基于網(wǎng)絡藥理學探討三棱-莪術藥對治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用機制

宗春曉 徐 信 謝 偉 劉小麗 薛曉鷗 王 謙 徐 立

(北京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，北京，100010)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis,EMT)指子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質)出現(xiàn)在子宮體以外的部位，臨床癥狀以痛經(jīng)、慢性盆腔痛、月經(jīng)失調、不孕等為主。近年來EMT發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重影響患者的健康及生命質量[1-2]。雖然目前用于治療EMT的藥物種類很多，但存在長期服用不良反應多、停藥后易復發(fā)等弊端。

中醫(yī)藥治療EMT在臨床取得良好療效，具有較好的應用前景。EMT在中醫(yī)學古文獻中無確切病名記載，但根據(jù)其主要臨床癥狀與體征，可歸屬于“痛經(jīng)”“癥瘕積聚”“月經(jīng)不調”“不孕”等范疇。唐容川《血證論》云：“離經(jīng)之血，雖清血鮮血，亦是瘀血?！盓MT患者的異位內(nèi)膜組織隨雌孕激素的變化出現(xiàn)周期性出血，故認為血瘀是貫穿EMT發(fā)生發(fā)展過程的中心環(huán)節(jié)，EMT的基本病機為“瘀血阻滯胞宮、沖任”，因此，活血化瘀是治療EMT的常法[3-4]。

三棱-莪術藥對為活血化瘀最常用的藥對之一，二者配伍使用首見于《經(jīng)驗良方》，屬于相須配伍關系。三棱、莪術皆辛散苦泄，為破血消癥之品，其中三棱性平，破血祛瘀之力較強，莪術性溫，破氣消積之力較強，二者相須為用，共奏破血逐瘀、消癥止痛、行氣散積之功。武梅等[5]關于EMT中醫(yī)用藥規(guī)律的研究表明，三棱-莪術藥對為中醫(yī)藥治療EMT使用最多的藥對。臨床研究報道，三棱-莪術藥對治療EMT取得較好療效，但其作用機制仍有待深入研究[6-8]。網(wǎng)絡藥理學具有整體性和系統(tǒng)性的特點，是研究中藥和疾病復雜關系的有效方法[9]。本研究擬采用網(wǎng)絡藥理學方法，通過篩選三棱-莪術藥對的活性成分和作用靶點，從系統(tǒng)生物學的角度探索三棱-莪術藥對治療EMT的作用機制。

1 資料與方法

1.1 三棱-莪術藥對活性成分的挖掘與篩選 將三棱、莪術兩味中藥分別輸入中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)進行檢索，通過設置口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18 2個篩選條件，得到各自的活性成分。

1.2 三棱-莪術藥對活性成分作用靶點的預測 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取三棱-莪術藥對篩選出的活性成分所對應的潛在靶點信息，通過UniProt(http://www.Uniport.org)數(shù)據(jù)庫中的UniProtKB搜索功能對靶點進行檢索，設置背景為Homo sapiens(人類)，得到所有靶點的official gene symbol，以用于后續(xù)分析。

1.3 EMT靶點的挖掘 GeneCard(http://www.genecards.org)是人類基因的綜合數(shù)據(jù)庫，可提供簡明的基因組學、蛋白質組學、轉錄組學的基因信息。人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)是關于人類基因和遺傳紊亂的數(shù)據(jù)庫，包含所有已知的遺傳病、遺傳決定的性狀及其基因信息。利用GeneCard和OMIM獲得EMT這一疾病的相關治療靶點信息。

1.4 核心靶點篩選及疾病-藥物-活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡的構建 利用韋恩圖在線繪制工具(http://www.bioinformatics.com.cn)繪制三棱-莪術藥對有效活性成分靶點和EMT靶點的韋恩圖，將其交集靶點定義為三棱-莪術藥對治療EMT的核心靶點。利用Cytoscape 3.7.2軟件構建三棱-莪術藥對治療EMT的疾病-藥物-活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡圖。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡構建和分析 將篩選得到的三棱-莪術藥對治療EMT的交集靶點蛋白以gene symbol的形式上傳到String數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)，限定研究物種為Homo sapiens，進行PPI分析，得到PPI網(wǎng)絡。將篩選得到的三棱-莪術藥對治療EMT的34個交集靶點上傳到String數(shù)據(jù)庫進行PPI分析，得到PPI網(wǎng)絡。通過Cytoscape 3.7.2軟件進行網(wǎng)絡構建并繪制按Degree值排序的PPI網(wǎng)絡。在所構建的PPI網(wǎng)絡中，節(jié)點大小和顏色變化反映了Degree值大小，節(jié)點越大、顏色越紅的靶點Degree值越大，在網(wǎng)絡中越處于核心位置。

1.6 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 利用Bioconductor生物信息軟件包(http://www.bioconductor.org)，借助R軟件，首先將基因名字轉化為基因ID，然后設定P≤0.05進行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析，選取P值前20的條目制圖。并利用Cytoscape 3.7.2軟件構建靶點-信號通路網(wǎng)絡圖，進一步說明靶點和信號通路在三棱-莪術藥對治療EMT中的作用。紅色為信號通路，綠色為靶點。

2 結果

2.1 三棱-莪術藥對的活性成分 共得到三棱-莪術藥對的8個活性成分，其中三棱5個，莪術3個。表1為活性成分詳細信息。

表1 三棱-莪術藥對活性成分

2.2 三棱-莪術藥對活性成分靶點預測及EMT靶點挖掘 獲得三棱-莪術藥對活性成分所對應的靶點共77個；檢索GeneCard和OMIM數(shù)據(jù)庫得到1 600個EMT相關靶點。得到34個交集靶點即三棱-莪術藥對治療EMT的核心靶點。見圖1。詳細信息見表2。

圖1 三棱-莪術藥對與EMT交集靶點韋恩圖

表2 三棱-莪術藥對治療EMT相關靶點

2.3 疾病-藥物-活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡的構建 利用Cytoscape 3.7.2軟件構建疾病-藥物-活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡，得到了一個包含42個節(jié)點(Node)和93條邊(Edge)的網(wǎng)絡。見圖2。圖中黃色代表疾病，紅色代表藥物，紫色代表三棱的活性成分，藍色代表三棱莪術共有的活性成分，綠色代表靶點。其中，自由度(Degree)值排名前6的靶點是前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase2,PTGS2)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1(Prostaglandin-endoperoxide Synthase1,PTGS1)、核受體輔激活蛋白2(Nuclear Receptor Coactivator 2,NCOA2)、視黃酸X受體A(Retinoid X Receptor Alpha，RXR-α，RXRA)、孕酮受體(Progesterone Rceptor,PGR)、神經(jīng)元乙酰膽堿受體亞基α-7(Neuronal Acetylcholine Receptor Subunit Alpha-7,CHRNA7)，它們的Degree值分別是6、6、5、4、4、4。

圖2 三棱-莪術藥對治療EMT的疾病-藥物-活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡

2.4 PPI網(wǎng)絡的構建和分析 結果顯示，該網(wǎng)絡含有34個節(jié)點，157條邊，平均節(jié)點Degree值為9.24。見圖3。通過Cytoscape 3.7.2軟件進行網(wǎng)絡構建并繪制按Degree值排序的PPI網(wǎng)絡見圖4。圖5為Degree值排名前30的靶點。PPI網(wǎng)絡中處在核心位置的靶點主要有胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)、原癌基因c-Jun(Proto-oncogene c-Jun,JUN)、PTGS2、雌激素受體(Estrogen Receptor,ESR1)、促分裂原活化的蛋白激酶14(Mitogen-activated Protein Kinase 14,MAPK14)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma,PPARG)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial Nitric Oxide Synthase 3,eNOS3)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性脫乙酰酶沉默信息調節(jié)因子1(Ailence Infor-mation Regulator，sirtuin-1,SIRT1)、雄激素受體(Androgen Receptor,AR)、胱天蛋白酶9(Caspase-9，CASP9)、白細胞介素4(Interleukin-4,IL4)。這些靶點是連接網(wǎng)絡中其他節(jié)點的樞紐，在PPI網(wǎng)絡中起關鍵作用，可能是三棱-莪術藥對治療EMT的重要靶點。

圖3 三棱-莪術藥對治療EMT的PPI網(wǎng)絡

圖4 三棱-莪術藥對治療EMT的PPI網(wǎng)絡(按Degree值排序)

圖5 Degree值排名前30位的三棱-莪術藥對治療EMT的靶點

2.5 GO功能富集分析 GO功能富集分析共得出1 054個生物過程(Biological Process,BP)，涉及對類固醇激素的反應、節(jié)律過程、生殖結構發(fā)育、生殖系統(tǒng)開發(fā)、對雌二醇的反應、對氧氣水平的反應、細胞對類固醇激素刺激的反應、對缺氧的反應、對氧氣水平降低的反應、排卵周期等；22個細胞組分(Cellular Component,CC)，涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、核染色質、線粒體外膜、細胞器外膜、外膜、肥大細胞顆粒、孔復合體、質膜筏等；65個分子功能(Molecular Function,MF)，涉及核受體活性、轉錄因子活性、類固醇激素受體活性、核激素受體結合、激素受體結合、凋亡過程中半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、核受體結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、轉錄共激活因子活性、類固醇結合等。見圖6～7。柱狀圖長度越長則富集基因數(shù)目越多，顏色越紅則富集越顯著；氣泡圖節(jié)點越大則富集基因數(shù)目越多，顏色越紅則富集越顯著。

圖6 三棱-莪術藥對治療EMT的GO功能富集分析柱狀圖

圖7 三棱-莪術藥對治療EMT的GO功能富集分析氣泡圖

2.6 KEGG信號通路富集分析 得到一個包含66個節(jié)點和243條邊的網(wǎng)絡，Degree值最大的靶點主要有JUN、MAPK14、CASP3、BAX、CASP8。圖中紅色為信號通路，綠色為靶點，節(jié)點越大的靶點Degree值越大。見圖8。KEGG通路富集分析共得到91條通路，其共同靶點主要富集于雌激素信號通路、乙肝、弓形蟲病、大腸癌、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、小細胞肺癌、白細胞介素17(Interleukin-17，IL-17)信號通路、糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終產(chǎn)物(Advanced Glycation End Products,AGE)-AGE受體(Receptor of AGE,RAGE)信號通路、多物種凋亡、利什曼病、EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)感染、麻疹、乳腺癌、非酒精性脂肪肝疾病、內(nèi)分泌抵抗、甲狀腺激素信號通路、鉑耐藥、P53信號通路、細胞凋亡等。見圖9。氣泡圖節(jié)點越大則富集基因數(shù)量越多，顏色越紅則富集越顯著。

圖8 三棱-莪術藥對治療EMT的靶點-信號通路網(wǎng)絡

圖9 三棱-莪術藥對治療EMT的KEGG富集分析氣泡圖

3 討論

EMT為婦科常見疾病，近年來發(fā)病率持續(xù)上升，嚴重影響患者的生命質量。西醫(yī)藥物存在不良反應大、停藥后易復發(fā)的弊端。中醫(yī)學認為，異位內(nèi)膜的周期性出血為離經(jīng)之血，屬于“瘀血”的范疇，“瘀血阻滯胞宮、沖任”是EMT的基本病機，血瘀是EMT最基本的病理基礎。趙玉芹[10]關于EMT中醫(yī)證型分布規(guī)律的研究表明,氣滯血瘀證占EMT證型的比例最大，治療以理氣行滯、化瘀止痛為法。三棱-莪術為行氣止痛、活血化瘀的常用藥對，臨床治療EMT取得了良好的療效。張錫純《醫(yī)學衷中參西錄》云：“莪術、三棱性近和平，而以治女子瘀血，雖堅如鐵石亦能徐徐消除，而猛烈開破之品不能建此奇功，此莪術、三棱獨具之良能也。”三棱為血中氣藥，善行氣中之滯；莪術為氣中血藥，善破血中之結。二者相須為用，共奏行氣活血，散瘀消癥之功?，F(xiàn)代藥理研究表明，莪術具有抗血小板聚集、抗血栓的作用，可降低血液黏度，改善血液流變學，且能抗炎鎮(zhèn)痛，抗痛經(jīng)及改善大鼠血清激素水平紊亂[11-14]。三棱具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑制血管生成、抑制血小板聚集及抗血栓作用[15-18]。但三棱-莪術藥對治療EMT的作用機制尚未完全明確，網(wǎng)絡藥理學從多靶點出發(fā)，從分子信息學、分子生物學及現(xiàn)代藥理學的角度對中藥配伍規(guī)律及作用機制進行探究，通過網(wǎng)絡學科語言呈現(xiàn)出中藥多成分、多靶點和多途徑的復雜作用關系，與中醫(yī)整體論治的觀念相一致[19-20]。本研究利用網(wǎng)絡藥理學平臺技術，對三棱-莪術藥對治療EMT的作用機制進行了預測。

本研究借助TCMSP，以OB≥30%、DL≥0.18為篩選條件，共得到三棱-莪術藥對的8個活性成分，通過TCMSP篩選得到77個三棱-莪術藥對活性成分所對應的靶點，檢索GeneCard和OMIM數(shù)據(jù)庫得到1 600個EMT相關靶點，取交集后得到34個三棱-莪術藥對治療EMT的核心靶點。借助Cytoscape軟件構建疾病-藥物-活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡，顯示三棱-莪術藥對具有多成分、多靶點治療EMT的作用特點,其中Degree值排名前6位的靶點為PTGS2、PTGS1、NCOA2、RXRA、PGR、CHRNA7，提示三棱-莪術藥對治療EMT的作用機制涉及炎癥反應、激素調控、免疫調節(jié)等。通過String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件得到PPI網(wǎng)絡圖，提示蛋白之間存在著復雜的聯(lián)系，是一個復雜交互的網(wǎng)絡而非單線作用，因此靶點之間的相互作用調節(jié)可能是三棱-莪術藥對治療EMT的潛在機制之一。篩選出的核心靶點主要有CASP3、JUN、PTGS2、ESR1、MAPK14、PPARG等，其中胱天蛋白酶3屬于胱天蛋白酶蛋白家族成員，位于細胞凋亡有序級聯(lián)反應的下游，是細胞凋亡的關鍵執(zhí)行者，其活化標志著細胞凋亡進入不可逆階段。多項研究已表明，EMT的發(fā)生發(fā)展與子宮內(nèi)膜組織細胞凋亡的失調有關[21-24]。

從GO功能富集分析可知，三棱-莪術藥對治療EMT可影響1 054個生物學過程，65個分子功能和22個細胞組分。主要涉及的生物學過程包括對類固醇激素的反應、節(jié)律過程、生殖結構發(fā)育、生殖系統(tǒng)開發(fā)、對雌二醇的反應、對氧氣水平的反應、細胞對類固醇激素刺激的反應、對缺氧的反應、對氧氣水平降低的反應、排卵周期等，多生物學過程與代謝通路為深入探討三棱-莪術藥對治療EMT的作用機制提供了科學依據(jù)。

從KEGG富集分析結果可知，三棱-莪術藥對治療EMT所涉及的通路主要有雌激素信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、甲狀腺激素信號通路、P53信號通路等，通路上所含靶點越多則該通路發(fā)揮作用的可能性越大。EMT是雌激素依賴性疾病，局部高水平的雌激素是EMT發(fā)生的關鍵。EMT患者的雌激素受體1表達升高，刺激異位內(nèi)膜生長，而異位病灶又能持續(xù)合成雌激素。雌激素可激活MAPK、WNT、核因子κB、PI3K-AKT、Notch等信號通路，調控上皮孕激素受體、凋亡調節(jié)劑B細胞淋巴瘤-2等的表達，參與EMT的發(fā)生發(fā)展[25-28]。研究表明，EMT異位病灶的炎癥反應是影響其發(fā)生發(fā)展的重要因素，IL-17是一種炎癥介質，可以激活核因子κB、MAPK等信號通路，上調IL4、環(huán)氧合酶2等的表達，促進炎癥反應[29-30]。近年來研究發(fā)現(xiàn),AGE-RAGE信號通路中的晚期糖基化終產(chǎn)物受體在EMT患者異位內(nèi)膜細胞中過表達[31]。本研究結果表明，RAGE可與多種配體結合，激活PI3K-AKT、Jak-STAT、MAPK信號通路及鈣離子信號通路等，促進胱天蛋白酶3、白細胞介素1、白細胞介素6等因子的表達，誘導細胞凋亡、促進炎癥反應，從而促進EMT的發(fā)展。EMT與甲狀腺激素通路有關。研究表明，甲狀腺刺激激素在EMT患者和對照組患者的子宮內(nèi)膜中均起著增生和氧化性激素的作用，而三碘甲狀腺素和甲狀腺素則可以特異性地增加異位子宮內(nèi)膜細胞的增殖和活性氧的產(chǎn)生。動物實驗研究證實，當小鼠甲狀腺激素增加時，其子宮內(nèi)膜異位植入物會增大[32]。P53是一種腫瘤抑制基因，參與細胞周期調控、DNA修復、細胞凋亡等重要的生物學過程。臨床研究報道，80%以上的EMT惡變患者P53蛋白過度表達，而其在正常子宮內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中很少表達,提示P53基因突變在EMT惡變中起重要作用[33]。

綜上所述，三棱-莪術藥對治療EMT具有多靶點、多途徑、多通路的特點，其主要作用可能與雌激素信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、甲狀腺激素信號通路、P53信號通路等有關。本研究基于網(wǎng)絡藥理學，初步闡述了三棱-莪術藥對治療EMT的潛在靶點和信號通路，為進一步深入研究三棱-莪術藥對治療EMT的作用機制奠定了基礎。但由于中藥相互作用的復雜性及網(wǎng)絡藥理學本身所具有的局限性，本研究所得結果可能存在一定的偏差，仍有待進一步驗證。