯、痰濁、血瘀是其主要病理因素，本虛是其主要病機，治療以調(diào)暢氣機，痰瘀并治為主，佐以補虛藥或斂肺藥，中醫(yī)外治療法可應用穴位貼敷、針灸拔罐、穴位注射以及練習八段錦，提高免疫力和改善肺功能[9]。

三子養(yǎng)親湯出自《韓氏醫(yī)通》，是治療COPD的常用的基礎方劑。包括紫蘇子、白芥子、萊菔子3味中藥。紫蘇子，別名蘇子、黑蘇子等，辛，溫。歸肺、脾經(jīng)，有降氣消痰、平喘、潤腸之功效。白芥子，別名辣菜子，辛、溫，歸肺、胃經(jīng)。有溫肺豁痰利氣，通絡止痛的作用。萊菔子，別名蘿卜子、蘆菔子等，辛、甘、平，歸肺、脾、胃經(jīng)?？山禋饣?，消食化積。故3味藥共奏健脾祛濕、降氣化痰、止咳平喘之功效。三子養(yǎng)親湯在現(xiàn)代中醫(yī)中多用于治療支氣管炎、COPD、支氣管哮喘、肺源性心臟病[10]?，F(xiàn)代藥理學研究認為，三子養(yǎng)親湯具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗炎的藥理作用，且白芥子的祛痰作用較紫蘇子強，而紫蘇子的平喘作用較白芥子強，鎮(zhèn)咳則以萊菔子作用最強[11]。3者配伍用藥，更強化其作用效果。王永奇等[12]對紫蘇子的提取物研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇子中水提物、醇提物、醚提物均有一定程度的鎮(zhèn)咳作用，其水提物有明顯的祛痰作用。邱岳等[13]研究得出三子養(yǎng)親湯能改善FVC、FEV1、FEV1占預測值百分比，F(xiàn)EV1/FVC(%)、PaO2、PaCO2、中醫(yī)證候積分等相關指標，提高臨床總有效率。證明其在治療COPD所表現(xiàn)的咳喘、咳痰、肺功能下降等具有極佳的臨床療效。

本研究通過數(shù)據(jù)庫的檢索收集得到COPD的5 737個靶點，提示COPD的產(chǎn)生多由多個靶點共同影響所引起的。用TCMSP篩選出三子養(yǎng)親湯的有效成分共22個，得到其有效成分的231個作用靶點，體現(xiàn)了中藥方劑多味藥、多成分、多靶點、多作用途徑的整體作用特點。與COPD相關基因共有115個共有靶點。通過GO富集分析，提示治療COPD的分子功能和生物過程主要涉及DNA結合轉錄因子結合、泛素樣蛋白連接酶結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、泛素蛋白連接酶結合、酰胺綁定、肽鏈內(nèi)切酶活性等。治療COPD的生物學過程中涉及的最主要核心靶點包括AKT1、MAPK1、IL6、JUN、CASP3、EGFR、VEGFA、EGF、MYC、CCND1等。并通過Lipid and Atherosclerosis(脂質(zhì)和動脈粥樣硬化)、PI3K-AKT Signaling Pathway(PI3K-AKT信號通路)、Human Cytomegalovirus Infection(人巨細胞病毒感染)、AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications(糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路)、Endocrine Resistance(內(nèi)分泌抵抗)等多條通路，起到治療作用。

白細胞介素-6(Interleukin，IL-6)在COPD的發(fā)生發(fā)展過程中起著一定的作用，與COPD的病情嚴重程度有關[14]。IL-6炎癥介質(zhì)增多可導致炎癥反應[15]。王惠欣[16]發(fā)現(xiàn)COPD患者急性加重期和穩(wěn)定期的IL-6表達水平與FEV1/FVC負相關，提示IL-6可以使患者的肺功能下降，使病情進展。童衛(wèi)泉等[17]實驗研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素降低COPD大鼠血管內(nèi)皮生長因子表達水平，能夠抑制氣道重塑，改善COPD。PI3K/AKT信號通路參與了包括細胞凋亡、增殖、侵襲和炎癥的過程[18]。有研究顯示蛋白激酶B是PI3K/AKT信號通路的關鍵蛋白，抑制PI3K/AKT信號通路能有效降低黏液蛋白5AC的表達[19]。黏液蛋白5AC是一個重要的小氣道上皮大分子黏蛋白，參與調(diào)控氣道黏液的分泌[20]。黏液蛋白5B為氣道黏蛋白的重要成分之一，IL-6介導JAK2依賴的自分泌或旁分泌途徑可促進黏液蛋白5B基因的表達，同時還可通過ERK信號轉導通路上調(diào)黏液蛋白5B基因的表達[21]。有研究顯示對小鼠進行動脈粥樣硬化飲食喂養(yǎng)后會出現(xiàn)慢性肺部炎癥反應[22]，提示動脈粥樣硬化可能在COPD的進展中具有一定的影響。這些靶點與靶點、通路與通路以及靶點與通路之間的聯(lián)系，均影響三子養(yǎng)親湯對COPD的治療效果和病情的進展。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學的研究方法，分析方劑對疾病的治療機制，但對于方劑的藥物計量、配伍比例,以及藥物煎煮過程中的化學變化未考慮在內(nèi)，使研究結果存在局限性，有待進一步研究和發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，三子養(yǎng)親湯可通過AKT1、MAPK1、IL6、EGFR、VEGFA、EGF等多個核心靶點于Lipid and atherosclerosis、PI3K-AKT signaling pathway等信號通路中，起到治療COPD的作用。該研究結果為后續(xù)深入研究三子養(yǎng)親湯治療COPD的療效機制提供了基礎資料。