B群鏈球菌液體顯色培養(yǎng)基改良及性能評價

楚亞菲，荊楠，肖征，閆文娟

(河南省人民醫(yī)院 檢驗科，河南 鄭州 450003)

B群鏈球菌(group B streptococcus，GBS)又稱無乳鏈球菌，通常在超過50%的健康人群下消化道和泌尿生殖道定植。高達(dá)40%的健康孕婦在陰道、直腸都存在GBS[1]。有文獻(xiàn)指出中國女性GBS定值率高達(dá)36%[2]。孕婦GBS定植可引起絨毛膜羊膜炎、胎膜早破、早產(chǎn)和死胎等不良結(jié)局，新生兒感染GBS可引起腦膜炎、敗血癥、肺炎等疾病，且預(yù)后差、病死率高[3-4]。目前許多國家建議對懷孕35～37周的孕婦進行陰道和/或直腸攜帶GBS的普遍篩查[2,5]。2010年美國CDC和2015年歐洲共識均將肉湯增菌鑒定作為篩查GBS的首選方法[6-7],普通細(xì)菌培養(yǎng)鑒定不但耗時長，而且要求檢測人員有一定的技術(shù)，否則容易漏檢非特征性菌落，顯色瓊脂培養(yǎng)基存在較多的假陽性，需要補充觸酶試驗等相關(guān)試驗，產(chǎn)橙色素液體培養(yǎng)基存在漏檢不產(chǎn)橙色素的GBS問題。本研究旨在改進液體培養(yǎng)基Todd-Hewitt肉湯的成分，提高不產(chǎn)橙色素GBS的檢出率。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株選取河南省人民醫(yī)院2015年1月至2019年3月臨床分離菌株共112株，其中GBS 74株，化膿鏈球菌6株，屎腸球菌2株，糞腸球菌2株，大腸埃希菌16株，肺炎克雷伯菌1株，白念珠菌2株，光滑念珠菌1株，金黃色葡萄球菌4株，表皮葡萄球菌2株，草綠色鏈球菌1株，銅綠假單胞菌1株。12株標(biāo)準(zhǔn)菌株為本實驗室保存，其中GBS 3株，非GBS 9株。見表1。

表1 本實驗所用菌株

1.2 菌懸液制備按需將12株標(biāo)準(zhǔn)菌株和112株臨床菌株分次分別轉(zhuǎn)種到血平板上，35 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳孵育過夜后選擇單個菌落用MALDI-TOF MS進行鑒定；鑒定后的菌株用生理鹽水研磨成菌懸液，濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷岫?。其中GBS菌懸液再用生理鹽水進行倍比稀釋使其最終濃度為107cfu·L-1。

1.3 培養(yǎng)基的篩選方法Todd-Hewitt基礎(chǔ)肉湯按說明書配制，并分別添加慶大霉素8 g·L-1, 萘啶酸15 g·L-1[8]，每管4 mL無菌分裝后儲存在2～8 ℃待用，此培養(yǎng)基命名為培養(yǎng)基一；以培養(yǎng)基一為基礎(chǔ)，分別添加不同濃度的吸附劑(羥丙基β-環(huán)糊精)、動物血清(綿羊血清)、有機助溶劑(DMF)、還原劑(鹽酸半胱氨酸)和牛心浸粉，并各加入菌懸液濃度為107cfu·L-1GBS (ATCC12386) 100 μL，35 ℃孵育24 h，以產(chǎn)橙色素最明顯的濃度為其最適濃度，再以此為基礎(chǔ)選取2株GBS標(biāo)準(zhǔn)菌株，1株GBS臨床菌株，9株非GBS的臨床菌株，以同樣的方法進行孵育后，經(jīng)正交試驗直觀分析表和方差分析，確定產(chǎn)橙色素最明顯、雜菌生長最差的最佳配方，此培養(yǎng)基命名為培養(yǎng)基二；以培養(yǎng)基二為基礎(chǔ)，分別添加不同濃度的兩性霉素B、氯化血紅素、L-鳥氨酸、鼠李糖，并選取3株GBS標(biāo)準(zhǔn)菌株、9株非GBS標(biāo)準(zhǔn)菌株、1株溶血GBS臨床菌株及11株不溶血的GBS臨床株，以同樣的方法，確定產(chǎn)橙色素最明顯、雜菌生長最差的最佳配方，此培養(yǎng)基為最終培養(yǎng)基，命名為改良液體顯色培養(yǎng)基。

1.4 改良液體顯色培養(yǎng)基性能的臨床菌株評價在4 mL改良液體顯色培養(yǎng)基中加入100 μL配置好的菌懸液(62株GBS臨床菌株，20株雜菌)， 35 ℃孵育24 h觀察結(jié)果。

1.5 結(jié)果判讀產(chǎn)橙色素、弱產(chǎn)橙色素均有GBS生長，不產(chǎn)橙色素?zé)oGBS生長。

1.6 培養(yǎng)結(jié)果定量比較因為培養(yǎng)結(jié)果是定性的，所以培養(yǎng)結(jié)果被數(shù)字化以便于進行正交分析，數(shù)字越高培養(yǎng)基的性能越好。見表2、3。

表2 培養(yǎng)基二數(shù)字化篩選結(jié)果規(guī)定

表3 培養(yǎng)基三數(shù)字化篩選結(jié)果規(guī)定

表3(續(xù))

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基二篩選結(jié)果及正交試驗結(jié)果羥丙基β-環(huán)糊精鹽酸半胱氨酸和牛心浸粉最適質(zhì)量濃度分別為1.25、2.5、5 g·L-1，綿羊血清和DMF的最適體積分?jǐn)?shù)為0.1%，0.025%。不同成分和濃度的具體結(jié)果見圖1～3。本研究使用正交表進行羥丙基β-環(huán)糊精、綿羊血清、DMF、鹽酸半光氨酸和牛心浸粉的正交試驗和方差分析，其中綿羊血清和牛心浸粉的P值分別為0.013、0.005，表明兩者濃度對培養(yǎng)基性能有影響。見表4。最后得到最優(yōu)組合，即培養(yǎng)基二的最終組成為：在培養(yǎng)基一的基礎(chǔ)上，添加綿羊血清0.1%、牛心浸粉6.5 g·L-1、羥丙基β-環(huán)糊精1.25 g·L-1、DMF 0.005%、鹽酸半胱氨酸3.5 g·L-1。

2.2 改良液體培養(yǎng)基篩選結(jié)果及正交試驗結(jié)果L-鳥氨酸、鼠李糖和氯化血紅素的最佳濃度分別為1.25 g·L-1、0.25 g·L-1、10 mg·L-1。各成分不同濃度結(jié)果見圖4、5。本研究將L-鳥氨酸、鼠李糖、氯化血紅素采用L9(33)正交表進行正交試驗和方差分析，結(jié)果見表5，其中L-鳥氨酸P值是0.012，其濃度對培養(yǎng)基有影響。為抑制念珠菌生長，添加兩性霉素B 4 mg·L-1綜合正交試驗表改良液體培養(yǎng)基最終成分為：以Todd-Hewitt肉湯為基礎(chǔ)，添加慶大霉素8 g·L-1、萘啶酸15 g·L-1、綿羊血清0.1%、牛心浸粉6.5 g·L-1、羥丙基β-環(huán)糊精1.25 g·L-1、DMF 0.005%、鹽酸半胱氨酸3.5 g·L-1、L-鳥氨酸1.1 g·L-1、鼠李糖0.4 g·L-1、氯化血紅素12 mg·L-1、兩性霉素B 4 mg·L-1。

圖1 不同質(zhì)量濃度牛心浸粉、鹽酸半胱氨酸、羥丙基 β-環(huán)糊精對培養(yǎng)基性能的影響

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)綿羊血清對培養(yǎng)基性能的影響

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)DMF對培養(yǎng)基性能的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度鼠李糖、L-鳥氨酸對培養(yǎng)基性能的影響

圖5 不同質(zhì)量濃度氯化血紅素對培養(yǎng)基性能的影響

2.3 臨床菌株評價改良液體顯色培養(yǎng)基結(jié)果用改良液體顯色培養(yǎng)基檢測62株GBS臨床菌株，共檢測出61株， 檢測38株非GBS臨床菌株均未顯示橙色，該培養(yǎng)基靈敏度為98.3%，特異度100%。其中有4株變渾濁，分別是2株屎腸球菌、1株溶血葡萄球菌、1株光滑念珠菌。

表4 培養(yǎng)基二正交試驗及方差結(jié)果

表5 培養(yǎng)基三正交試驗及方差結(jié)果

3 討論

自20世紀(jì)80年代以來，以細(xì)菌特異性酶為基礎(chǔ)的顯色培養(yǎng)技術(shù)得到了很大的發(fā)展，包括檢測GBS的顯色培養(yǎng)基[9-12]。特異性酶會因細(xì)菌生長環(huán)境、表達(dá)量不足、分泌不夠、活性不足等因素而影響顯色培養(yǎng)基的靈敏度，另外不同細(xì)菌可有相似的同工酶或酶系統(tǒng)，從而導(dǎo)致特異性不高產(chǎn)生假陽性，因此以特異性酶為基礎(chǔ)的顯色培養(yǎng)基是有局限性的。產(chǎn)橙色素是GBS特有的性質(zhì)，僅極少數(shù)細(xì)菌例如屎腸球也產(chǎn)橙色素[13]。以產(chǎn)橙色素為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基與狹義的顯色培養(yǎng)基(特異性酶相關(guān)顯色培養(yǎng)基)不同，它直接利用細(xì)菌所產(chǎn)生的橙色素顯色，而不是作用于顯色底物，因此避免了狹義顯色培養(yǎng)基的相關(guān)缺陷，但此方法只能檢測產(chǎn)橙色素的GBS, 6%～8%不產(chǎn)橙色素或少產(chǎn)橙色素的GBS容易漏檢[14]。

研究發(fā)現(xiàn)，GBS是否溶血和其是否產(chǎn)橙色素息息相關(guān)，即溶血的GBS產(chǎn)橙色素，不溶血的GBS不產(chǎn)橙色素[15-17]。橙色素是一種鳥氨酸鼠李糖脂，該色素是一種類胡蘿卜素，由cyl操縱子編碼，一旦不能表達(dá)或表達(dá)不足就可導(dǎo)致GBS不產(chǎn)橙色素或弱產(chǎn)橙色素，如果增加誘導(dǎo)物即可促進橙色素的產(chǎn)生[18-19]。改良后的液體培養(yǎng)基在Todd-Hewitt肉湯的基礎(chǔ)上添加了綿羊血清0.1%、牛心浸粉6.5 g·L-1、羥丙基β-環(huán)糊精1.25 g·L-1、DMF 0.005%、鹽酸半胱氨酸3.5 g·L-1、L-鳥氨酸1.1 g·L-1、鼠李糖0.4 g·L-1、氯化血紅素12 mg·L-1，牛心浸粉可以促進GBS生長，綿羊血清可以促進GBS溶血，羥丙基β-環(huán)糊精、DMF、鹽酸半光氨酸均能促進GBS橙色素的產(chǎn)生，特別是L-鳥氨酸和鼠李糖不僅可促進溶血GBS 產(chǎn)生橙色素，還可促進不溶血的GBS產(chǎn)生橙色素。本研究在臨床菌株評價實驗中有3株不溶血的GBS應(yīng)用改良的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)有2株被檢出，改良液體顯色培養(yǎng)基明顯提高了不溶血即不產(chǎn)橙色素GBS的檢出率。狹義的顯色培養(yǎng)基對于念珠菌的抑制作用較差，改良的液體顯色培養(yǎng)基添加了兩性霉素B，能夠有效抑制念珠菌的生長，且實驗中有3株念珠菌均未顯橙色。然而這項研究的缺點是只評價了臨床菌株且數(shù)量有限，本實驗共收集臨床標(biāo)本46株，同時做了改良液體顯色培養(yǎng)基篩查和普通細(xì)菌培養(yǎng)鑒定，兩種方法均未檢出GBS。