消炎祛痘方對痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制作用研究

紀(jì) 薇，馬 莉，唐 潔，陳紅霞，甘賢兵

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，安徽 合肥 230031)

痤瘡是一種常見的毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病。雄激素誘導(dǎo)皮脂腺異常分泌、毛囊皮脂腺導(dǎo)管角化異常、痤瘡丙酸桿菌增殖、免疫炎癥反應(yīng)等多種因素均與痤瘡發(fā)生相關(guān)[1]。而微生物感染一直被認(rèn)為是導(dǎo)致痤瘡發(fā)生的重要因素之一，其中痤瘡丙酸桿菌在痤瘡患者毛囊皮脂腺中占微生物數(shù)量的89%[2]，是導(dǎo)致痤瘡的主要致病菌。痤瘡丙酸桿菌的增殖及其誘導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)參與痤瘡的整個(gè)發(fā)生過程。痤瘡丙酸桿菌可以在細(xì)胞因子的參與下促使細(xì)胞產(chǎn)生抗菌肽和金屬蛋白酶，并促進(jìn)座瘡的發(fā)生[3]。因此，抑制痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是治療痤瘡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，臨床上針對痤瘡致病菌的外用治療主要以抗生素為主，但其存在成本高、復(fù)發(fā)率高、不良反應(yīng)大[4]等問題，而中醫(yī)外治法則具有獨(dú)到的優(yōu)勢。

中醫(yī)認(rèn)為，痤瘡屬于“粉刺”范疇，由于熱郁，陽氣盛，肺主皮毛，肺經(jīng)積熱，外感風(fēng)邪，邪熱蘊(yùn)結(jié)，熏蒸于面部而發(fā)，即主要是濕熱瘀毒所致[5]。筆者以清熱解毒、祛瘀生肌、利濕泄熱、活血化瘀為原則，經(jīng)過多年臨床經(jīng)驗(yàn)積累總結(jié)配制的中藥面膜在臨床上應(yīng)用療效顯著，臨床觀察表明其具有明顯的抗炎作用[6]，但具體抗炎機(jī)制仍不清楚。本研究在原有面膜基礎(chǔ)上進(jìn)行簡化，選取其中主要成分組成消炎祛痘方(其組成為丹參、連翹、牛蒡子、苦參、黃芩)，進(jìn)一步觀察消炎祛痘方對痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)炎癥反應(yīng)的影響，以初步揭示其治療痤瘡的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞及菌株 THP-1細(xì)胞：中國科學(xué)研究院上海細(xì)胞庫；痤瘡丙酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株：合肥臻沃生物有限公司。

1.2 試藥 消炎祛痘方(藥物組成為丹參、連翹、牛蒡子、苦參、黃芩)：安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；BHI培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、96孔板、6孔板：上海胤曦生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試驗(yàn)盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)(批號(hào) DCM7122)：武漢艾美捷科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)試劑盒(批號(hào) E-EL-H0109c)、白細(xì)胞介素-1α(interleukin-1 alpha，IL-1α)試劑盒(批號(hào) E-EL-H0088c)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)ELISA試劑盒(批號(hào) E-EL-H6008)：Elabscience Biotechnology Co.，Ltd；Trizol(批號(hào) 10296028)：Invitrogen Corporation。

1.3 儀器 熒光定量PCR儀(型號(hào) StepOne Software)：美國Applied biosystems；CO2培養(yǎng)箱(型號(hào) CCL-170B-8)：廈門精藝興業(yè)科技公司；電熱恒溫水浴槽(型號(hào) HWS-24)：上海一恒恒溫設(shè)備廠；PVDF膜(0.22 μm，型號(hào) ISEQ00010)：美國Millipore；電泳儀(型號(hào) BG-subMIDI)：北京百晶生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 中藥提取物制備 取消炎祛痘方(丹參、連翹、牛蒡子、苦參、黃芩等比例配比)20 g，加蒸餾水200 mL浸泡30 min后加熱，保持微沸，煎煮45 min，過濾；藥渣加3～5倍水，煎30 min過濾。合并2次藥液，水浴濃縮至20 mL(相當(dāng)于原藥材1 g/mL)，即為待測中藥水提液，置于4 ℃冰箱保存。

2.2 痤瘡丙酸桿菌復(fù)蘇培養(yǎng) 將痤瘡丙酸桿菌接種于BHI培養(yǎng)基，37 ℃無氧條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，得菌懸液，然后在6 700 r/m、4 ℃下離心15 min，得培養(yǎng)物上清液和細(xì)菌沉淀物。細(xì)菌沉淀物用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌3次，然后懸浮在PBS中，置于80 ℃水浴中30 min以熱滅活，制成痤瘡丙酸桿菌滅活物，4 ℃保存?zhèn)溆肹7]。

2.3 CCK-8檢測細(xì)胞活力 THP-1細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)，接種96孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×106/mL，分別加入不同濃度(100、50、25、12.5、6.25 μg/mL)的消炎祛痘方溶液，以不加入消炎祛痘方為空白對照組，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，于450 nm處測定OD值，測定3次取平均值。細(xì)胞存活率=檢測組的OD值/空白對照組的OD值×100%[8]。

2.4 誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞 收集懸浮的THP-1細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞密度用含脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整到106/mL，鋪入24孔板，將培養(yǎng)的痤瘡丙酸桿菌進(jìn)行離心(1 000 r/min，5 min)，每次加入1 mL的PBS進(jìn)行細(xì)菌純化，重復(fù)3次，最后一次吸去廢液，用無LPS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，按100∶1的比例將細(xì)菌與THP-1細(xì)胞[8]加入24孔培養(yǎng)板中，誘導(dǎo)12 h，以不加痤瘡丙酸桿菌作為空白對照組，光學(xué)顯微鏡下觀察，并拍照。

2.5 ELISA法檢測TNF-α、IL-1α、IL-8表達(dá)水平 根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，消炎祛痘方加藥組選擇25、12.5 μg/mL兩個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組為空白對照組(不加消炎祛痘方及痤瘡丙酸桿菌)、模型組(只加入痤瘡丙酸桿菌)、消炎祛痘方高劑量組(加25 μg/mL消炎祛痘方與痤瘡丙酸桿菌)、消炎祛痘方低劑量組(加12.5 μg/mL消炎祛痘方與痤瘡丙酸桿菌)。將誘導(dǎo)后的THP-1細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，將無細(xì)胞毒性的消炎祛痘方溶液培養(yǎng)24 h，采用ELISA試劑盒，按說明書檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1α和IL-8含量。

2.6 qRT-PCR檢測Toll樣受體2(Toll like receptor 2，TLR2)、核因子-κB p65(nuclear factor-kappa B p65，NF-κB p65)mRNA表達(dá)水平 Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。TLR2正向引物：5′-GTTGGGGGCGTTCATCTCTC-3′；反向引物：5′-CCAGACTGCGTGGTACTTG-3′。NF-κB p65正向引物：5′-AGCCGCTACAGTGTTACTCC-3′；反向引物：5′-TCCCCTGGAACTCATCTGCTA-3′。GAPDH正向引物：5′-CTGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；反向引物：5′-CCACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′。GAPDH為內(nèi)參，比較循環(huán)閾值法分析基因相對含量。

2.7 Westen blot法檢測TLR2、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平 誘導(dǎo)后的THP-1細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，用無細(xì)胞毒性的消炎祛痘方溶液培養(yǎng)24 h，裂解細(xì)胞后提取蛋白，蛋白電泳后按常規(guī)方法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別加入抗TLR2、NF-κB p65及β-actin抗體。4 ℃孵育過夜后，經(jīng)HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，按ECL試劑盒說明書進(jìn)行曝光、顯色。

3 結(jié)果

3.1 消炎祛痘方對THP-1細(xì)胞活力的影響 0、6.25、12.5、25、50、100 μg/L消炎祛痘方作用后THP-1細(xì)胞存活率分別為100%、98.87%、94.35%、81.85%、78.03%、62.25%。結(jié)果顯示，消炎祛痘方在25 μg/mL范圍內(nèi)沒有明顯的細(xì)胞毒性作用(THP-1存活率>80%)，因此，選擇25、12.5 μg/mL兩個(gè)濃度梯度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎癥反應(yīng) 痤瘡丙酸桿菌與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)前，THP-1細(xì)胞呈懸浮狀，細(xì)胞圓潤，折光率好(圖1A)；痤瘡丙酸桿菌與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞干癟皺縮，喪失原來形態(tài)(圖1B)。結(jié)果提示，痤瘡丙酸桿菌對THP-1細(xì)胞的形態(tài)產(chǎn)生一定的影響。

注：A.正常THP-1細(xì)胞形態(tài)；B.痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞形態(tài)圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察THP-1細(xì)胞及痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞(10×10倍)

3.3 消炎祛痘方對痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中TNF-α、IL-1α和IL-8表達(dá)水平的影響 與空白對照組比較，模型組THP-1細(xì)胞中TNF-α、IL-1α、IL-8表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，消炎祛痘方高、低劑量組THP-1細(xì)胞中TNF-α、IL-1α、IL-8表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；消炎祛痘方高劑量組THP-1細(xì)胞中TNF-α、IL-1α、IL-8水平顯著低于低劑量組(P<0.05)。見圖2。

注：A.空白對照組；B.模型組；C.消炎祛痘方高劑量組；D.消炎祛痘方低劑量組；與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與消炎祛痘方低劑量組比較，△P<0.05圖2 各組THP-1細(xì)胞中TNF-α、IL-1α、IL-8表達(dá)水平比較

3.4 消炎祛痘方對痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中TLR2、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平的影響 與空白對照組比較，模型組THP-1細(xì)胞中TLR2、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，消炎祛痘方高、低劑量組THP-1細(xì)胞中TLR2、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；消炎祛痘方高劑量組THP-1細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平顯著低于低劑量組(P<0.05)。見圖3。

注：A.空白對照組；B.模型組；C.消炎祛痘方高劑量組；D.消炎祛痘方低劑量組；與空白對照組比較，*P<0.05；與消炎祛痘方低劑量組比較，△P<0.05圖3 各組THP-1細(xì)胞中NF-κB p65、TLR2 mRNA表達(dá)水平比較

3.5 消炎祛痘方對痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中TLR2、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的影響 與空白對照組比較，模型組THP-1細(xì)胞中NF-κB p65、TLR2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，消炎祛痘方高、低劑量組THP-1細(xì)胞中NF-κB p65、TLR2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；高劑量消炎祛痘方組THP-1細(xì)胞中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著低于低劑量組(P<0.05)。見圖4。

注：A.空白對照組；B.模型組；C.消炎祛痘方高劑量組；D.消炎祛痘方低劑量組；與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與消炎祛痘方低劑量組比較，△P<0.05圖4 各組THP-1細(xì)胞中TLR2、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較

4 討論

痤瘡病因復(fù)雜，多與雄激素水平升高、痤瘡丙酸桿菌繁殖增多、皮脂腺分泌功能亢進(jìn)、毛囊漏斗部異常角化等因素密切相關(guān)。皮脂分泌不通暢，形成角栓堵塞毛囊及皮脂腺導(dǎo)管，毛囊漏斗部角化增殖，同時(shí)，堵塞所造成的無氧環(huán)境也為微生物的繁殖提供了有利條件。中醫(yī)認(rèn)為，痤瘡常由肺經(jīng)風(fēng)熱阻于肌膚而發(fā)，即主要是濕熱瘀毒所致。目前，有關(guān)中藥治療痤瘡的抗炎作用研究多集中在單味藥，如丹參具有抗氧化、抗炎，抑制皮脂腺活動(dòng)[9]的作用；連翹具有降低毛細(xì)血管通透性，減少炎癥滲出的作用；黃芩具有抗菌、抑制皮脂分泌[10]的作用；苦參、牛蒡子也可能在抗炎方面發(fā)揮較大作用。但痤瘡的中醫(yī)治療應(yīng)強(qiáng)調(diào)整體辨證論治，單方藥的作用較為局限，無法達(dá)到整體的清熱解毒、利濕泄熱等功效，而消炎祛痘方從組方上來看，正是針對痤瘡的中醫(yī)病機(jī)辨證治療，以達(dá)到清熱解毒、祛瘀生肌、利濕泄熱、活血化瘀的功效。如果能夠從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度闡明其抗炎、抗角化作用的機(jī)制，將為外用中藥復(fù)方在痤瘡方面的治療提供重要理論依據(jù)。

研究[11]表明，痤瘡丙酸桿菌在痤瘡患者樣本中的檢出率較高，痤瘡丙酸桿菌被認(rèn)為是主要致病菌。Dréno等[12]發(fā)現(xiàn)，痤瘡丙酸桿菌感染皮膚時(shí)通過TLRs，尤其是TLR-2和TLR-4的表達(dá)激活先天免疫，產(chǎn)生IL-1、IL-8、IL-12等炎癥因子，導(dǎo)致毛囊皮脂腺導(dǎo)管角化過度。湯紅燕等[13]報(bào)道痤瘡丙酸桿菌可刺激人外周單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子IL-1、IL-8和TNF-α，上述細(xì)胞因子進(jìn)而與表皮、毛囊和皮脂腺內(nèi)相應(yīng)受體結(jié)合，參與炎癥反應(yīng)。同時(shí)，NF-κB通路被認(rèn)為是調(diào)節(jié)促炎因子的主要機(jī)制，是慢性炎癥反應(yīng)的重要因素。在痤瘡的發(fā)生發(fā)展過程中，IL-1α起重要作用，能促進(jìn)毛囊皮脂腺的角化，加重病情[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，消炎祛痘方可有效抑制被痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中炎癥因子IL-8、IL-1α、TNF-α的分泌，因此，在抑制毛囊皮脂腺角化方面可能發(fā)揮一定作用，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。同時(shí)本研究顯示，消炎祛痘方能顯著降低痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞內(nèi)TLR2 mRNA表達(dá)水平，起到抑制炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和繼發(fā)性炎癥遞質(zhì)生成的作用，并且能夠抑制痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的NF-κB p65表達(dá)，提示消炎祛痘方可能是通過TLR2相關(guān)信號(hào)通路來調(diào)控痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

本研究從消炎祛痘方對痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥因子的影響入手，初步證明消炎祛痘方能抑制痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，但其對下游信號(hào)通路的影響還有待進(jìn)一步研究。另外，對消炎祛痘方影響IL-1α引起毛囊皮脂腺角化方面的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。