高溫白化事件可提高潿洲島澄黃濱珊瑚（Porites lutea）的耐熱性

蒙林慶 ，黃雯 *，陽(yáng)恩廣 ，王永剛 ，許莉佳，余克服

( 1.廣西大學(xué) 海洋學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西大學(xué) 廣西南海珊瑚礁研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004；3.廣西大學(xué)珊瑚礁研究中心，廣西 南寧 530004；4.生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所， 廣東 廣州 510530)

1 引言

珊瑚礁是集生物資源、環(huán)境調(diào)節(jié)、海岸保護(hù)及休閑娛樂(lè)等多功能于一體的海洋生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)人類社會(huì)和海洋生態(tài)有著至關(guān)重要的作用[1-2]。近年來(lái)，全球氣候變化及人類活動(dòng)導(dǎo)致全球的珊瑚礁發(fā)生大規(guī)模白化，預(yù)計(jì)到21世紀(jì)中葉，珊瑚礁覆蓋度將減少70%～90%[3-4]。氣候變暖是造成全球珊瑚礁退化的主要原因[3]。海水溫度升高會(huì)導(dǎo)致珊瑚宿主與蟲(chóng)黃藻之間的共生關(guān)系破裂，使蟲(chóng)黃藻排出細(xì)胞外或共生藻中光合色素降解，最終造成珊瑚白化[5-6]。珊瑚對(duì)熱脅迫的適應(yīng)性研究表明，珊瑚在氣候變化下具有一定的適應(yīng)潛力，例如可以通過(guò)提高其白化閾值，增強(qiáng)對(duì)未來(lái)海洋環(huán)境變化的適應(yīng)[7-8]。如1998年大堡礁發(fā)生過(guò)大規(guī)模高溫白化事件的區(qū)域，在隨后2002年更為嚴(yán)重的熱白化事件中，珊瑚白化嚴(yán)重程度比預(yù)測(cè)要低30%～100%[9]。高頻率熱浪侵襲的海區(qū)，在2005年熱白化事件后，珊瑚白化程度也比預(yù)想中有所減弱[10]。同樣地，經(jīng)歷了2015?2016年全球珊瑚白化事件后的邊緣環(huán)礁，2017年即使遭遇了更極端的熱浪，珊瑚白化現(xiàn)象也減少了[11]。這是經(jīng)歷熱脅迫后珊瑚提高了生理耐熱性的結(jié)果[9,12]。室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，適度熱脅迫后的珊瑚具有更有效的光保護(hù)機(jī)制，環(huán)境適應(yīng)能力增強(qiáng)[12]。國(guó)內(nèi)雖然也有類似研究，但針對(duì)高溫白化事件前后石珊瑚的調(diào)查及研究寥寥無(wú)幾，大多集中于室內(nèi)人工模擬實(shí)驗(yàn)，如Yu等[8]、劉旭[13]對(duì)造礁石珊瑚的室內(nèi)熱馴化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，早期的熱馴化具有提高珊瑚耐熱性的潛力。由于高溫白化事件的隨機(jī)性，當(dāng)前研究大部分都是基于珊瑚白化事件前后珊瑚礁生態(tài)指標(biāo)或通過(guò)單一的室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究珊瑚熱耐受性，而關(guān)于野外熱白化事件發(fā)生前后同種珊瑚對(duì)熱脅迫的響應(yīng)特征與機(jī)制鮮有報(bào)道。因此，展開(kāi)高溫白化事件前后澄黃濱珊瑚（Porites lutea）的耐熱性研究，可填補(bǔ)國(guó)內(nèi)研究空白，對(duì)珊瑚礁保護(hù)和管理起到至關(guān)重要的作用。

廣西北海潿洲島（21°00′～21°10′N，109°00′～109°15′E）位于北部灣海域中部，處于南海珊瑚礁分布的北緣[14]，近年來(lái)也受到了全球氣候變暖的影響，如在2020年夏季遭受異常高溫事件，導(dǎo)致了大量珊瑚的白化[15]。當(dāng)然，白化事件中也有幸存的珊瑚，其中以澄黃濱珊瑚占大多數(shù)。澄黃濱珊瑚是團(tuán)塊狀、雌雄異體產(chǎn)卵型造礁珊瑚，廣泛分布于印度?太平洋海域，是珊瑚礁群落演替過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)種之一[16]。同樣地，它也是廣西北海潿洲島的現(xiàn)有優(yōu)勢(shì)種，占比可達(dá)29.45%[14]。因此，澄黃濱珊瑚是研究此區(qū)域白化事件前后珊瑚對(duì)高溫響應(yīng)與適應(yīng)性的理想物種。本研究以潿洲島2020年高溫白化事件前后采集到的澄黃濱珊瑚活體樣本，進(jìn)行高溫脅迫對(duì)比實(shí)驗(yàn)，通過(guò)比較蟲(chóng)黃藻密度、最大光量子產(chǎn)量（Fv/Fm）等生理指標(biāo)以及總超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）、過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）、谷氨酰胺合成酶（Glutamine Synthetase，GS）、還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）等耐熱性相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)記物，探索高溫白化事件前后澄黃濱珊瑚的耐熱性差異及高溫響應(yīng)模式，為全球氣候變暖背景下潿洲島造礁石珊瑚的適應(yīng)性提出新的看法，對(duì)珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)和管理提供理論基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 研究區(qū)域和材料

本實(shí)驗(yàn)用的所有澄黃濱珊瑚活體樣本均采集于廣西北海潿洲島西南近岸海域（圖1a），水深為4～6 m。如圖1b，樣本采集分為兩批次，首次采集于2020年4月下旬（實(shí)測(cè)水溫約25℃），沒(méi)有經(jīng)歷高溫侵襲，采樣10株；第二次是在同年9月下旬，采集海區(qū)幸存的澄黃濱珊瑚（水溫為30℃），此批樣本在夏季多次經(jīng)歷32℃的高溫海水，也是采樣10株。根據(jù)2020年夏季白化事件發(fā)生時(shí)間，將4月底采集的樣本設(shè)置為未經(jīng)白化事件組，9月底采集的珊瑚設(shè)為經(jīng)歷白化事件組，開(kāi)展高溫脅迫對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

兩批次澄黃濱珊瑚均帶水運(yùn)輸?shù)綇V西大學(xué)珊瑚礁研究中心的實(shí)驗(yàn)室，以循環(huán)海水珊瑚養(yǎng)殖缸進(jìn)行養(yǎng)殖，光照、溫度、水質(zhì)條件都保持在自然海區(qū)參數(shù)值范圍內(nèi)，均暫養(yǎng)2個(gè)月以上，保證珊瑚健康、生長(zhǎng)狀態(tài)良好。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始于2020年11月中旬，兩批均挑選其中健康的5塊澄黃濱珊瑚，用小型切割機(jī)將每塊珊瑚母體切下3塊表面積約為15 cm2的小塊后，把其中1個(gè)珊瑚小塊放于對(duì)照缸（用于26℃實(shí)驗(yàn)對(duì)照和取樣），剩余2個(gè)珊瑚小塊放于實(shí)驗(yàn)缸（升溫脅迫后分別用于30℃、34℃取樣），以此方法依次處理完所有的珊瑚母體，得到30個(gè)珊瑚小塊，并保證兩批次澄黃濱珊瑚均有5個(gè)珊瑚小塊在對(duì)照缸，10個(gè)珊瑚小塊在實(shí)驗(yàn)缸中。最后，將缸中珊瑚暫養(yǎng)1個(gè)星期恢復(fù)至狀態(tài)良好。對(duì)照缸和實(shí)驗(yàn)缸都是循環(huán)海水珊瑚養(yǎng)殖缸，缸體水體容量約為200 L，以抽水泵進(jìn)行水體循環(huán)，保證足夠的水流和溶氧量，自動(dòng)控制養(yǎng)殖燈具（光照∶黑暗=12 h∶12 h）模擬自然光照條件，加熱棒和水冷機(jī)進(jìn)行溫度調(diào)控，采用柏林系統(tǒng)維持水質(zhì)條件。暫養(yǎng)期間溫度為26℃、色溫為20 000 K、鹽度為35±1、碳酸氫根（）濃度指數(shù)（KH）為 7±0.2、pH 為 8.2±0.1、Ca2+濃度為（360±20） mg/L、Mg2+濃度為（1 350±20） mg/L、濃度小于0.15 mg/L、濃度小于0.1 mg/L、濃度小于0.1 mg/L，即在自然海水參數(shù)值范圍內(nèi)。暫養(yǎng)期間兩個(gè)缸體條件始終保持一致，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，對(duì)照缸和實(shí)驗(yàn)缸除溫度不同外，光照、營(yíng)養(yǎng)鹽濃度等條件皆保持相同。

澄黃濱珊瑚高溫脅迫對(duì)比實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3次取樣：分別為26℃（適宜溫度，對(duì)照缸取樣）、30℃（夏季正常溫度，實(shí)驗(yàn)缸取樣）、34℃（極端溫度，實(shí)驗(yàn)缸取樣），每次取樣溫度間隔相同。本次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照缸保持26℃不變，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取樣；實(shí)驗(yàn)缸則模擬海區(qū)升溫幅度從26℃開(kāi)始，每天早上9：00調(diào)節(jié)加熱棒進(jìn)行升溫，保持1℃/d 的梯度上升，在30℃持續(xù)3 d后取樣，使珊瑚機(jī)體有充分時(shí)間來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境溫度的變化，而后繼續(xù)升溫，同理在34℃持續(xù)3 d后取樣，如圖1c所示。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天下午 16：00?17：00對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行拍照記錄；晚上熄燈30 min后，利用脈沖振幅調(diào)制熒光儀（PAM儀）檢測(cè)各珊瑚樣本最大光量子產(chǎn)量（Fv/Fm）；全程觀察珊瑚表觀形態(tài)，如觸手伸展、顏色變化等。每次珊瑚樣本取下后立即測(cè)量蟲(chóng)黃藻密度、葉綠素a含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性等生理生化指標(biāo)。

圖1 采樣區(qū)域和實(shí)驗(yàn)方法Fig.1 Sampling locations and experimental method

2.3 生理生化指標(biāo)測(cè)量

2.3.1 生理指標(biāo)檢測(cè)

珊瑚樣本的表觀形態(tài)變化（觸手、顏色、黏液分泌等）通過(guò)日常觀察和拍照對(duì)比觀察。珊瑚最大光量子產(chǎn)量（Fv/Fm）參考Higuchi等[5]的研究方法，在暗處理30 min后采用PAM儀（Walz，德國(guó)）進(jìn)行測(cè)量。

用盛裝有過(guò)濾海水（孔徑為 0.45 μm 濾膜過(guò)濾）的洗牙器（Water pik，美國(guó)）沖洗珊瑚塊分離珊瑚組織與骨骼，測(cè)量沖洗液總體積后，取50 mL沖洗液以3 000重力加速度（g）于4℃離心10 min，去上清液后加20 mL過(guò)濾海水繼續(xù)離心，以此重復(fù)2～3遍，搖勻鏡檢合格后，棄上清，加4%甲醛固定，用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)得共生藻濃度（C，單位：cells/mL），用鋁箔技術(shù)法測(cè)得珊瑚表面積，最后根據(jù)以下公式得到共生蟲(chóng)黃藻密度（D，單位：cells/cm2）[13]。

式中，V為沖洗液總體積（單位：mL）；M為包裹珊瑚骨骼表面的鋁箔紙質(zhì)量（單位：g）；G為鋁箔紙單位面積質(zhì)量（單位：g/cm2）[13]。

參照J(rèn)effrey和Humphrey[17]的方法計(jì)算出共生蟲(chóng)黃藻葉綠素a含量，以此進(jìn)一步換算得到單位面積葉綠素a含量。從總體積沖洗液中取15 mL以4 000 r/min離心5 min，緩慢去除上清液，剩余沉淀物加入10 mL 90%丙酮，然后在4℃條件下萃取24 h。將萃取24 h后的溶液再次離心，然后取其上清液，用分光光度計(jì)分別測(cè)試波長(zhǎng)為750 nm、664 nm、647 nm和630 nm處的吸光度，代入下列公式得到葉綠素a含量（Chla，單位：μg/mL）：

式中，A750、A664、A647、A630分別代表波長(zhǎng)為750 nm、664 nm、647 nm和630 nm處的吸光度值。再換算成總體積沖洗液葉綠素a質(zhì)量（單位：μg），進(jìn)一步與珊瑚表面積（單位：cm2）相除即得到葉綠素a含量（單位：μg/cm2）。

2.3.2 生化指標(biāo)測(cè)量

同樣用沖牙器加過(guò)濾海水沖洗珊瑚表面得到高濃度沖洗液（＜10 mL），取 2 mL沖洗液在 4℃、6 000 g下離心15 min后取上清液，?80℃保存，用于生化指標(biāo)測(cè)量[18]。首先使用商用試劑盒分別測(cè)定上清液中超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、還原型谷胱甘肽（GSH）、谷氨酰胺合成酶（GS）總活性，所有試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，貨號(hào)分別為A001、A007、A084、A006和A047，具體操作步驟見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。接著使用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）測(cè)得上清液蛋白質(zhì)濃度，以此對(duì)上清液各生化指標(biāo)總活性進(jìn)行歸一標(biāo)準(zhǔn)化，得到各特定生化指標(biāo)活性和含量[19]。

2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)的研究區(qū)域地圖采用Ocean Data View軟件繪制，使用Image-Pro Plus對(duì)升溫過(guò)程中珊瑚照片的圖像進(jìn)行處理。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS Statistics 23進(jìn)行單因素ANOVA分析，選定LSD、圖基s-b（K）和沃勒?鄧肯（W）進(jìn)行比較，顯著性水平設(shè)置為0.05。然后再利用Origin 2019b軟件將本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制成圖。所有的圖像整理、匯總均使用CorelDRAW X7進(jìn)行排版。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 澄黃濱珊瑚的生理指標(biāo)變化

3.1.1 表觀形態(tài)變化

如圖2所示，在表觀形態(tài)上，兩組澄黃濱珊瑚對(duì)高溫脅迫的反應(yīng)一致，都是隨著水溫的升高，顏色變淡、觸手消失、分泌黏液并在表層形成光亮黏液膜，而后近乎白化。高溫脅迫時(shí)，兩組濱珊瑚在形態(tài)上沒(méi)有明顯的響應(yīng)差異，但經(jīng)歷白化事件組的澄黃濱珊瑚觸手伸展更茂密。

圖2 兩組澄黃濱珊瑚在高溫脅迫過(guò)程中的形態(tài)變化Fig.2 Morphological changes of the two groups of Porites lutea under high temperature stress

3.1.2 共生藻生理指標(biāo)變化

如圖3所示，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，兩組澄黃濱珊瑚的葉綠素a含量、蟲(chóng)黃藻密度和最大光量子產(chǎn)量（Fv/Fm）變化模式一致，都是隨溫度上升而降低，30℃ 前變化不明顯（p＞0.05），當(dāng)溫度接近 34℃ 時(shí)，蟲(chóng)黃藻密度和Fv/Fm均顯著下降（p＜0.05）。盡管在每個(gè)溫度下，兩組共生藻生理指標(biāo)值差異不顯著（p＞0.05），但經(jīng)歷白化事件組濱珊瑚有較高的蟲(chóng)黃藻密度、Fv/Fm值和葉綠素a含量，受高溫影響程度更弱。

圖3 兩組澄黃濱珊瑚溫度脅迫過(guò)程中生理指標(biāo)的變化Fig.3 Changes of physiological indexes of two groups of Porites lutea under temperature stress

3.2 澄黃濱珊瑚的生化指標(biāo)變化

3.2.1 抗氧化物活性變化

在整個(gè)升溫實(shí)驗(yàn)中，未經(jīng)白化事件組澄黃濱珊瑚的超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性、還原型谷胱甘肽（GSH）含量都是先升高后變低，但變化不顯著（p＞0.05）；而經(jīng)歷白化事件組澄黃濱珊瑚的這3種抗氧化物也有著相同變化趨勢(shì)，除CAT活 性 變 化 不 顯 著 外 （p＞0.05），SOD活 性 和 GSH含量都會(huì)顯著地先升后降（p＜0.05），并且在實(shí)驗(yàn)中，各抗氧化物活性（含量）都高于未經(jīng)白化事件組，尤其是 30℃ 第 3 天呈現(xiàn)顯著性變化（p＜0.05）（圖4）。過(guò)氧化物酶（POD）活性的變化則有所區(qū)別，在26℃時(shí)，經(jīng)歷白化事件組澄黃濱珊瑚POD活性要顯著高于未經(jīng)白化事件的澄黃濱珊瑚（p＜0.05）；隨后30℃第3天時(shí)，前者的活性會(huì)逐漸變小，后者酶活性則略有升高，但兩者變化都不顯著（p＞0.05）；在34℃第 3天時(shí)，兩組澄黃濱珊瑚POD活性都減小。這些結(jié)果表明，經(jīng)歷白化事件組澄黃濱珊瑚始終有著高的抗氧化物活性。

圖4 兩組澄黃濱珊瑚溫度脅迫過(guò)程中抗氧化物活性（含量）的變化Fig.4 Changes of antioxidant activity (content) of two groups of Porites lutea under temperature stress

3.2.2 銨同化酶變化

谷氨酰胺合成酶（GS）是生物體內(nèi)重要的銨同化酶。如圖5所示，在升溫過(guò)程中，兩組澄黃濱珊瑚的GS活性變化趨勢(shì)一致，都是先升高后降低。在實(shí)驗(yàn)的3個(gè)階段，經(jīng)歷白化事件組澄黃濱珊瑚GS活性都高于未經(jīng)白化事件組，在26℃和30℃第3天時(shí)更是有著顯著差異（p＜0.05），說(shuō)明其有更好的銨清除響應(yīng)能力。

圖5 兩組澄黃濱珊瑚溫度脅迫過(guò)程中銨同化酶（GS）活性的變化Fig.5 Changes of ammonium assimilation enzyme (GS) activities of two groups of Porites lutea under temperature stress

4 討論

4.1 潿洲島澄黃濱珊瑚對(duì)高溫的生理響應(yīng)模式

當(dāng)溫度升高時(shí)，兩組澄黃濱珊瑚都會(huì)逐漸出現(xiàn)觸手收縮的現(xiàn)象，進(jìn)一步表現(xiàn)為釋放黏液，并在其表面形成一層黏液膜，表面顏色逐漸變淺（圖2），這與之前的其他報(bào)道一致[13,20]。珊瑚黏液具有多種功能[20-21]，如可作為營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行物質(zhì)循環(huán)和能量傳遞，也對(duì)珊瑚有著多重保護(hù)作用。由此可見(jiàn)，高溫脅迫時(shí)，珊瑚觸手收縮和黏液分泌等生理變化與其應(yīng)激保護(hù)密切相關(guān)。蟲(chóng)黃藻密度、葉綠素a含量和最大光量子產(chǎn)量等光合作用特征被視為珊瑚重要的自養(yǎng)指數(shù)，也是評(píng)估珊瑚共生體系健康程度的重要指標(biāo)[22-23]。本實(shí)驗(yàn)中，兩組澄黃濱珊瑚的自養(yǎng)指數(shù)在26～30℃過(guò)程中下降均不顯著（p＞0.05），但在30～34℃期間顯著下降（p＜0.05）（圖3）。在高溫脅迫下，珊瑚?蟲(chóng)黃藻共生體系會(huì)發(fā)生崩潰，使蟲(chóng)黃藻分離導(dǎo)致密度降低[24]，而蟲(chóng)黃藻的喪失可以通過(guò)胞吐排出、原位消化或宿主細(xì)胞脫離等方式實(shí)現(xiàn)[25]。因此，升溫過(guò)程中，蟲(chóng)黃藻密度降低說(shuō)明珊瑚正在發(fā)生細(xì)胞凋亡、蟲(chóng)黃藻死亡或被排出體外的現(xiàn)象，溫度越高反應(yīng)越強(qiáng)烈。高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致蟲(chóng)黃藻光合系統(tǒng)電子轉(zhuǎn)移受阻，最大光量子產(chǎn)量也會(huì)隨之降低[26]，也可能會(huì)導(dǎo)致蟲(chóng)黃藻出現(xiàn)光抑制現(xiàn)象，進(jìn)而光合作用能力降低[27]。由此來(lái)看，熱應(yīng)力條件下，蟲(chóng)黃藻密度降低勢(shì)必會(huì)使得光合作用減弱，進(jìn)而導(dǎo)致最大光量子產(chǎn)量和葉綠素a含量降低，這三者之間是存在聯(lián)系的。

熱脅迫會(huì)增加珊瑚共生體中的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）濃度，從而觸發(fā)抗氧化機(jī)制，緩解細(xì)胞水平的毒性，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[28]。如生物體會(huì)釋放出抗氧化類蛋白質(zhì)，清除體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧和過(guò)剩自由基，進(jìn)而起到保護(hù)作用[13,28]。熱脅迫致使珊瑚產(chǎn)生的有害物質(zhì)包括超氧陰離子自由基（）、過(guò)氧化氫（H2O2）等，其大量富集會(huì)引發(fā)細(xì)胞損傷和病變，可通過(guò)超氧化物歧化酶催化形成H2O2[13,29]，而H2O2主要由過(guò)氧化氫酶降解[13]。同樣地，活性氧也可通過(guò)還原型谷胱甘肽[30]和過(guò)氧化物酶[31]等抗氧化物實(shí)現(xiàn)清除。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組澄黃濱珊瑚在26℃、30℃第3天和34℃第3天時(shí)，SOD活性、CAT活性和GSH含量都是先上升后下降（圖4）。這說(shuō)明溫度升高時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量ROS等對(duì)生物體有危害的物質(zhì)，而30℃第3天時(shí)檢測(cè)出高活性的抗氧化物，這是生物體進(jìn)行自我免疫保護(hù)的結(jié)果。當(dāng)溫度超過(guò)30℃時(shí)，珊瑚體內(nèi)的ROS會(huì)逐漸增多，其來(lái)源可能有兩個(gè)途徑：一個(gè)是高強(qiáng)度熱脅迫使珊瑚機(jī)體產(chǎn)生ROS和其他自由基[13,32]，另一個(gè)是蟲(chóng)黃藻密度下降，光合作用能力大打折扣導(dǎo)致ROS增多[13,27]。逐漸積累的ROS引起的共生體氧化應(yīng)激會(huì)激活核轉(zhuǎn)錄因子（NF-kB），進(jìn)而使宿主產(chǎn)生一氧化氮，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞被破壞[24,33]。這使得抗氧化物分泌體也受到損傷，ROS生成速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其降解速度，大量富集會(huì)對(duì)珊瑚生理功能造成損傷，導(dǎo)致珊瑚出現(xiàn)白化[13]。正是如此，在34℃第3天時(shí)，SOD、CAT和GSH等抗氧化物活性（含量）會(huì)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。而兩組澄黃濱珊瑚的POD活性變化趨勢(shì)有所差別，也與上述的3類抗氧化物變化趨勢(shì)不一（圖4D）。具體原因需進(jìn)一步探討，但可推測(cè)在26℃時(shí)，由于POD本身具備多功能性，能降解CAT催化底物、H2O2、脂肪酸、含氮物質(zhì)等，因此開(kāi)始時(shí)會(huì)檢測(cè)到較高的酶活性。隨著溫度的逐漸升高，SOD等抗氧化物增多就會(huì)分擔(dān)POD的一些“工作任務(wù)”，進(jìn)而使得30℃第3天時(shí)POD活性減少。而在34℃第3天時(shí)，也是由于活性氧增多而導(dǎo)致POD酶體被破壞，其活性進(jìn)一步降低。

谷氨酰胺合成酶在生物體內(nèi)負(fù)責(zé)銨的同化，以降低毒性[34]。其隨溫度變化模式與上述SOD等一致（圖5），GS分泌增多的原因也相似，旨在增強(qiáng)自我保護(hù)能力。34℃第3天時(shí)，兩組珊瑚GS活性顯著降低的原因是持續(xù)高溫使得GS在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上的催化能力被抑制，表達(dá)下調(diào)，同樣地，高溫對(duì)珊瑚共生體細(xì)胞也會(huì)造成創(chuàng)傷，進(jìn)而阻止銨同化，最后導(dǎo)致GS活性顯著下降[34-35]。

抗氧化物和銨同化酶在高溫時(shí)活性（含量）先升后降，可能是珊瑚抵抗環(huán)境脅迫的應(yīng)激響應(yīng)之一。大量研究也證實(shí)本文的發(fā)現(xiàn)，如在熱脅迫32℃第3天時(shí)，指狀薔薇珊瑚（Montipora digitata）SOD、CAT活性會(huì)顯著升高，在32℃ 第6天時(shí)二者活性會(huì)降低[5]；急性微塑料脅迫下，鹿角杯形珊瑚（Pocillopora damic-ornis）抗氧化能力明顯上升，24 h后響應(yīng)的解毒酶活性會(huì)降低[18]；在3種造礁石珊瑚的N、P營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，持續(xù)脅迫壓力下，珊瑚的SOD和CAT活性都會(huì)先出現(xiàn)峰值，隨后便有所下降[36]。但也有對(duì)霜鹿角珊瑚（Acropora pruinosa）熱脅迫的研究發(fā)現(xiàn)，升溫過(guò)程中SOD、CAT活性會(huì)持續(xù)升高，即使在33℃第3天時(shí)也是如此[8]。這說(shuō)明，珊瑚應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí)，抗氧化物等活性（含量）會(huì)有先升后降的趨勢(shì)，但出現(xiàn)下降的臨界點(diǎn)會(huì)因珊瑚種類、脅迫溫度和高溫持續(xù)時(shí)間而有所不同。

綜上所述，面對(duì)高溫脅迫時(shí)，澄黃濱珊瑚的響應(yīng)模式如圖6所示。

圖6 澄黃濱珊瑚對(duì)高溫的響應(yīng)模式Fig.6 Response pattern of Porites lutea to high temperature

高溫下為減少機(jī)體損傷，珊瑚會(huì)出現(xiàn)觸手收縮、黏液分泌和自養(yǎng)指數(shù)下降的情況，且抗氧化物和銨同化酶由于ROS等增多其分泌量會(huì)顯著提升以實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)。當(dāng)經(jīng)歷極端高溫時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和相關(guān)酶體受損，使得ROS和銨生成速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其清除速率，ROS等過(guò)量富集，珊瑚共生體系嚴(yán)重崩潰，導(dǎo)致珊瑚出現(xiàn)白化。

4.2 高溫白化事件對(duì)澄黃濱珊瑚耐熱性的馴化

珊瑚觸手伸展情況可用來(lái)評(píng)價(jià)珊瑚對(duì)環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)[20]，而蟲(chóng)黃藻密度和Fv/Fm等自養(yǎng)指數(shù)可用于對(duì)珊瑚遭遇環(huán)境脅迫的響應(yīng)分析[13]。受到高溫脅迫時(shí)，與經(jīng)白化事件組澄黃濱珊瑚相比，未經(jīng)白化事件組澄黃濱珊瑚觸手伸展?fàn)顟B(tài)更差，蟲(chóng)黃藻的損失程度更嚴(yán)重，其光合能力的指標(biāo)（Fv/Fm和葉綠素a含量）值也更低，下降幅度更為顯著（圖2，圖3），整體上生理表現(xiàn)較差。由此可見(jiàn)，經(jīng)歷白化事件組澄黃濱珊瑚在生理指標(biāo)上有更好的熱適應(yīng)能力。有研究認(rèn)為，造礁石珊瑚的自養(yǎng)指數(shù)可能存在季節(jié)變化，如澄黃濱珊瑚的蟲(chóng)黃藻密度冬季最低，葉綠素a含量和有效量子產(chǎn)量（ΦPSII）則是秋冬偏高、春夏偏低[23]。造成此現(xiàn)象的內(nèi)在驅(qū)動(dòng)因素很多，溫度可能是主要原因，自養(yǎng)指數(shù)的大小可能與采樣海域近期的水溫和太陽(yáng)輻射度相關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)的兩組澄黃濱珊瑚樣分別采自不同的月份（圖1b），但兩批樣品均帶水運(yùn)輸回室內(nèi)養(yǎng)殖室以循環(huán)海水珊瑚養(yǎng)殖缸26℃恒溫暫養(yǎng)2個(gè)月以上，與實(shí)驗(yàn)前溫度相差微乎其微，因此，季節(jié)的差異性對(duì)本研究而言影響不大，兩組澄黃濱珊瑚的自養(yǎng)指數(shù)對(duì)比是可行的。

在同一條件下，耐熱性蛋白質(zhì)標(biāo)記物的活性大小是珊瑚機(jī)體抵御外界能力強(qiáng)弱的一個(gè)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[25]。本研究中，經(jīng)歷白化事件組濱珊瑚的SOD、CAT、POD、GSH和GS活性（含量）在各個(gè)階段都更高，變化幅度更大（圖4，圖5）。實(shí)驗(yàn)中的兩組澄黃濱珊瑚始終在同一水體環(huán)境中，承受相同的環(huán)境壓力，而經(jīng)歷白化事件組澄黃濱珊瑚始終有著更高的生化指標(biāo)值，這可能是其應(yīng)對(duì)高溫脅迫的一種響應(yīng)機(jī)制，即通過(guò)分泌更多抗氧化物和銨同化酶來(lái)增強(qiáng)耐熱性以保護(hù)機(jī)體。由于本實(shí)驗(yàn)無(wú)法使用同一個(gè)珊瑚個(gè)體，可能個(gè)體之間存在差異，導(dǎo)致了部分?jǐn)?shù)據(jù)出現(xiàn)較大的標(biāo)準(zhǔn)誤差，進(jìn)而影響了兩組數(shù)據(jù)的差異顯著性，但這并不影響總體趨勢(shì)，經(jīng)歷白化事件組濱珊瑚有著更好的抗氧化性和自我保護(hù)能力。對(duì)珊瑚的環(huán)境脅迫研究也有類似發(fā)現(xiàn)，如在三亞蜈支洲島北側(cè)，反復(fù)遭受富營(yíng)養(yǎng)鹽和不利水質(zhì)環(huán)境下的兩種造礁石珊瑚（叢生盔形珊瑚Galaxea fascicularis、疣狀杯形珊瑚Pocillopora verrucosa），SOD 活性都顯著地升高[37-38]。Flores-Ramírez和Li?án-Cabello[39]發(fā)現(xiàn)，先前暴露于高溫環(huán)境壓力下的Pocillopora capitata會(huì)表現(xiàn)出高水平的SOD活性，以增加抗氧化能力。Keshavmurthy等[40]研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷更高溫波動(dòng)的邊緣環(huán)境的Oulastrea crispata在33℃第3天時(shí)會(huì)有更好的生理可塑性，是耐熱性提高的表現(xiàn)。這說(shuō)明，經(jīng)歷過(guò)脅迫環(huán)境或極端高溫歷史的造礁珊瑚會(huì)提高其體內(nèi)抗氧化物等活性來(lái)應(yīng)對(duì)不良環(huán)境。

多項(xiàng)研究表明，高溫白化事件在一定程度上提高了珊瑚白化閾值，增強(qiáng)了其熱耐受性[9-11,41]。由室內(nèi)的人工馴化結(jié)果可知，熱馴化會(huì)提高珊瑚的耐受性[8,13]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，白化事件對(duì)澄黃濱珊瑚的熱耐受性確實(shí)起到了馴化的效果，使珊瑚再次面對(duì)高溫時(shí)有著更好的抵抗適應(yīng)性。驅(qū)動(dòng)珊瑚熱耐受性提升的因素有多種，如共生藻系群[42]、微生物組成[15]、夏季環(huán)境溫度和持續(xù)時(shí)間[43]等。本研究認(rèn)為潿洲島海水具有季節(jié)性溫度波動(dòng)[15]，可能導(dǎo)致了珊瑚代謝活性的彈性變化，這奠定了其生理可塑性的基礎(chǔ)，因此經(jīng)歷過(guò)高溫事件的澄黃濱珊瑚會(huì)提高抗氧化物、銨同化酶等活性（含量），增強(qiáng)高溫抵抗力，這可能是定向選擇與長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果，是潿洲島澄黃濱珊瑚適應(yīng)環(huán)境的策略之一。具體可解釋為極端高溫或反復(fù)的熱馴化，會(huì)使珊瑚共生體頻繁分泌抗氧化物等進(jìn)行抵御，久而久之機(jī)體細(xì)胞會(huì)形成應(yīng)激記憶，各酶體通路和抵御通道也能更高效地打開(kāi)，實(shí)現(xiàn)珊瑚對(duì)高溫的抵抗。但其具體的驅(qū)動(dòng)耐熱性提高的機(jī)制和內(nèi)在機(jī)理有待進(jìn)一步探索?？傮w而言，從此研究中可以得出，白化事件在一定程度上可以提升潿洲島澄黃濱珊瑚的耐熱性。

在未來(lái)，應(yīng)結(jié)合共生體微生物和分子生物學(xué)工具，進(jìn)行多層次、全方位的分析，進(jìn)一步探索高溫白化事件提升珊瑚熱耐受性的機(jī)制以及熱馴化的持續(xù)時(shí)間和效果，以加深潿洲島造礁石珊瑚對(duì)熱馴化響應(yīng)的理解。然而，區(qū)域高溫白化事件使部分珊瑚種類耐熱性提高可能會(huì)導(dǎo)致其他非耐熱性珊瑚物種的消失，因此，我們呼吁從人類能干預(yù)的角度盡最大可能做好珊瑚礁保護(hù)工作，做好碳減排工作，減緩氣候變暖的步伐，給予造礁石珊瑚更多的適應(yīng)與馴化時(shí)間。

5 結(jié)論

本研究顯示，面對(duì)高溫壓力，白化事件前后的澄黃濱珊瑚均出現(xiàn)表觀形態(tài)變差、自養(yǎng)指數(shù)下降、抗氧化物等耐熱性蛋白質(zhì)標(biāo)記物活性（含量）顯著地先升后降，兩組珊瑚具有相同的響應(yīng)機(jī)制。但經(jīng)歷白化事件組澄黃濱珊瑚表觀狀態(tài)更優(yōu)，自養(yǎng)指數(shù)更高，抗氧化物（SOD、CAT、GSH、POD）和銨同化酶（GS）活性（含量）在各個(gè)階段均高于未經(jīng)白化事件組澄黃濱珊瑚，且響應(yīng)更高效，表明大規(guī)模的高溫白化事件在一定程度上可以提升潿洲島澄黃濱珊瑚的耐熱性。研究結(jié)果為該地區(qū)造礁石珊瑚的高溫響應(yīng)與適應(yīng)機(jī)制以及珊瑚礁保護(hù)管理提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)參考。