苦參堿抗白血病作用機(jī)制研究?

楊帆帆， 鐘旺景， 馬玲娣△

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣州 511436；2.惠州市第三人民醫(yī)院，廣東 惠州 516000)

白血病是起源于骨髓造血干/祖細(xì)胞惡性變的一組高度異質(zhì)性疾病，是十大高發(fā)惡性腫瘤之一，兒童和35歲以下的人群占比最高[1]，其特征是白血病細(xì)胞在骨髓和其他組織中惡性增殖，伴分化成熟障礙和凋亡受抑，并廣泛浸潤全身組織器官。臨床上出現(xiàn)貧血、出血、發(fā)熱、免疫低下、骨痛及肝脾、淋巴結(jié)腫大等癥狀[2]。目前臨床治療白血病主要以造血干細(xì)胞移植和化療為主，但移植存在配型困難，需長期服用免疫抑制劑，化療藥毒副作用大，部分患者出現(xiàn)耐藥性，甚至出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移或侵襲其他組織器官，導(dǎo)致病情反復(fù)發(fā)作和惡化，使白血病病人的現(xiàn)狀并不樂觀，因此開發(fā)新的白血病藥物和發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點對臨床白血病的治療至關(guān)重要。

苦參堿(見圖1)是在豆科植物如苦參、苦豆子中提取的一種四環(huán)喹諾里西啶類的生物堿成分，化學(xué)式為C12H24N2O[3]?？鄥A有4種形態(tài)，其中最為常見的為α型，又稱α-苦參堿，結(jié)晶形狀為針晶或棱晶，熔點為76 ℃；β型為單斜棱形結(jié)晶，熔點為87 ℃；γ型是液體，沸點為223 ℃/6 mmHg；δ型為棱晶，熔點為84 ℃，可溶于水、苯、氯仿、乙醚或二硫化碳，微溶于石油醚[4]?，F(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿具有抗炎[5]、抗病毒[6]、抗過敏[7]、抗纖維化[8]、抗氧化[9，10]、抗腫瘤[11]等多種作用?？鄥A的抗白血病作用一直是學(xué)者關(guān)注的熱點話題。本文從苦參堿抑制白血病細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡、抑制白血病細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲、促進(jìn)白血病細(xì)胞分化、增強(qiáng)免疫細(xì)胞功能、影響自噬發(fā)生和逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞的多藥耐藥等方面，對苦參堿抗白血病的藥理作用及分子機(jī)制進(jìn)行研究總結(jié)，為苦參堿的臨床應(yīng)用提供有益啟示和醫(yī)學(xué)參考。

圖1 苦參堿的結(jié)構(gòu)示意圖

1 苦參堿抑制白血病細(xì)胞增殖

原癌基因和抑癌基因的表達(dá)失調(diào)導(dǎo)致白血病細(xì)胞異常增殖，而細(xì)胞增殖嚴(yán)格受控于細(xì)胞周期。近年來多項研究表明，苦參堿主要通過阻滯細(xì)胞G1/S期進(jìn)程抑制多種白血病細(xì)胞系的增殖。王健等[12]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的苦參堿(0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)處理白血病細(xì)胞不同時間(24 h、48 h、72 h)，苦參堿以濃度-時間依賴的方式抑制白血病細(xì)胞增殖。張莉萍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mg/mL的苦參堿作用于慢性髓系白血病K562細(xì)胞株24 h、48 h、72 h后，細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)E、細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)2、CDK5的蛋白表達(dá)水平均提升，G1/S期進(jìn)程阻滯，細(xì)胞增殖率降低。白煜等[14]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/mL和0.8 mg/mL的苦參堿處理人原代白血病細(xì)胞48 h后，G0/G1期細(xì)胞比例增多，提示苦參堿抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。Asl等[15]研究發(fā)現(xiàn)，2.5 mg/mL的苦參堿可通過上調(diào)細(xì)胞周期抑制因子P21蛋白，miRNA-17、miRNA-20和miRNA-93的表達(dá)，阻滯G0/G1、G1/S期的進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。Ma等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在白血病細(xì)胞中，0.8 mg/mL的苦參堿通過抑制BCR/ABL融合基因介導(dǎo)的胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase/mitogen-activated protein kinase，ERK/MAPK)通路，下調(diào)cyclinD1、c-Myc、凋亡抑制基因Bcl-xl、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，并上調(diào)細(xì)胞周期抑制因子P27的蛋白水平，從而抑制白血病細(xì)胞的增殖。Ma等[17]還發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/mL的苦參堿下調(diào)磷酸化的信號傳導(dǎo)與激活轉(zhuǎn)錄因子(Phosphorylation signal transducer and activator of transcription，p-STAT)3和磷酸化的蛋白酪氨酸激酶(Phosphorylation janus kinase，p-JAK)2，顯著抑制STAT3的上游激活因子白細(xì)胞介素(Interleukin6，IL)6的表達(dá)，提示IL-6/JAK/STAT3/通路介導(dǎo)了苦參堿的抗白血病作用。Lin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/mL的苦參堿通過c-Myc調(diào)控己糖激酶(hexokinase，HK)2的表達(dá)抑制糖酵解，進(jìn)而抑制白血病細(xì)胞增殖。綜上所述，苦參堿可通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白cyclinD/E、CDK2/5和細(xì)胞周期抑制因子P21、P27的表達(dá)，調(diào)節(jié)ERK/MAPK通路、IL-6/JAK/STAT3等信號通路，抑制白血病細(xì)胞的增殖。

2 苦參堿誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，腫瘤的十大特征之一就是抵抗細(xì)胞凋亡[19]。多項研究證實，苦參堿可以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡。李瑞等[20]研究發(fā)現(xiàn)，0.25 mg/mL、0.5 mg/mL 和 1.0 mg/mL的苦參堿作用于急性早幼粒白血病細(xì)胞株NB4時，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate-specific proteases，caspase)3和caspase 8活性增強(qiáng)，提示苦參堿通過caspase途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Hao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，0.4 g/L、0.8 g/L、1.2 g/L、1.6 g/L和2.0 g/L苦參堿可以降低白血病細(xì)胞中磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylation phosphoinositide 3-kinase，p-PI3K)，磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylation protein kinase，p-Akt)B，磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶點(phosphorylation mammalian target of rapamycin，p-mTOR)的蛋白水平，證實苦參堿通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞凋亡。Marjan等[22]研究發(fā)現(xiàn)，1.68 mg/mL、3.4 mg/mL和6.75 mg/mL的苦參堿作用于白血病細(xì)胞60 min，線粒體膜電位降低、線粒體通透性增加、細(xì)胞色素C釋放增加、活性氧產(chǎn)生增加、線粒體腫脹，提示苦參堿通過線粒體途徑誘導(dǎo)急性B淋巴細(xì)胞白血病凋亡。因此，苦參堿可能通過上調(diào)促凋亡蛋白和下調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路和線粒體功能等方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3 苦參堿抑制白血病細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學(xué)特征，腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移是大多數(shù)患者死亡的原因。晁榮等[23]研究發(fā)現(xiàn)，1.0 g/L的苦參堿下調(diào)急髓白血病M3型HL-60細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)2和MMP9的mRNA水平，從而抑制HL-60細(xì)胞的黏附力、運(yùn)動力和侵襲力，與3 μM的三氧化二砷聯(lián)合使用后抑制效果更佳，與張偉等[24]的研究一致。張偉等[25]還發(fā)現(xiàn)，在急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat中，0.1 g/L、0.15 g/L和0.2 g/L苦參堿也能明顯下調(diào)細(xì)胞中MMP-9的mRNA水平，顯著降低Jurkat細(xì)胞的侵襲和黏附能力。聶應(yīng)明等[26]研究發(fā)現(xiàn)，白血病細(xì)胞在低氧(3%或5%O2)環(huán)境下，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-α, HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)血管生成，進(jìn)而提高細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。林淑儀等[27]研究發(fā)現(xiàn)，0.2 g/L和0.5 g/L的苦參堿通過下調(diào)HIF-1α、VEGF mRNA的表達(dá)，有效抑制低氧環(huán)境下K562細(xì)胞的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。以上結(jié)果顯示，苦參堿能有效抑制白血病細(xì)胞的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并通過下調(diào)MMPs 、HIF-1α和VEGF等的表達(dá)。

4 苦參堿促進(jìn)白血病細(xì)胞的分化

白血病細(xì)胞的主要特征之一是血液細(xì)胞分化成熟障礙，由于全反式維甲酸誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化，成功治療急性早幼粒細(xì)胞白血病，使藥物誘導(dǎo)分化治療血液腫瘤成為科學(xué)研究的熱點之一。胞質(zhì)型磷脂酶(cytosolic phospholipase, cPL)A2具有降解磷脂膜的作用，其活性增加是誘導(dǎo)細(xì)胞分化的一個重要因素。劉北忠等[28]研究發(fā)現(xiàn)，200 μg/ml苦參堿處理K562細(xì)胞可以顯著增強(qiáng)cPLA2活性，從而促進(jìn)K562細(xì)胞的分化。朱付云等[29]研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mM的苦參堿聯(lián)合1 μM的全反式維甲酸作用全反式維甲酸耐藥的急性早幼粒白血病NB4-R1細(xì)胞，可抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase，TOPO)Ⅱβ的蛋白表達(dá)，使細(xì)胞核質(zhì)比減小，細(xì)胞表面分化抗原(cluster of differentiation, CD)11b升高，從而誘導(dǎo)NB4-R1細(xì)胞分化。王健等[12]研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿處理K562細(xì)胞后，聯(lián)苯胺染色法發(fā)現(xiàn)細(xì)胞向紅系方向分化，以0.05 mg/mL苦參堿作用效果最明顯。羅文紀(jì)等[30]研究發(fā)現(xiàn)，12.5 μg/mL、25 μg/mL和50 μg/mL的苦參堿作用于HL-60細(xì)胞72 h，可促進(jìn)CD11b、CD15的升高，以25 μg/mL苦參堿作用效果最明顯，苦參堿處理細(xì)胞后細(xì)胞體積變小，核質(zhì)比減小，核扭曲呈腎形，核染色質(zhì)濃集增粗，核仁消失，提示細(xì)胞向粒系分化，與李玉紅等[31]的研究一致。與之不同的是，徐建國等[32]研究發(fā)現(xiàn)8 mg/ml苦參煎液可使HL-60細(xì)胞向單核巨噬細(xì)胞分化。以上研究表明，苦參堿可能通過調(diào)節(jié)cPLA2活性、TOPOⅡβ和細(xì)胞表面分化抗原CD11b、CD15的表達(dá)等方式誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化。

5 苦參堿增強(qiáng)免疫細(xì)胞對白血病細(xì)胞的殺傷能力

免疫系統(tǒng)是人體的天然屏障，免疫細(xì)胞是構(gòu)成免疫系統(tǒng)的重要因素，尤其是對于腫瘤患者來說，免疫細(xì)胞的激活可以殺傷腫瘤細(xì)胞，因此通過免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞是治療腫瘤患者的重要途徑。Lu等[33]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/mL的苦參堿抑制K562細(xì)胞中IL-6的表達(dá)，從而抑制JAK/STAT3通路，上調(diào)UL16結(jié)合蛋白(UL16 binding protein，ULBP)2的表達(dá)，激活自然殺傷細(xì)胞(natural Killer cell，NK)對白血病細(xì)胞的殺傷作用。Zhang L等[34]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/mL的苦參堿可上調(diào)急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)細(xì)胞系和原代白血病細(xì)胞中NK細(xì)胞活化型受體(natural killer group 2 member D，NKG2D)以及其配體家族(ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表達(dá)水平，并抑制CD158、促炎癥細(xì)胞因子和黏附分子IL-1α、IL-5、IL-6、IL-10、干擾素(interferon，IFN)-γ和腫瘤壞因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的分泌和表達(dá)，同時降低炎癥介質(zhì)巨噬細(xì)胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)1a、MIP1b、MMP-9、趨化因子(RANTES)的表達(dá)水平，從而調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的免疫活性。結(jié)合上述研究，苦參堿通過調(diào)節(jié)NK細(xì)胞表面配體蛋白、炎癥因子和黏附分子的表達(dá)，增強(qiáng)其對腫瘤細(xì)胞的殺傷力。

6 苦參堿對白血病細(xì)胞自噬的影響

自噬是機(jī)體在饑餓、刺激等惡劣環(huán)境下，維持機(jī)體正常功能的一種自我保護(hù)機(jī)制，它對細(xì)胞的存活和代謝起著至關(guān)重要的作用。研究表明，苦參堿可以調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞的自噬過程。Wu等[35]研究發(fā)現(xiàn)，1.5 g/L的苦參堿處理白血病細(xì)胞，可誘導(dǎo)caspase依賴的細(xì)胞死亡，促進(jìn)Akt/mTOR信號通路的磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生。胡美薇等[36]研究發(fā)現(xiàn)，0.4 mg/mL的苦參堿聯(lián)合0.5 μM的伊馬替尼處理K562細(xì)胞和伊馬替尼耐藥細(xì)胞株K562/IM，自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白Ⅱ輕鏈3/自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白Ⅰ輕鏈3(autophagy-related protein microtubule-related protein Ⅱ light chain 3/autophagy-related protein microtubule-related protein Ⅰ light chain 3, LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ)的蛋白比例增高，P62蛋白表達(dá)水平降低，自噬相關(guān)蛋白(autophagy related protein)Becline-1和剪切形式的caspase-3蛋白表達(dá)增加，表明苦參堿促進(jìn)自噬形成，而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤可以加強(qiáng)苦參堿對K562/IM細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素抑制苦參堿對K562/IM細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡，提示苦參堿誘導(dǎo)的自噬拮抗苦參堿誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞的凋亡。然而Wang等[37]研究發(fā)現(xiàn),苦參堿可以抑制自噬，當(dāng)用2 mM的苦參堿處理胃癌細(xì)胞SGC7901后，自噬小體增多，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿降低組織蛋白酶B和組織蛋白酶D的活性，并促進(jìn)P62的表達(dá)，阻礙溶酶體酸化，損壞溶酶體的功能，進(jìn)而抑制自噬小體的降解，提示苦參堿可作為一種新型的自噬抑制劑發(fā)揮抗腫瘤作用。目前關(guān)于苦參堿對自噬的調(diào)節(jié)仍存在爭議，針對苦參堿到底是促進(jìn)還是抑制自噬有待于進(jìn)一步的研究和探討。

7 苦參堿在逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞多藥耐藥的作用

近年來，由于白血病化療藥物的更新?lián)Q代，白血病患者病情的緩解率得到顯著提高，但在臨床多數(shù)患者出現(xiàn)耐藥性仍是白血病復(fù)發(fā)和治療失敗的主要原因。為提升藥物療效，聯(lián)合用藥成為治療白血病的主要策略。Wu等[38]研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mM的苦參堿可以提高全反式維甲酸耐藥細(xì)胞株NB4-LR1對雷帕霉素治療的敏感性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿通過穩(wěn)定20 S蛋白表達(dá)，增強(qiáng)蛋白酶體活性，促進(jìn)NB4-LR1細(xì)胞的泛素化水平，并導(dǎo)致PML RARα融合蛋白的降解。丁艷芳等[39]研究發(fā)現(xiàn)，50 μg/mL苦參堿可誘導(dǎo)阿霉素耐藥細(xì)胞株K562/ADM凋亡，并誘導(dǎo)阿霉素耐藥細(xì)胞株K562/ADM的凋亡。Chen等[40]研究發(fā)現(xiàn)，300 μmol苦參堿可通過激活caspase-3和caspase-9的表達(dá)，抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)、Bcl-xl、凋亡抑制基因(survivin)、多藥耐藥性蛋白(ATP-Binding Cassette sub-family B member, ABCB)1的活性，從而誘導(dǎo)K562/ADR細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果顯示，苦參堿可以增強(qiáng)雷帕霉素和阿霉素誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的敏感性，逆轉(zhuǎn)其耐藥性。

8 未來前景與存在問題

對苦參堿抗白血病作用機(jī)制研究的多篇報道，提示苦參堿在抗白血病藥理學(xué)與分子機(jī)制研究中具有重要價值。本課題組多年來一直致力于苦參堿抗白血病的作用機(jī)制研究，目前已發(fā)現(xiàn)苦參堿可降低白血病細(xì)胞IL-6蛋白和轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，抑制JAK/STAT3通路關(guān)鍵分子JAK2、STAT3蛋白磷酸化及STAT3調(diào)控下游基因Bcl-xL、c-Myc和CyclinD1的表達(dá)，下調(diào)MEK1和ERK1/2磷酸化抑制BCR/ABL介導(dǎo)的Ras/Raf/ERK/MAPK信號通路，減少c-Myc與HK2基因內(nèi)含子結(jié)合而抑制HK2的表達(dá)，上調(diào)ULBP2的表達(dá)增強(qiáng)NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷，其抗白血病中發(fā)揮的作用不可忽視。苦參堿抗白血病的作用靶點也是本課題組一直研究的方向。

分析近年來文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，苦參堿具有多靶點、多環(huán)節(jié)和多效應(yīng)的特點，可作用于白血病發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)。如阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移、促進(jìn)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥等，其分子機(jī)制主要包括上調(diào)細(xì)胞周期抑制因子P21，促凋亡蛋白、細(xì)胞表面分化抗原CD11b和CD15等表達(dá)；下調(diào)促癌基因c-Myc、HK2、CyclinD1、MMP 、HIF-1α、VEGF和抗凋亡蛋白等表達(dá)，調(diào)節(jié)ERK/MAPK、PI3K/Akt/mTOR和IL-6/JAK/STAT3等通路，調(diào)節(jié)線粒體功能和磷脂酶cPLA2活性，以及調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥因子和黏附分子的表達(dá)?？鄥A抗白血病的分子機(jī)制復(fù)雜多樣，但其最重要的作用靶點尚不明確，仍需進(jìn)一步的探究。

苦參堿在抗白血病方面具有廣泛的作用，其作為中藥毒副作用小、較少破壞發(fā)育正常細(xì)胞，在白血病的治療中具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。目前苦參堿的研究還存在一定的局限性，其發(fā)揮抗白血病的作用主要體現(xiàn)在體外細(xì)胞實驗，而在動物實驗和臨床實驗方面的研究還很少；由于苦參堿的特殊結(jié)構(gòu)難以用生物素或熒光基團(tuán)標(biāo)記苦參堿進(jìn)行細(xì)胞定位觀察，使得苦參堿最關(guān)鍵的作用靶點遲遲未能被發(fā)現(xiàn)。苦參堿半衰期短，作用濃度大，限制了其在臨床的使用。接下來研究者們需在標(biāo)記苦參堿以及合成新的苦參堿衍生物上做進(jìn)一步的探索，借助各種組學(xué)技術(shù)，通過體外和體內(nèi)實驗相結(jié)合，全面闡述苦參堿抗白血病的作用與分子機(jī)制。