基于電流體加工技術(shù)對益生菌包封作用研究進(jìn)展

劉凱龍， 姚國強， 張和平*

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018； 2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018； 3. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

益生菌是指攝入足夠數(shù)量會對宿主健康產(chǎn)生確切健康功效從而促進(jìn)宿主微生態(tài)平衡、充分發(fā)揮有益作用的微生物總稱[1]。 其對人體健康發(fā)揮有益作用的重要條件是可活著到達(dá)腸道[2]，活性益生菌具有維持腸道菌群平衡、促進(jìn)人體消化吸收、抑制病原菌生長、提高免疫、防止胃腸道疾病等功能[3-4]。然而， 益生菌在胃腸道傳遞和加工貯藏過程中，溫度、濕度、氧氣、胃酸、膽汁鹽和消化酶等是導(dǎo)致其活性下降的主要因素，嚴(yán)重制約了益生菌終端產(chǎn)品的應(yīng)用開發(fā)及其保健作用的發(fā)揮[5]。 為此，提高益生菌生產(chǎn)制備工藝，成為了首要解決的問題，乳化包埋技術(shù)和微膠囊化處理技術(shù)成為益生菌加工行業(yè)關(guān)注的重點。 通過該技術(shù)制備的益生菌產(chǎn)品存活率較高、具有良好的貯藏穩(wěn)定性且對不良環(huán)境的抵抗力強。 微膠囊制備技術(shù)一般采用蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)等大分子物質(zhì)，并結(jié)合噴霧干燥技術(shù)、冷凍干燥技術(shù)、低溫噴霧干燥技術(shù)、擠壓和乳化等技術(shù)形成微凝膠組裝體，以期提高益生菌在加工儲運期間的存活率。

1934 年Formhals 首次提出電流體加工技術(shù)是一種生產(chǎn)納米纖維的通用技術(shù)，其直徑范圍在微米至納米之間[6]，具有制備工序簡單、制備的納米纖維比表面積大、可有效對生物活性物質(zhì)進(jìn)行包埋等優(yōu)點。 電流體加工技術(shù)憑借其獨特的優(yōu)勢，直至20 世紀(jì)90 年代已逐步應(yīng)用于組織工程、儲能轉(zhuǎn)換、食品包裝、藥物輸送及釋放，以及催化劑、傳感器、過濾材料等各個領(lǐng)域[7-9]。 隨著益生菌在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，基于電流體加工技術(shù)對益生菌的封裝研究也不斷增加，其主要原因是該加工工藝在不需要熱量的情況下便可進(jìn)行封裝， 對益生菌菌體活性損傷小，可有效提高菌體存活率。 目前，國內(nèi)關(guān)于電流體加工技術(shù)應(yīng)用于包封益生菌的相關(guān)綜述較少，因此作者重點論述了電流體加工技術(shù)的相關(guān)內(nèi)容及其對益生菌包封的研究進(jìn)展，簡要介紹了電流體加工技術(shù)的相關(guān)參數(shù)，重點討論了電流體加工工藝和納米纖維結(jié)構(gòu)對益生菌菌體活性的影響，以及納米纖維技術(shù)在益生菌加工過程中的潛在應(yīng)用前景，以期為更多的研究提供思路。

1 電流體動力學(xué)

電流體動力學(xué) （electrohydrodynamics，EHD）是多相流體力學(xué)、電動力學(xué)以及微流動學(xué)等的交叉學(xué)科，是液滴在電荷相互作用下，呈現(xiàn)出定向運動、變形、凝聚擴散等特性。 目前許多研究學(xué)者對液滴的運動特性進(jìn)行了大量研究。 在20 世紀(jì)80 年代，有研究者通過對電場中液滴的運動分布、速度以及軌跡進(jìn)行測試，初步了解了液滴的動力學(xué)過程，并獲得液滴動力學(xué)經(jīng)驗方程，具體是以液滴運動過程中空氣阻力和電場力二者建立的，雖描述了液滴在電場中的運動， 但方程中并未考慮液滴間的庫倫斥力[10]。隨后，Hartman 等在此基礎(chǔ)上納入庫倫斥力，完善了液滴運動方程，建立了液滴在電場中的群運動方程，一定程度上揭示了液滴間的相互作用對液滴運動軌跡的影響[11]，但由于其外加電場是由電量不同的點電荷組成的， 故不具有普遍性。 2010 年，Khalid 對液滴的生成進(jìn)行了數(shù)值模擬， 其涉及到液滴初始形成階段的運動[12]，但缺少對液滴后續(xù)運動的模擬；而Hume 等提出的運動方程，包括阻力、重力、浮力以及電場力，且對液滴的后續(xù)運動進(jìn)行了模擬[13]，但只是單個液滴的一維運動，模擬計算時液滴的初速度和位置也是假設(shè)的，因此尚未形成完整的液滴動力學(xué)方程。 近年來，眾多的研究學(xué)者對液滴的運動特性不斷地試驗和模擬， 將液滴的尺寸、電荷分布、液滴之間的相互作用、外加電場力、重力等納入液滴運動模型中，初步建立了電流體動力學(xué)的基本方程。 目前利用液滴的運動特性，可滿足一切適用于電流體的工業(yè)需求，但要對液滴運動實現(xiàn)精準(zhǔn)控制，獲得最佳的霧化效果和沉積特性，還需研究者做大量模擬運算。

靜電紡絲和靜電噴霧是生產(chǎn)納米到微米材料纖維和顆粒的通用電流體動力學(xué)技術(shù)，該加工技術(shù)可用于包封生物活性物質(zhì)，如微量營養(yǎng)素、營養(yǎng)保健品、益生菌等，其目的是保護(hù)活性物質(zhì)免受不良環(huán)境因素（光、氧氣、水分、酸等）的影響，且保證與基質(zhì)中的其他成分不發(fā)生相互作用。 包封所用的生物活性劑，通常由一種或多種聚合物組成，其對于確保生物活性物質(zhì)順利抵達(dá)人體體內(nèi)起著不可替代的作用。 此外，電流體動力學(xué)過程是非熱的，有利于對熱不穩(wěn)定的營養(yǎng)保健品和成分進(jìn)行封裝。

靜電紡絲和靜電噴霧可以被認(rèn)為是復(fù)雜纖維和顆粒的“自下而上”的一種組裝技術(shù)。 為滿足生產(chǎn)要求，其必須依賴于聚合物、溶劑和其他基本成分之間的相互作用，通過控制溶液特性（濃度、黏度、表面張力、電導(dǎo)率和電流體動力學(xué)加工條件），從而實現(xiàn)生產(chǎn)直徑從數(shù)百納米到數(shù)十微米的纖維和顆粒。

2 電流體益生菌加工技術(shù)

目前，用于益生菌的包封主要采用擠壓、乳化、噴霧干燥、冷凍干燥等方法[14]。擠壓法制備的微膠囊粒徑大，均勻性差；乳化法通常需要使用植物油，致使形成的膠囊大小和形狀發(fā)生變化，且對包封壁材要求較高； 噴霧干燥是指菌液通過噴霧干燥系統(tǒng)，分散在熱空氣中，菌液迅速失水形成固體粉末的過程[15]，此過程制粉迅速且用時較短，生產(chǎn)成本低，但由于熱存在，對細(xì)胞活力損傷較大[16]；冷凍干燥是在真空條件下，將冰升華至水蒸氣，以除去菌液中的水蒸氣而形成的凍干菌粉[17]，與其他方法相比，此方法對于細(xì)胞的熱損傷最小，因此制得的益生菌發(fā)酵劑活菌數(shù)相對較高、活性較好，但其成本較高且在冷凍過程中，因冰晶的形成也同樣會使菌體細(xì)胞受到不同程度的損傷[18]。近年來，隨著電流體動力學(xué)的發(fā)展，基于靜電紡絲和靜電噴霧等電流體動力學(xué)加工技術(shù)制備益生菌發(fā)酵劑具有技術(shù)簡單、 條件溫和、包埋率高、粒徑均勻等優(yōu)點，逐步成為封裝益生菌的新型技術(shù)。

2.1 靜電紡絲

靜電紡絲是一種電液滴動力學(xué)過程，將液滴在電荷作用下形成的微射流，經(jīng)機械拉伸、伸長以及干燥步驟固化成纖維并吸附到接收板上的技術(shù)，制造出連續(xù)的聚合物纖維，其直徑從納米級至微米級不等[19]。 靜電紡絲設(shè)備有多種類型[20]，根據(jù)接收裝置可分為平板式、 滾筒式以及多電極式靜電紡絲；根據(jù)針頭類型可分為單軸式、同軸式、三軸式和多針頭式靜電紡絲；根據(jù)包埋生物活性物質(zhì)方式可分為單軸共混式、同軸式和乳液式靜電紡絲等。

靜電紡絲裝置由注射器推注泵、噴絲裝置、高壓供電裝置和收集器組成，靜電紡絲的基本裝置如圖1 所示。 在靜電紡絲過程中，聚合物溶液被泵吸入電噴絲板，使液滴帶電，由于液滴表面電荷之間的靜電排斥作用， 致使表面斥力大于表面張力，液滴呈現(xiàn)出圓錐結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生泰勒錐[21]，射流最初是直線延伸， 后由于彎曲不穩(wěn)定而劇烈地進(jìn)行鞭打運動，當(dāng)射流被拉伸到更細(xì)的直徑時，迅速固化，從而導(dǎo)致固體纖維沉積在接地收集器上[22]。

圖1 靜電紡絲的基本裝置示意圖[22]Fig. 1 Schematic diagram of basic device of electrospinning[22]

通常靜電紡絲過程可分為4 個連續(xù)步驟：1）液滴的充注以及泰勒錐射流的產(chǎn)生；2）帶電射流沿線擴散、細(xì)化和劈裂；3）電場作用下，帶電射流變薄致使溶劑快速揮發(fā)；4）在集電極板處產(chǎn)生分布均勻的納米纖維。

靜電紡絲對益生菌活力的影響一直是研究熱點，有研究者以聚乙烯醇為包封材料，利用靜電紡絲技術(shù)將乳雙歧桿菌Bb-12 包封在“核-殼”結(jié)構(gòu)的納米纖維中， 得到平均直徑為150 nm 的電紡絲纖維，其在室溫下貯藏40 d 和4 ℃下貯藏130 d，纖維中益生菌的存活率顯著高于未包埋的益生菌（P＜0.05）[23]，這項研究初步表明靜電紡絲技術(shù)是一種包封益生菌的可行技術(shù)。 將益生菌利用靜電紡絲技術(shù)封裝在納米纖維中，以提高其在加工、貯藏期間菌體存活率及活力的研究也因此不斷增加。 但在紡絲過程中，影響纖維形態(tài)與納米纖維成形效果的參數(shù)通常分為3 類，即聚合物溶液的理化特性、加工條件和環(huán)境參數(shù)[24]，適當(dāng)?shù)恼{(diào)控上述參數(shù)，才可獲得所需形態(tài)的納米纖維材料。 以上3 類因素共同決定著納米纖維的成形效果，進(jìn)而影響包封益生菌菌體的活性。

2.1.1溶液參數(shù) 聚合物溶液的物理化學(xué)特性對纖維的形成至關(guān)重要，例如相對分子質(zhì)量、濃度、電導(dǎo)率、溶劑特性、黏度系數(shù)等[25]。在靜電紡絲過程中，為保證形成纖維的連續(xù)性，聚合物溶液的濃度一定要適中。 通常情況下，靜電紡絲納米纖維是由高濃度的聚合物溶液組成。 聚合物濃度太低，在靜電紡絲過程中會形成納米液滴，不能呈纖維狀態(tài)；中等濃度的聚合物溶液中， 分子鏈仍因糾纏度不足，無法形成連續(xù)纖維；而高濃度的聚合物溶液，分子鏈糾纏度高，穩(wěn)定了聚合物的射流，避免聚合物沿射流纖維成珠或破裂，能夠形成結(jié)構(gòu)良好的紡絲纖維[26]。 在Yilmaz 等研究中發(fā)現(xiàn)與聚乙烯醇納米纖維中包裹的細(xì)菌相比，海藻酸鈉/聚乙烯醇包裹的細(xì)菌具有更高的存活率[27]，這可能是由于聚乙烯醇的羥基和海藻酸鈉的氨基之間形成了分子間氫鍵，導(dǎo)致纖維的微觀結(jié)構(gòu)高度致密。 因此，聚合物溶液的性質(zhì)直接決定著被包封益生菌菌體的活性大小。

此外，靜電紡絲溶液中的一些添加劑可有效保護(hù)包封的菌體。Salalha 等在包封大腸桿菌時發(fā)現(xiàn)在紡絲溶液中添加適量的甘油， 可避免其快速脫水，從而保證菌體的形態(tài)和存活率[28]。也有報道表明，在紡絲溶液中添加益生元（低聚果糖等）或某些凍干保護(hù)劑（海藻糖、菊粉等），同樣可提高紡絲化益生菌活力。

有研究者將10種不同的乳酸菌封裝在聚環(huán)氧乙烷納米纖維中，發(fā)現(xiàn)其活性的喪失與細(xì)菌細(xì)胞的親水性有關(guān)，親水性細(xì)菌活性更易降低[29]，這表明細(xì)菌表面的疏水分子（胞外多糖等）在并入納米纖維的過程中能夠為細(xì)菌提供更好的保護(hù)。 研究表明，多糖是由糖苷鍵連接的單糖重復(fù)單元建立的大分子[30]，具有增強細(xì)菌細(xì)胞的表面黏附性、抗生物膜、抗氧化劑、抗腫瘤和免疫刺激活性，并保護(hù)其免受重金屬的影響等功能， 具有良好的生物相容性、黏度和乳化穩(wěn)定性，利于菌體更好地減少胃酸和膽鹽的損害，因此被應(yīng)用于電流體加工技術(shù)中。 此外，生產(chǎn)納米纖維的聚合物溶液的溶劑應(yīng)具有揮發(fā)性、互溶性和一定沸點等理化特性。 溶劑揮發(fā)性較低，雖未對介質(zhì)破壞，但易形成濕纖維；反之，揮發(fā)度太高時，聚合物射流更易凝固，纖維很難形成。 Rieger 等研究表明含不同濃度肉桂醛的殼聚糖/聚環(huán)氧乙烷水溶液隨著聚合物含量增加，納米纖維形態(tài)逐步由初始的珠串狀變?yōu)閳A柱形，證實了高相對分子質(zhì)量決定了納米纖維的結(jié)構(gòu)形態(tài)[31]。同時，隨著聚合物溶液電導(dǎo)率的增加，其納米纖維直徑會變小且分布均勻[32]。

2.1.2工藝參數(shù) 在靜電紡絲過程中，工藝參數(shù)會直接影響纖維的特性，如兩個電極間的電壓、聚合物溶液噴出的速度、 噴絲嘴和收集器間的距離等。施加的電壓對纖維形態(tài)具有重要影響， 一般來說，當(dāng)紡絲電壓較低時，電場力無法克服溶液本身的表面張力，從而阻礙了本身拉伸和分裂，導(dǎo)致形成的纖維直徑較大；反之，電場強度越大，聚合物溶液的射流易發(fā)生拉伸和分裂，會形成直徑較小的納米纖維。Larrondo 等研究發(fā)現(xiàn)增加電場強度，會使射流靜電排斥力增加，從而形成的纖維直徑較小[33]。

?krlec 等通過研究電壓對植物乳桿菌ATCC8014 的影響，發(fā)現(xiàn)電壓在15 kV 時，菌體存活率最高，當(dāng)電壓增加到20 kV（減少2.03 lg（CFU/mL））或減少到10 kV（減少1.30 lg（CFU/mL））時，菌體存活率顯著下降（P＜0.05），但是當(dāng)施加的電壓從10 kV升至20 kV， 對生成的納米纖維的厚度無顯著影響（P＞0.05）[34]。而Beachley 等在研究中表明，同一范圍內(nèi)，隨著施加電壓的增加，納米纖維的直徑會顯著減小[35]。但在上述研究中，納米纖維直徑?jīng)]有隨電壓的改變而改變， 可能是由于隨著外加電壓的增加，流量也隨之增加，兩個參數(shù)的共同調(diào)整使生成的納米纖維厚度無顯著差異。

靜電紡絲過程中，應(yīng)根據(jù)紡絲要求，合理有效地控制各電極絲間產(chǎn)生的脈沖電流，有利于形成連續(xù)而均勻的納米纖維。 推進(jìn)注射器的速度直接決定紡絲速率，當(dāng)紡絲速率較低時，纖維直徑較小，隨著紡絲速率的增加，纖維直徑逐漸變大，直至出現(xiàn)珠狀纖維。 Megelski 等在一項研究中發(fā)現(xiàn)纖維直徑和孔徑與紡絲過程中的流速成正比[36]。此外，噴絲嘴和收集器間的距離直接影響電場的強度和溶劑的揮發(fā)，從而影響纖維直徑，因此保持適當(dāng)?shù)木嚯x，以便形成形貌較好的紡絲纖維[37]。

2.1.3環(huán)境參數(shù) 溫度、相對濕度和氣流等環(huán)境參數(shù)也會影響靜電紡絲纖維的特性。 Mituppatham 等研究發(fā)現(xiàn)，溫度會影響納米纖維的直徑，二者呈負(fù)相關(guān)[38]，其原因是溫度的改變會使溶液的黏度發(fā)生變化，黏度降低，纖維的直徑會減小。 此外，相對濕度較低的環(huán)境下，可以生產(chǎn)連續(xù)纖維，反之較難形成[39]。

表1中為部分基于靜電紡絲技術(shù)包封的益生菌菌株的羅列，以期為靜電紡絲技術(shù)應(yīng)用于益生菌包封提供更多的參考。

表1 靜電紡絲包封益生菌研究文獻(xiàn)Table 1 Research references of probiotics encapsulated by electrospinning

2.2 靜電噴霧

靜電噴霧又稱電噴涂，其基本原理與靜電紡絲類似，即帶電溶液在電場力作用下，受到重力、庫侖力以及表面張力作用，當(dāng)3種力達(dá)到平衡時，處于針頭處的液滴會形成泰勒錐，液滴霧化后形成細(xì)小微粒，被收集在接收板上。 此時，需控制聚合物溶液在低濃度范圍， 在此條件下由于分子鏈段纏結(jié)度低，易形成微小顆粒，即為靜電噴霧，其形成的液滴尺寸小且直徑分布均勻，可通過調(diào)節(jié)電參數(shù)對液滴的運動軌跡、速度以及沉積特性進(jìn)行調(diào)控，應(yīng)用于益生菌菌體的包封過程中。 有研究者以磷酸鹽緩沖液和脫脂牛奶為溶劑，研究了基于靜電噴霧技術(shù)濃縮蛋白和普魯蘭膠囊對乳雙歧桿菌Bb-12 的封裝作用， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)封裝基質(zhì)影響益生菌的生存能力，與普魯蘭相比，濃縮蛋白作為包封材料具有更強的保護(hù)能力[23]。

海藻酸鹽是一種海藻多糖， 屬于天然聚合物，具有良好的生物性能，通過海藻酸鹽對益生菌進(jìn)行包封， 益生菌菌體表現(xiàn)出了更高的存活率。Laelorspoen 等通過海藻酸鈉/甘油溶液和靜電噴霧形成的酸性玉米醇溶蛋白與CaCl2的溶液來制備膠囊， 探究了核殼海藻酸鹽-玉米醇溶蛋白微膠囊包裹嗜酸乳桿菌的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包封嗜酸乳桿菌僅減少1 lg（CFU/mL），而非包埋細(xì)菌的數(shù)量減少5 lg（CFU/mL）[47]。Coghetto 等將海藻酸鈉和植物乳桿菌BL011 靜電噴霧到0.5 mol/L CaCl2溶液中，發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉和海藻酸鈉/檸檬果膠的羧基與鈣離子交聯(lián)，并在微膠囊表面形成剛性外壁，暴露于模擬胃液和腸液2 h 后，非包裹細(xì)胞（對照組）的存活率分別下降6.0 lg（CFU/mL）和4.2 lg（CFU/mL），而微囊化細(xì)胞在胃液和腸液中的存活率分別降低了2.9 lg（CFU/mL）和2.7 lg（CFU/mL），表明基于靜電噴霧技術(shù)包埋益生菌可顯著提高其存活率（P＜0.05），同時進(jìn)一步確認(rèn)了該技術(shù)在益生菌封裝方面的潛力[48]。 Davood 等將植物乳桿菌利用靜電噴霧技術(shù)生產(chǎn)的海藻酸鈣/殼聚糖水凝膠微膠囊中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與游離細(xì)胞（對照組）相比，這些膠囊在模擬胃液（pH 2.5）和腸液（pH 7.4）中使細(xì)胞存活率提高了1 lg（CFU/mL），封裝效率為98%[49]。Phuong 等基于靜電噴霧技術(shù)并采用海藻酸淀粉和殼聚糖封裝植物乳桿菌， 并將其制備的微膠囊用于胃腸道模擬實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)殼聚糖包覆的海藻酸鈉顆粒在胃黏膜上表現(xiàn)出良好的保留能力，與純殼聚糖對照組相當(dāng)[50]。由于淀粉是一種非離子型多糖，且黏液黏附性差，因此還觀察到海藻酸淀粉顆粒（陰性對照）的弱保留。 此外，需要注意的是，靜電噴霧產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)良好的黏液黏附性能，充分延長了益生菌在胃腸道中的停留時間以及與腸道微生物群的相互作用，對于益生菌的包封是有利的。

Librán 等將生物聚合物如乳清蛋白濃縮物、抗性麥芽糊精和聚乙烯吡咯烷酮作為基質(zhì)，基于靜電噴霧技術(shù)封裝冷凍干燥的嬰兒雙歧桿菌 CECT 4552，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包被的益生菌在23%相對濕度下和37 ℃的條件下可存活600 d，600 d 后活菌數(shù)超過6 lg（CFU/g），而非包被的細(xì)胞在相同條件下無法存活[51]。 表2 中羅列了基于靜電噴霧技術(shù)包封的益生菌菌株的部分信息，以期為靜電噴霧技術(shù)應(yīng)用于益生菌包封提供更多的參考。

表2 靜電噴霧包封益生菌研究文獻(xiàn)Table 2 Research references on electrostatic spraying encapsulation of probiotics

3 展 望

乳酸菌制劑廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品、益生菌制品和活菌藥物領(lǐng)域，而高活性菌體數(shù)量是乳酸菌制劑加工的核心訴求。 近年來，電流體加工技術(shù)因其加工工藝溫和、功能特點較強、負(fù)載率高且制備的纖維能達(dá)到納米級等優(yōu)點，在開發(fā)高活性、高活菌數(shù)量益生菌制劑領(lǐng)域備受關(guān)注，為益生菌加工行業(yè)提供了新的可能。 當(dāng)前，為擴大電流體加工技術(shù)的潛在應(yīng)用，應(yīng)考慮包封益生菌壁材的安全性，不斷優(yōu)化電流體加工技術(shù)工藝參數(shù)，以期提高益生菌的存活率。 益生菌包裹納米纖維的制造必須依賴合成聚合物，因此，應(yīng)用于包封益生菌的潛在生物聚合物需具備較高的可紡性及其對益生菌菌體活性的影響值得更深入的研究。