基于16S rRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)阿爾茨海默病大鼠腸道菌群的分析

張慧楠，孫雅涵，張欣怡，李明祎，楊立潔，程義超，張慧明

(佳木斯大學(xué) a.臨床醫(yī)學(xué)院;b.康復(fù)護(hù)理學(xué)院;c.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

阿爾茨海默病是一種具有潛在發(fā)病的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病[1]。其臨床上以記憶障礙、失語(yǔ)、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征[2]，最重要的臨床表現(xiàn)是認(rèn)知功能的惡化和行為的變化。但該病一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就是重度癥狀，目前在臨床上無比較有效的檢測(cè)方法能夠檢測(cè)輕型阿爾茨海默病，如何能夠早期預(yù)判及及時(shí)治療成為預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域和難以解決的問題。近年來，腸道菌群研究不斷有所突破，腸道菌群失調(diào)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的發(fā)生存在相關(guān)性[3]，兩者存在雙向交流。越來越多科學(xué)家證實(shí)，包括認(rèn)知行為在內(nèi)的大腦功能和行為可被腸道菌群通過微生物-腸-腦軸的方式進(jìn)行調(diào)節(jié)。腸道菌群多樣性調(diào)節(jié)的方式已經(jīng)成為阿爾茨海默病治療的新靶點(diǎn)。本研究通過建立阿爾茨海默病動(dòng)物模型，采用16S rRNA測(cè)序的方法進(jìn)行阿爾茨海默病大鼠模型腸道菌群分析，旨在尋找不同程度大鼠模型腸道菌群差異性，為臨床上預(yù)防阿爾茨海默病發(fā)病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16～18周齡雄性SD大鼠[(650±50)g]30只飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，所有實(shí)驗(yàn)都得到了生物安全中心及佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)化條件下保持在(22±2)℃，相對(duì)濕度為(54±5)%，晝夜交替12 h的環(huán)境中。大鼠在實(shí)驗(yàn)前先用1周時(shí)間適應(yīng)環(huán)境，自由進(jìn)食水，手術(shù)前禁食10 h。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 體積分?jǐn)?shù)75%醫(yī)用酒精(武漢市活力消毒用品有限公司)、Aβ1-40[吉爾生化(上海)有限公司]、體積分?jǐn)?shù)為0.1%三氟乙酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)器材 小動(dòng)物剃毛器(寧波愛克利浦電器有限公司)、小動(dòng)物稱量稱(中國(guó)凱豐集團(tuán)有限公司)、帶線縫合針(上海金環(huán))、一次性無菌注射器(上海康德萊企業(yè)發(fā)展集團(tuán)股份有限公司)、顱骨鉆(STR204)、腦立體定位儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)、血壓計(jì)(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)、血糖試紙及血糖儀(魚躍)。

1.2 研究方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模 使用體積分?jǐn)?shù)為0.1%三氟乙酸將Aβ1-40稀釋成10 mg·L-1，37 ℃孵育5～7 d，使其變?yōu)楣丫垠w。SD大鼠麻醉后繼而固定于腦立體定位儀上。用醫(yī)用酒精擦拭大鼠顱部皮膚進(jìn)行消毒，按照大鼠腦立體定位圖譜，打開顱腔，將其中24只大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)緩慢勻速注射Aβ1-40寡聚體各10 μg (10 μL)，留針5 min，退針后縫合切口，緩慢退針[4]。另外6只按上述操作打開顱腔，但不進(jìn)行任何注射。待操作完成后，將大鼠置于鼠籠內(nèi)，注意使其側(cè)臥和保暖，并且時(shí)刻監(jiān)測(cè)呼吸情況。蘇醒后送回實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，繼續(xù)飼養(yǎng)。術(shù)后飼養(yǎng)至28 d，其間每周1次檢測(cè)大鼠的體質(zhì)量、血壓、血糖的變化。其中發(fā)現(xiàn)注射過Aβ1-40的24只大鼠有12只血糖血壓不穩(wěn)定，將其淘汰，保留其余的12只SD大鼠。

1.2.2動(dòng)物分組 大鼠手術(shù)28 d后，進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮平臺(tái)儲(chǔ)存于水面以上1～2 cm處，水溫控制在(22±2)℃。主要檢測(cè)大鼠的被動(dòng)空間學(xué)習(xí)記憶能力，包括定位航行試驗(yàn)和空間探針試驗(yàn)。測(cè)試持續(xù)6 d，測(cè)定大鼠認(rèn)知功能，對(duì)大鼠進(jìn)行分組。

1.2.3樣本測(cè)序 提取對(duì)照組、輕癥模型組和重癥模型組大鼠的糞便樣本，將糞便樣本送至APE×BIO公司進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)，并進(jìn)行物種組成分析、物種差異與標(biāo)志物種分析、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析和關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)照組大鼠第6天的結(jié)果顯示穿越平臺(tái)次數(shù)最多，其次是輕癥模型組大鼠，重癥模型組大鼠最少。輕癥模型組大鼠和重癥模型組大鼠的潛伏期均長(zhǎng)于對(duì)照組，且重癥模型組大鼠的潛伏期最長(zhǎng)。輕癥模型組和重癥模型組大鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間短于對(duì)照組。結(jié)果說明造模成功。根據(jù)水迷宮實(shí)驗(yàn)判定小鼠的意識(shí)障礙程度，將動(dòng)物分成對(duì)照組、輕度模型組、重癥模型組，每組6只，穿越平臺(tái)次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

2.2 腸道菌群高通量測(cè)序結(jié)果對(duì)18個(gè)樣本(對(duì)照組、輕癥模型組、重癥模型組)采用Illumina Miseq高通量測(cè)序儀獲得高質(zhì)量序列共835 807條，平均每個(gè)樣本464 434條。所有樣品物種積累曲線(圖2)支持了取樣工作的充分性。各組比較，輕癥模型組的高質(zhì)量序列數(shù)(46 156±4 803)低于對(duì)照組(51 451±3 226)(P=0.048 8)；重癥模型組的高質(zhì)量序列數(shù)(41 694±1 892)低于對(duì)照組(51 451±3 226)(P=0.000 6)；重癥模型組的高質(zhì)量序列數(shù)(41 694±1 892)低于輕癥，模型組(46 156±4 803)(P=0.103 8)。各等級(jí)菌種統(tǒng)計(jì)顯示，18個(gè)樣本在不同分類水平下(門、綱、目、科、屬、種)微生物單元數(shù)目的分布情況見表1。在各分類水平上，輕癥模型組的微生物單元數(shù)少于對(duì)照組，重癥模型組的微生物單元數(shù)少于輕癥模型組。這表明阿爾茨海默病導(dǎo)致腸道菌群豐富度降低，且重度阿爾茨海默病要比輕度阿爾茨海默病菌群豐富度下降更快。

2.3 不同阿爾茨海默病嚴(yán)重程度小鼠腸道菌群Alpha分析Alpha多樣性包括Chao指數(shù)、ace指數(shù)、Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)、PD_whole_tree指數(shù)等[5]。其中，Chao指數(shù)和ace指數(shù)反映樣品中群落的豐富度。Chao指數(shù)值是對(duì)樣本中菌群物種總數(shù)的評(píng)估，其數(shù)值越大，表明樣本物種豐富度越高[6]。如圖3箱線圖所示，對(duì)照組大鼠的Chao指數(shù)、observed species、Shannon均大于重癥模型組和輕癥模型組，但Simpson小于重癥模型組、大于輕癥模型組，重癥模型組又大于輕癥模型組，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，重癥模型組大鼠和輕癥模型組大鼠的菌群豐富度均降低，且重癥模型組與輕癥模型組菌群豐富度相似，重癥模型組略高于輕癥模型組。Simpson越大，多樣性越低，模型組菌群豐富度發(fā)生改變。

表1 18個(gè)樣本在6個(gè)水平微生物單元數(shù)統(tǒng)計(jì)表

圖2 物種積累曲線

注：A組為對(duì)照組；B組為輕癥模型組；C組為重癥模型組。

2.4 不同阿爾茨海默病嚴(yán)重程度小鼠腸道菌群Beta分析Beta多樣性通過分析坐標(biāo)軸中樣本和樣本之間的距離直觀地觀察3組樣本之間的菌群差異性。若3組樣本之間的直線距離較近，則表示這3組樣本的菌群差異性較??；相反，若3組樣本之間的直線距離較遠(yuǎn)，則表示3組菌群差異性較大。如圖4A所示，在相同組中個(gè)體之間的直線距離較短，菌群差異性小，在不同組之間，直線距離較大，菌群差異性較大，在阿爾茨海默病的干預(yù)下，3組大鼠分別本能顯著地聚集分布，其距離相距較遠(yuǎn)，PCOA1的橫坐標(biāo)影響因素占總成分的16%，PCOA2的縱坐標(biāo)影響因素占總成分的13.5%。NMDS模型能更準(zhǔn)確地反映出距離矩陣的數(shù)值排序信息，圖4B中的stress值為0.156，具有一定的解釋意義，且3組大鼠在二維空間分布上存在著較大的差異，表明其腸道菌群的Beta多樣性發(fā)生了變化，結(jié)合PCOA和NMDS圖像分析，阿爾茨海默病模型建立對(duì)腸道菌群Beta多樣性造成了一定的影響。

A為距離矩陣與PCOA分析圖；B為NMDS結(jié)果分析圖。

2.5 不同阿爾茨海默病嚴(yán)重程度小鼠腸道菌群的組成將對(duì)照組小鼠編號(hào)為A1～A6，輕癥小鼠編號(hào)為B1～B6，重癥小鼠編號(hào)為C1～C6，腸道內(nèi)微生物種類分類如下，圖5所示，在總體水平上A1～A6的門水平和屬水平存在較大差異，現(xiàn)就3組大鼠腸道菌群測(cè)序門和屬水平進(jìn)行分析。

圖5 腸道內(nèi)物種分類學(xué)注釋結(jié)果

在門水平，3個(gè)組(對(duì)照組、輕癥模型組、重癥模型組)的優(yōu)勢(shì)菌相似，為硬壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)。按照3個(gè)組的順序，優(yōu)勢(shì)菌所占比率依次為：Firmicutes66.05%、53.33%、48.63%；Bacteroidetes28.07%、45.70%、49.45%。其中，F(xiàn)irmicutes的比率在輕癥模型組和重癥模型組均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009 5)；Bacteroidetes的比率在輕癥模型組和重癥模型組均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024 7、0.003 7)。此外，由各組大鼠在門水平腸道菌群組成成分中發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組中原有的螺旋體門(Spirochetes)在輕癥模型組和重癥模型組中含量大幅度降低，模型組中Firmicutes、Spirochetes豐度降低而Bacteroidetes豐度上升，阿爾茨海默病可能導(dǎo)致腸道菌群豐度發(fā)生變化，特別可能針對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群豐度的變化。在屬水平，對(duì)照組和輕癥模型組排前4位的菌相同，這4個(gè)菌種在這3組中(按照對(duì)照組、輕癥模型組、重癥模型組的順序)占比依次為：普氏菌屬(Prevotella)6.11%、15.10%、16.37%；乳酸桿菌屬(Lactobacillus)7.64%、15.75%、3.66%；顫螺菌屬(Oscillospira)7.74%、4.97%、3.36%；異桿菌屬(Allobaculum)3.26%、0.53%、6.03%。模型組的Prevotella多于對(duì)照組，輕癥模型組的Lactobacillus多于對(duì)照組和重癥模型組，對(duì)照組的Oscillospira多于模型組，模型組的帕拉普氏菌屬(Paraprevotella)多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)合以上各分類水平和各組間數(shù)據(jù)分析，組間差異明顯的菌群主要為Prevotella和Lactobacillus。相比于對(duì)照組，輕癥模型組的Prevotella和Lactobacillus均增加，重癥模型組的Prevotella增加，Lactobacillus減少。輕癥模型組和重癥模型組之間，差異明顯的菌群為乳酸菌，重癥模型組的乳酸菌少于輕癥模型組，值得關(guān)注的是，重癥模型組大鼠其他菌群多于對(duì)照組和輕癥模型組。

2.6 不同阿爾茨海默病嚴(yán)重程度小鼠腸道菌群網(wǎng)絡(luò)分析網(wǎng)絡(luò)分析是通過計(jì)算特征值間的相關(guān)系數(shù)，尋找變量之間的聯(lián)系，以網(wǎng)絡(luò)圖或者連接模來展示數(shù)據(jù)，并將顯著相關(guān)的特征節(jié)點(diǎn)用不同粗細(xì)的線相連來表示不同變量(物種或基因等)間的相互作用關(guān)系，從而簡(jiǎn)化復(fù)雜系統(tǒng)并提取有用信息的一種定量分析方式。本圖為大鼠關(guān)聯(lián)圖，選取了大鼠中聯(lián)系最為緊密的幾個(gè)模型，反映了其之間的關(guān)系，模型1、4、5為正常組大鼠，通過觀察可發(fā)現(xiàn)1、4、5內(nèi)部相似度較高，但與7、8、9、10、14之間的相似度較低，甚至為負(fù)值，而7、8、9、10、14這5組數(shù)據(jù)之間的相似度較高，均為阿爾茨海默病大鼠，表明阿爾茨海默病大鼠與正常組之間存在一定的差異性。

A為門水平物種組成分析圖；B為屬水平物種組成分析圖。

圖7 網(wǎng)絡(luò)分析圖

3 討論

阿爾茨海默病作為當(dāng)代中老年人常見疾病，在社會(huì)上已經(jīng)引起了廣泛重視。近年來，腸道菌群研究不斷有所突破，腸道菌群失調(diào)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生存在相關(guān)性，兩者存在雙向交流?，F(xiàn)有大量實(shí)驗(yàn)不斷證實(shí)了腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系，認(rèn)為腸道菌群失調(diào)與退行性疾病、免疫性疾病甚至精神性疾病的產(chǎn)生有著密切的聯(lián)系[7-8]。腸道微生物通過代謝作用產(chǎn)生了大量的脂多糖、多種分泌物和淀粉樣蛋白，而且在機(jī)體正常水平下，也會(huì)使脂多糖和淀粉樣蛋白質(zhì)暴露[9]。這可能對(duì)機(jī)體平衡有害，特別是當(dāng)人老齡化時(shí)，消化道黏膜和血腦屏障的成分改變，通透性增加，這些物質(zhì)則更易到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起阿爾茨海默病、帕金森病等疾病[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)通過用Aβ1-40對(duì)大鼠腦部進(jìn)行干預(yù)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行造模，并術(shù)后進(jìn)行血壓、血糖、體質(zhì)量的檢測(cè)，依賴水迷宮定位航行試驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行分組，分為對(duì)照組、輕癥模型組、重癥模型組。通過16S rRNA測(cè)序分析3組大鼠腸道菌群之間的差異性。各等級(jí)菌種數(shù)目統(tǒng)計(jì)顯示，在各分類水平上，輕癥模型組的菌種數(shù)目少于對(duì)照組，重癥模型組的菌種數(shù)目少于輕癥模型組。這表明阿爾茨海默病導(dǎo)致腸道菌群豐富度降低，且重度阿爾茨海默病要比輕度阿爾茨海默病菌群豐富度下降更快。輕癥模型組的高質(zhì)量序列數(shù)低于對(duì)照組；重癥模型組的高質(zhì)量序列數(shù)低于對(duì)照組；重癥模型組的高質(zhì)量序列數(shù)低于輕癥模型組。在門水平上，3組大鼠優(yōu)勢(shì)菌相似，為Firmicutes、Bacteroidetes，F(xiàn)irmicutes66.05%、53.33%、48.63%，Bacteroidetes28.07%、45.70%、49.45%。在屬水平上，對(duì)照組和輕癥模型組排前4位的菌相同，為Prevotella、Lactobacillus、Oscillospira、Allobaculum。對(duì)照組、重癥模型組與輕癥模型組豐富度仍然存在一定差異，分別為Prevotella6.11%、15.10%、16.37%，Lactobacillus7.64%、15.75%、3.66%，Oscillospira7.74%、4.97%、3.36%，Allobaculum3.26%、0.53%、6.03%。

Vogt等[12]研究表明，與健康人相比，阿爾茨海默病患者的微生物多樣性降低，F(xiàn)irmicutes的數(shù)量減少而Bacteroidetes表達(dá)上升，這個(gè)結(jié)論在本實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí)。細(xì)菌或病毒感染可能是造成阿爾茨海默病的原因之一。幽門螺桿菌感染直接或間接參與阿爾茨海默病的發(fā)生和發(fā)展[13]，幽門螺桿菌屬變形菌門，在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與模型組的變形菌數(shù)目存在差異。其他病毒如巨細(xì)胞病毒和水痘帶狀皰疹病毒、單純皰疹病毒1型也與阿爾茨海默病有關(guān)[14]，且單純皰疹病毒1型已被證明是阿爾茨海默病發(fā)展的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。有一些菌屬提示對(duì)大腦有保護(hù)作用：如酪酸梭菌，通過增加胰高血糖素樣肽-1的分泌而具有神經(jīng)保護(hù)作用，另外一些腸道細(xì)菌產(chǎn)生的短鏈脂肪酸和抗氧化劑，也能保護(hù)大腦免受病原體的侵害。真菌、細(xì)菌可以在代謝過程中產(chǎn)生淀粉樣蛋白，和真菌表面結(jié)構(gòu)形成淀粉蛋白樣物質(zhì)。同時(shí)反過來，這些神經(jīng)紊亂往往與腸道健康的改變有關(guān)，其特征是腸道微生物群組成的改變，這可能會(huì)破壞腸道菌群和大腦之間的相互作用。曾有研究表明阿爾茨海默病患者相比于正常人腸道中菌群豐富度和多樣性均降低，其中雙歧桿菌豐度顯著減少[15]。另有研究顯示，腸道菌群，如乳酸菌和雙歧桿菌(革蘭陽(yáng)性菌)具有代謝谷氨酸的能力，谷氨酸是一種著名的初級(jí)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，產(chǎn)生γ-氨基丁酸[16]，是一種腦內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，與認(rèn)知障礙、阿爾茨海默病、焦慮和抑郁等息息相關(guān)[17-19]。

腸道菌群與阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制應(yīng)成為臨床研究的熱點(diǎn)，應(yīng)用腸道菌群治療阿爾茨海默病已經(jīng)成為臨床研究的熱門內(nèi)容。腸道菌群多樣性調(diào)節(jié)的方式已經(jīng)成為阿爾茨海默病治療的新靶點(diǎn)，目前臨床采用最多的方式是糞菌移植的方法。了解微生物群的作用可能為治療提供一片新天地，以延緩阿爾茨海默病發(fā)病、進(jìn)展及逆轉(zhuǎn)，同時(shí)也可能降低阿爾茨海默病發(fā)病率[20]。此外，應(yīng)用某些標(biāo)志物對(duì)疾病的發(fā)現(xiàn)和早期治療也起到了重要作用[21]。本實(shí)驗(yàn)證明了輕型及重型阿爾茨海默病大鼠與正常大鼠之間腸道菌群的差異性，利用差異菌群有助于對(duì)早期阿爾茨海默病患者進(jìn)行診斷及干預(yù)，延緩其發(fā)病速度，有望成為臨床檢測(cè)及治療阿爾茨海默病的新方法。