酵解黑莓提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

姚鳳麗，孟少珂，延海瑩，萬國韶，楊 青，田迎櫻，杜春影，王 鵬*

（1 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266003 2 中華人民共和國黃島海關(guān) 山東青島 266000 3 青島海濟(jì)潤生生物科技有限公司 山東青島 266000 4 山東省海洋食品營養(yǎng)研究院 山東威海 264200）

氧化-還原反應(yīng)與多個(gè)復(fù)雜的生化過程相關(guān)，對(duì)于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和宿主防御機(jī)制至關(guān)重要[1]。細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平是反映細(xì)胞氧化-還原狀態(tài)的一項(xiàng)指標(biāo)，正常情況下，細(xì)胞中存在的抗氧化劑和抗氧化酶可以及時(shí)清除ROS[2]。當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生過多的ROS，超過其自我清除能力時(shí)，會(huì)使細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)失衡，處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞死亡[3]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是許多生理和病理現(xiàn)象的基礎(chǔ)，與炎癥、衰老、癌癥、心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)[4]。

黑莓（Rubus fruticosus L.）在歐洲和北美廣泛種植[5]，近年來已逐漸引入中國。黑莓富含酚類物質(zhì)，具有抗氧化、抗衰老、抑菌、抗腫瘤等多種活性。黃酮類是植物多酚最常見的類別之一，有6 個(gè)主要的亞類：花色苷、黃酮、黃酮醇、黃烷酮、黃烷醇和異黃酮[6]。花色苷可能是黃酮類物質(zhì)中最受關(guān)注的分類，也是黑莓中具有代表性且含量較高的酚類化合物?；ㄉ站哂辛己玫目寡趸钚?，其中矢車菊素-3-葡萄糖苷可通過提高細(xì)胞活力，減少自由基氧化，增強(qiáng)抗氧化酶活力等，實(shí)現(xiàn)減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[7]。

植物多酚的提取及生物活性研究是天然活性物質(zhì)開發(fā)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。甲醇或乙醇萃取法是從植物中分離酚類物質(zhì)的常用方法，而溶劑萃取過程具有低生物安全性和環(huán)境污染等缺點(diǎn)[8]。酶解和發(fā)酵降解可以通過分解細(xì)胞壁基質(zhì)來促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)組分的溶出，在不產(chǎn)生有害雜質(zhì)的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)組分的高效提取。

黑莓營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，且富含多酚類生物活性物質(zhì)，具有較高的利用價(jià)值。然而，黑莓鮮果極難貯存，目前黑莓的加工利用方式也較為單一，僅有凍果、果汁及發(fā)酵果酒等粗加工產(chǎn)品，形式較常見，因此研究黑莓加工工藝及生物活性成分具有重要意義。本研究針對(duì)酵解黑莓提取物，分析其成分組成，通過探究其對(duì)HUVEC 氧化損傷模型活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活力及細(xì)胞活力等指標(biāo)的影響，評(píng)價(jià)其抗氧化能力，進(jìn)而確定酵解工藝的可行性，為黑莓的高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑莓，新鮮凍果，由青島金鳳凰莊園提供；酸性果膠酶，上海藍(lán)季生物有限公司；矢車菊素-3-葡萄糖苷、96%甲酸、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、二甲基亞砜、叔丁基過氧化氫（t-BHP），美國Sigma 公司；HUVEC 細(xì)胞系，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供；DMEM 培養(yǎng)基，美國Gibco 公司；胎牛血清，杭州四季青公司；ROS 化學(xué)熒光試劑盒、LDH、T-AOC、SOD 和MDA 試劑盒，南京建城生物工程研究所；所有其它化學(xué)藥品和試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-6000PC 紫外-可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀、Agilent 6530 Q-TOF 質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司；Model680 型酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad 公司；IX51 型倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)，日本Olympus 公司；DLCJ-1N 型超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；BJ5060UV 型CO2培養(yǎng)箱，德國Heraeus公司。

1.3 樣品制備

黑莓勻漿后按總質(zhì)量0.5%的添加量加入酸性果膠酶，50 ℃下攪拌酶解1 h，按總質(zhì)量0.03%的添加量加入乳酸菌，28 ℃下密閉發(fā)酵24 h，過濾并凍干后即為酵解黑莓提取物（BF）。黑莓勻漿、過濾、凍干，即為未酵解黑莓提取物（BH）。

1.4 基礎(chǔ)成分測定

總糖含量通過苯酚-硫酸法測定，在波長490 nm 處比色[9]。可溶性蛋白質(zhì)含量通過Folin-酚法測定[10]?？偹岷康臏y定參考GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》[11]。維生素C 含量的測定參考GB 14754-2010《食品添加劑維生素C（抗壞血酸）》[12]。總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteau法[13]?？傸S酮的測定采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法[14]?；ㄉ盏臏y定采用pH 示差法[15]。

鞣花酸含量參照Paterson 等[16]的方法，用HPLC 法測定。色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：以甲醇（A）和0.2%的磷酸（B）為流動(dòng)相，比例為45%A 和55%B；流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

1.5 HPLC-MS 法測定花色苷組成

花色苷種類及含量使用配有1290 Infinity II光電二極管陣列檢測器的Agilent 6530 Q-TOF質(zhì)譜儀分析。色譜柱：ZORBAX SB-C18 色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）。流動(dòng)相：以10%甲酸（A）和100%乙腈（B）作為流動(dòng)相；洗脫梯度：0～0.5 min為96%～91%A，0.5～4 min 為91%A，4～10 min 內(nèi)為91%～87%A，10～20 min 內(nèi)為87%～70%A，20～30 min 內(nèi)為70%～96%A；流速為1.0 mL/min，檢測波長為524 nm；掃描方式：全掃描模式，掃描范圍（m/z）20～2 000，周期為1.0 s。

1.6 t-BHP 誘導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞氧化損傷模型的建立

用0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長期的HUVEC 細(xì)胞，用DMEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1×105U/L 青霉素，1×105μg/L 鏈霉素）配制成密度為5×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，按每孔100 μL 接種到96 孔板中，置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 至細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后，吸棄培養(yǎng)基。分別按50，100，200，300，400，500 μmol/L 的濃度加入t-BHP，每個(gè)濃度設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔，每孔加樣200 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后吸棄培養(yǎng)基，用MTT 法測定細(xì)胞活力?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞存活率設(shè)為100%，選擇存活率接近50%時(shí)，t-BHP 的濃度為最佳作用濃度。

試驗(yàn)共設(shè)置6 組，分別是正常對(duì)照組（N）、模型組（M）、200 μg/mL BH 組（LBH）、200 μg/mL BF組（LBF）、400 μg/mL BH 組（HBH）和400 μg/mL BF 組（HBF）。細(xì)胞接種到96 孔板并黏附24 h 后，吸棄培養(yǎng)基，正常對(duì)照組和模型組每孔加入200 μL 培養(yǎng)基，其余各組加入200 μL 含對(duì)應(yīng)濃度受試物的培養(yǎng)基，孵育24 h 后，吸棄液體，正常對(duì)照組每孔加入200 μL 培養(yǎng)基，其余各組每孔加入200 μL 300 μmol/L 的t-BHP，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，用MTT 法測定細(xì)胞活力。

1.7 ROS 的測定

細(xì)胞培養(yǎng)條件及受試物處理?xiàng)l件與1.6 節(jié)一致。細(xì)胞與受試物孵育并經(jīng)t-BHP 處理后，在含有10 μmol/L 二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA） 的無血清DMEM 培養(yǎng)基中孵育45 min，棄去上清液，用PBS 緩沖液洗滌3 次，向每個(gè)孔中加入200 μL PBS，并使用熒光酶標(biāo)儀檢測吸光度，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.8 細(xì)胞形態(tài)觀察與LDH、MDA、T-AOC 和SOD 的測定

試驗(yàn)分組與1.6 節(jié)一致。取對(duì)數(shù)生長期的HUVEC 細(xì)胞，用DMEM 完全培養(yǎng)基配制成密度為5×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，加入6 孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL。培養(yǎng)24 h 后，吸棄培養(yǎng)基，正常對(duì)照組和模型組加入2 mL 培養(yǎng)基，其余各組加入2 mL含對(duì)應(yīng)濃度受試物的培養(yǎng)基。孵育24 h 后，吸棄液體，正常對(duì)照組每孔加入2 mL 培養(yǎng)基，其余5組每孔加入2 mL 300 μmol/L t-BHP，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，參照試劑盒說明書測定LDH 的含量。

細(xì)胞與受試物孵育并經(jīng)t-BHP 處理后，收集細(xì)胞，冰浴破碎，按照對(duì)應(yīng)試劑盒說明書測定細(xì)胞內(nèi)MDA、T-AOC 和SOD 水平。

1.9 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 和SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果表示為 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行顯著性分析，以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)成分

比較了BH 和BF 中不同成分的水平，以探究酵解過程對(duì)黑莓提取物成分的影響，結(jié)果如表1所示。BF 中總糖、可溶性蛋白質(zhì)和維生素C 的含量與BH 中的差異不大，說明酵解過程未造成明顯的營養(yǎng)物質(zhì)損失。由于酶解和發(fā)酵過程破壞了細(xì)胞壁，促進(jìn)了黃酮、花色苷及鞣花酸等酚類物質(zhì)的溶出[17]，BF 中總酚、總黃酮、花色苷及鞣花酸含量均顯著高于BH（P<0.05），分別增加了43.4%，15.9%，41.7%，44.4%。

表1 BH 和BF 的成分對(duì)比Table 1 Composition comparison of BH and BF

2.2 花色苷組成

黑莓花色苷的HPLC 圖有4 個(gè)主要峰（圖1），結(jié)合表2中HPLC-MS 的鑒定結(jié)果，4 個(gè)峰分別是矢車菊素-3-葡萄糖苷（峰1，m/z 449/287）、矢車菊素-3-木糖苷（峰2，m/z 419/287）、矢車菊素-3-丙二酰葡萄糖苷（峰3，m/z 535/287）和矢車菊素-3-二草酰葡萄糖苷（峰4，m/z 593/287），這與Cho等[18]的結(jié)論一致。BF 中花色苷總含量及4 種花色苷含量均高于BH，說明酵解過程促進(jìn)了花色苷的釋放。與BH 相比，BF 中矢車菊素-3-葡萄糖苷含量增加最多，為63.7%，矢車菊素-3-木糖苷、矢車菊素-3-丙二酰葡萄糖苷和矢車菊素-3-二草酰葡萄糖苷的含量分別增加了41.2%，38.8%，32.9%。

圖1 BH（a）和BF（b）中花色苷組分的HPLC 分析Fig.1 HPLC analysis of anthocyanins in BH （a） and BF （b）

表2 BH 及BF 的花色苷組成Table 2 Anthocyanin composition of BF and BH

2.3 t-BHP 最佳作用濃度

不同濃度的t-BHP 對(duì)HUVEC 細(xì)胞活力的影響如圖2所示。不同濃度的t-BHP 作用于HUVEC 細(xì)胞4 h 后，細(xì)胞活力均有所下降，且呈現(xiàn)劑量依賴性。t-BHP 濃度為300 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞活力最接近50%。因此，選擇300 μmol/L 作為t-BHP 誘導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞氧化損傷的最佳作用濃度。

圖2 t-BHP 濃度對(duì)HUVEC 細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effects of t-BHP concentration on the cell viability of HUVEC

2.4 BH 和BF 對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

圖3顯示了不同樣品對(duì)HUVEC 細(xì)胞形態(tài)的影響。正常對(duì)照組的HUVEC 細(xì)胞表面光滑，具有長突觸。用t-BHP 處理的HUVEC 細(xì)胞呈圓形，呈現(xiàn)突觸萎縮和氧化損傷，表明成功建立了氧化應(yīng)激模型。BH 和BF 處理均能預(yù)防氧化損傷并維持細(xì)胞形態(tài)。BF 組圓形細(xì)胞占比少于BH 組，表明酵解黑莓提取物能更有效地減少t-BHP 對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞損害，維持細(xì)胞正常形態(tài)。

圖3 BH 和BF 對(duì)HUVEC 細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.3 Effects of BH and BF on the morphology of HUVEC

2.5 BH 和BF 對(duì)細(xì)胞活力的影響

不同處理方式對(duì)HUVEC 細(xì)胞活力的影響如圖4所示，模型組經(jīng)t-BHP 處理后，細(xì)胞活力降低至正常對(duì)照組的51.3%。BH 和BF 均能顯著提高細(xì)胞活力（P<0.05），且作用具有劑量依賴性。付鑫景[19]研究發(fā)現(xiàn)，黑米中的多酚類物質(zhì)可減輕H2O2引起的氧化應(yīng)激，提高細(xì)胞活力，并表現(xiàn)出劑量依賴性。HBF 組細(xì)胞活力顯著高于HBH 組（P<0.05），相較模型組分別提高了38.7%和44.7%，表明BF 能更有效地減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，防止細(xì)胞死亡，這與酵解過程中酚類物質(zhì)釋放量增加有關(guān)。

圖4 BH 和BF 對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effects of BH and BF on cell viability

2.6 BH 和BF 對(duì)ROS 的影響

如圖5所示，模型組t-BHP 處理顯著增加了細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。Fallah 等[20]的研究表明，花色苷可通過降低ROS 含量來阻斷NF-κB 途徑，從而減少炎癥和氧化應(yīng)激。BH 和BF 處理均能降低ROS 相對(duì)含量，表明BH 和BF 中的花色苷可以抑制ROS 積累，且在一定濃度范圍內(nèi)其作用效果與樣品濃度呈正相關(guān)。HBF 組ROS 釋放量顯著低于HBH 組（P<0.05），分別較模型組降低了41.3%和56.5%。上述結(jié)果表明，酵解過程中黑莓花色苷的釋放增強(qiáng)了提取物對(duì)ROS 積累的抑制效果。

圖5 BH 和BF 對(duì)ROS 的影響Fig.5 Effects of BH and BF on ROS

2.7 BH 和BF 對(duì)LDH 的影響

LDH 位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，是糖酵解過程中的重要酶之一，當(dāng)細(xì)胞受到氧化損傷時(shí)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，LDH 被釋放到細(xì)胞外，因此上清液中LDH 水平可以反映細(xì)胞的損傷程度[21]。用t-BHP 處理后，上清液中LDH 含量顯著增加，表明t-BHP 引起HUVEC 細(xì)胞膜損傷并導(dǎo)致LDH 釋放。BH 和BF均顯著抑制LDH 釋放（P<0.05），說明BH 和BF都能減少t-BHP 對(duì)HUVEC 細(xì)胞的損傷，保護(hù)細(xì)胞膜完整性。HBH 組和HBF 組LDH 釋放量比模型組分別降低了38.3%和44.2%，表明BF 對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)效果更好。

2.8 BH 和BF 對(duì)MDA 的影響

MDA 是由氧化應(yīng)激引起的脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，細(xì)胞內(nèi)MDA 水平能夠反應(yīng)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化程度[22]。如圖7所示，模型組MDA 水平顯著高于正常對(duì)照組，說明t-BHP 處理可以誘發(fā)HUVEC 細(xì)胞脂質(zhì)過氧化。游庭活[23]研究發(fā)現(xiàn)，桑葚多酚類化合物具有很好的抗氧化活性，可以有效抑制脂質(zhì)過氧化，降低D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠血清及腦、肝臟和心臟組織中MDA 含量。與模型組相比，BH 和BF 處理均以劑量依賴性方式顯著降低MDA 水平，且400 μg/mL BF 作用下，細(xì)胞內(nèi)MDA 水平與正常對(duì)照組差異不顯著（P>0.05），說明黑莓提取物中的多酚類物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化有顯著的抑制作用，且酵解過程有效提高了其抑制脂質(zhì)過氧化的能力。

圖6 BH 和BF 對(duì)LDH 的影響Fig.6 Effects of BH and BF on LDH

圖7 BH 和BF 對(duì)MDA 的影響Fig.7 Effects of BH and BF on MDA

2.9 BH 和BF 對(duì)T-AOC 和SOD 的影響

T-AOC 代表總抗氧化劑水平，SOD 是清除細(xì)胞內(nèi)自由基的關(guān)鍵酶。BH 和BF 對(duì)HUVEC 細(xì)胞中抗氧化系統(tǒng)的作用可以通過T-AOC 和SOD 活力來表征。如圖8所示，模型組的T-AOC 和SOD水平顯著低于正常對(duì)照組，說明在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)功能受損。與模型組相比，400 μg/mL 的BH 和BF 均可顯著增加T-AOC 水平，且400 μg/mL BF 組T-AOC 水平顯著高于同濃度BH 組。同時(shí)，BH 和BF 處理能夠以劑量依賴的方式提高SOD 活力，且相同濃度下BF 組SOD活力稍高于BH 組。Wu 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，甜櫻桃花色苷可通過增加SOD 和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）的活力來抑制氧化應(yīng)激。本文所采取的酵解工藝促進(jìn)了花色苷的溶出，使酵解黑莓提取物對(duì)細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的保護(hù)作用增強(qiáng)。

圖8 BH 和BF 對(duì)T-AOC（a）和SOD（b）的影響Fig.8 Effects of BH and BF on T-AOC （a） and SOD （b）

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)2 種黑莓提取物BH 和BF 的主要成分進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)BF 的總糖、可溶性蛋白質(zhì)、維生素C 等營養(yǎng)成分含量與BH 相當(dāng)，總酚、總黃酮、花色苷和鞣花酸含量顯著高于BH，其中矢車菊素-3-葡萄糖苷含量比BH 高63.7%，表明酵解過程有助于黑莓活性物質(zhì)的溶出。BF 對(duì)t-BHP 誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有很好的保護(hù)作用，可以維持氧化應(yīng)激狀態(tài)下HUVEC細(xì)胞的正常形態(tài)，抑制ROS 積累，保護(hù)細(xì)胞膜完整性，抑制脂質(zhì)過氧化并提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力。該酵解工藝促進(jìn)了花色苷等酚類活性物質(zhì)的釋放，提高了黑莓提取物的抗氧化能力，因此相同濃度下BF 對(duì)HUVEC 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用優(yōu)于BH。本研究證明了酵解工藝的可行性，在分析提取物成分的基礎(chǔ)上，深入分析了其抗氧化能力，為黑莓的高值化利用提供理論依據(jù)。