四君子湯含藥血清抑制胃癌細(xì)胞干樣特性的作用及機(jī)制?

李鄉(xiāng)南， 楊宇峰， 郭勝男， 張越時， 郭雋馥

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)， 沈陽 110847)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在各類腫瘤中均居于前5位[1]。早期胃癌發(fā)病隱匿，為胃癌的診斷和治療帶來一定困難，故探索胃癌診療的新靶標(biāo)和新途徑具有重要意義。

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤中存在的小部分具有自我更新、自我修復(fù)能力、多向分化潛能和放化療耐藥特性的細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥及復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮著重要作用[2-5]。腫瘤干細(xì)胞獨(dú)特的干樣特性是腫瘤逃逸常規(guī)放化療、導(dǎo)致復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因[6]。近年來，研究報道在肝癌、乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞[7-9]，其中胃癌干細(xì)胞學(xué)說為胃癌研究提供了新的思路，成為腫瘤研究和治療的新方向。

益氣健脾法是中醫(yī)治療腫瘤的常用方法，四君子湯作為益氣健脾法的代表方劑，具有高效、低毒等特點(diǎn)，已成為中醫(yī)治療惡性腫瘤研究的熱點(diǎn)。臨床研究表明，四君子湯加味輔助治療胃癌可提高化療療效，減輕毒副反應(yīng)[10]。四君子湯聯(lián)合腸內(nèi)營養(yǎng)有助于胃癌術(shù)后患者腸道功能的恢復(fù)，提高機(jī)體免疫功能，改善營養(yǎng)狀況[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯含藥血清可有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力并促進(jìn)其凋亡[12]，沉默S100A4基因表達(dá)能夠有效抑制胃癌細(xì)胞的干樣特性[13]。四君子湯對胃癌細(xì)胞干樣特性的作用尚未見報道。因此，本研究擬進(jìn)一步探討四君子湯含藥血清對胃癌細(xì)胞干樣特性的影響及作用機(jī)制。本研究通過遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查(批號 21010500092019004)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠40 只，體質(zhì)量(280±20) g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK(遼)2015-0 001。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，室溫18～23 ℃，相對濕度45%～55%，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

人參、白術(shù)、茯苓、甘草購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診藥局。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基(貨號SH30243.01B)、DMEM/F12培養(yǎng)基(貨號SH30023.01B)，雙抗試劑(青霉素和鏈霉素，美國Hyclone公司，貨號JM-SV30010)；胎牛血清(中國依科賽公司，貨號FCS500)；CCK-8試劑細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8，貨號B34302)、熒光定量PCR試劑盒(美國Bimake公司，貨號B21203)；順鉑(山東齊魯制藥公司，國藥準(zhǔn)字H20023461，20 mg)；TRIzol(貨號10296010)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF，貨號RP-8661)、成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，貨號PHG0368)及CD44-APC單克隆抗體(美國Invitrogen公司，貨號17-0441-81)；B-27補(bǔ)充劑(美國Gibco公司，貨號17504044)；低熔點(diǎn)瓊脂糖(中國Solarbio(索萊寶公司，貨號A8350-100 g/CAS:9012-36-6)；人胃癌SGC7901細(xì)胞(目錄號TCHu 46)，中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會)。

T2型倒置顯微鏡，日本Nikon公司；酶標(biāo)儀(型號Infinite M200 Pro NanoQuant)，瑞士TECAN公司；QuantStudio 3型實(shí)時熒光定量PCR儀，美國ABI公司；CytoFlex型流式細(xì)胞儀，美國Beckman coulter公司。

1.4 四君子湯含藥血清的制備

采用中藥水煎液，將中藥飲片先浸泡 30～60 min煎煮3次，將3次煎液混合然后濃縮至含生藥2.06 g/mL，過濾并除掉中藥渣滓冷藏備用。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為四君子低、中、高劑量組和對照組各10只。四君子低、中、高劑量組每日灌胃給予四君子湯煎劑，給藥劑量分別為生藥0.34 g/100 g、0.69 g/100 g、1.37 g/100 g/體質(zhì)量，對照組每日灌胃相應(yīng)0.9%氯化鈉溶液，每日1次，共7 d。第7天灌胃給藥1.5 h后腹主動脈取血，離心分離血清，56 ℃水浴30 min滅活，0.22 μm微孔濾膜過濾，-80 ℃冷凍保存。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%青霉素-鏈霉素溶液和體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞在瓶壁鋪滿80%時進(jìn)行傳代，選擇生長至對數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分為對照組和四君子低、中、高劑量組。取生長狀態(tài)良好的SGC7901細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，5×103～8×103個/孔，每組3個復(fù)孔。12 h～24 h后(融合度達(dá)50%～70%)，更換為無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)。6 h后，各組分別更換為含10%對照組血清和含10%四君子低、中、高劑量組血清的DMEM培養(yǎng)基。分別在加藥處理24、48和72 h后棄含藥培養(yǎng)基，PBS洗1次，每孔加入含10% 細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8)溶液的DMEM完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀測定450 nm波長OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 成球?qū)嶒?yàn)

實(shí)驗(yàn)分為四君子組、順鉑組、四君子+順鉑組和對照組。取生長狀態(tài)良好的SGC7901細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2×105～3×105個/孔。鋪板24 h后(融合度達(dá)50%～70%)加藥處理，四君子組更換為含10%四君子中劑量組血清的DMEM培養(yǎng)基；順鉑組更換為含4 μg/mL順鉑的DMEM培養(yǎng)基；四君子+順鉑組更換為含10%四君子中劑量組血清和4 μg/mL順鉑的DMEM培養(yǎng)基；對照組更換為含10%對照組血清的DMEM培養(yǎng)基。加藥處理48 h后，胰酶消化各組細(xì)胞用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基[B-27補(bǔ)充劑(1∶50)，0.4%牛血清白蛋白]吹打，調(diào)整細(xì)胞濃度為1000 個/mL。24孔超低吸附培養(yǎng)板中每孔加入1 mL細(xì)胞懸液，每組設(shè)立3個復(fù)孔，每孔1 mL無血清細(xì)胞懸液中所含因子及濃度為：bFGF 20 ng/mL、EGF 20 ng/mL及HEPES 10 mmol/L。常規(guī)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7 d后顯微鏡下觀察細(xì)胞球形成情況。在顯微鏡下計數(shù)3個隨機(jī)視野且直徑大于75 μm的細(xì)胞球總數(shù)并攝影，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)

加藥處理48 h后，準(zhǔn)備體積分?jǐn)?shù)為20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基與0.6%的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液按1∶1 混合配置上層0.3%軟瓊脂凝膠，同時各組取3×103個細(xì)胞與之充分混勻后注入下層已預(yù)加0.5 %軟瓊脂凝膠的6孔板中，常規(guī)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7 d后顯微鏡下觀察集落形成情況。在顯微鏡下計數(shù)3個隨機(jī)視野直徑大于50 μm的集落總數(shù)并攝影，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 熒光定量PCR檢測

加藥48 h后收集細(xì)胞，采用TRizol法提取各樣本的總RNA、ND5000測定總RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增(見表1)。反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算OCT4、SOX2、CD44和S100A4 mRNA相對表達(dá)量。

表1 引物序列表

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測

加藥處理48 h 后，采用不含EDTA 的胰酶消化各組細(xì)胞收集細(xì)胞。PBS 輕洗細(xì)胞1次，加入100 μL PBS重懸細(xì)胞，再向每份細(xì)胞懸液中加入0.06 μg CD44單克隆抗體，混勻后4 ℃避光孵育30 min。PBS 輕洗細(xì)胞2次后送檢分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 四君子湯含藥血清對人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖能力的影響

圖1示，與對照組比較，四君子低、中、高劑量組48 h和72 h細(xì)胞的增殖能力均明顯下降(P<0.01)，提示四君子湯含藥血清可以抑制胃癌細(xì)胞增殖。四君子中劑量組48 h和72 h細(xì)胞增殖能力均顯著低于四君子高劑量組(P<0.01)，72 h細(xì)胞增殖能力低于四君子低劑量組(P<0.05)，提示四君子中劑量組抑制胃癌細(xì)胞增殖效果最好，故選擇四君子中劑量組藥物劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

注： 與對照組比較：**P<0.01；與四君子高劑量組比較：##P<0.01，與四君子低劑量組比較：^P<0.05圖1 四君子湯含藥血清對人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 四君子湯含藥血清對人胃癌SGC7901細(xì)胞成球能力的影響

圖2示，人胃癌SGC-7901細(xì)胞在無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中逐漸分化成懸浮細(xì)胞球，并隨培養(yǎng)時間的延長細(xì)胞球的數(shù)目逐漸增多，體積逐漸增大。四君子組、順鉑組、四君子+順鉑組成球數(shù)明顯低于對照組(P<0.01)。四君子+順鉑組與順鉑組比較成球數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果提示，四君子湯含藥血清處理可以降低胃癌細(xì)胞的成球能力。

注：A.各組細(xì)胞成球能力代表圖片(100×)，培養(yǎng)7d后四君子組、順鉑組、四君子+順鉑組細(xì)胞成球數(shù)目明顯低于對照組；B.平均成球數(shù)量(鏡下3個隨機(jī)視野)；與對照組比較：**P<0.01 圖2 四君子湯含藥血清對人胃癌SGC7901細(xì)胞成球能力的影響

2.3 四君子湯含藥血清對人胃癌SGC7901細(xì)胞集落形成能力的影響

圖3示，與對照組比較，四君子組、順鉑組和四君子+順鉑組集落形成數(shù)明顯減少(P<0.01)，提示四君子湯含藥血清可以降低胃癌細(xì)胞集落形成能力。

注：A. 各組細(xì)胞軟瓊脂集落形成能力代表圖片(40×)，培養(yǎng)7 d后，四君子組、順鉑組、四君子+順鉑組細(xì)胞形成集落數(shù)目明顯低于對照組；B. 平均集落形成數(shù)量(鏡下3個隨機(jī)視野)；與對照組比較：**P<0.01 圖3 四君子湯含藥血清對人胃癌SGC7901細(xì)胞集落形成能力的影響

2.4 四君子湯含藥血清對人胃癌SGC7901細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志基因OCT4、SOX2和CD44表達(dá)的影響

圖4示，四君子組、順鉑組和四君子+順鉑組細(xì)胞中OCT4、SOX2和CD44 mRNA的表達(dá)水平均明顯低于對照組(P<0.01)，提示四君子湯含藥血清處理能夠抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志基因OCT4、SOX2和CD44的表達(dá)。此外，四君子+順鉑組CD44 mRNA的表達(dá)水平低于順鉑組(P<0.05)，提示與順鉑組比較，四君子+順鉑組對腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志基因CD44表達(dá)的抑制作用更強(qiáng)。

注：與對照組比較：**P<0.01；與順鉑組比較：#P<0.05圖4 四君子湯含藥血清對人胃癌SGC7901細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志基因OCT4、SOX2和CD44 mRNA表達(dá)的影響

2.5 四君子湯含藥血清對人胃癌SGC7901細(xì)胞中CD44+細(xì)胞亞群的影響

圖5示，與對照組比較，四君子組、順鉑組和四君子+順鉑組CD44+細(xì)胞比例明顯降低(P<0.01)，提示使用四君子湯含藥血清處理可以降低胃癌細(xì)胞中CD44+細(xì)胞亞群比例。

注：A.流式細(xì)胞術(shù)檢測CD44+細(xì)胞亞群；B.各組細(xì)胞中CD44+細(xì)胞亞群的比例；與對照組比較：**P<0.01圖5 四君子湯含藥血清對人胃癌SGC7901細(xì)胞中CD44+細(xì)胞亞群的影響

2.6 四君子湯含藥血清對人胃癌SGC7901細(xì)胞中S100A4表達(dá)的影響

圖6示，四君子組、順鉑組和四君子+順鉑組細(xì)胞中S100A4 mRNA的表達(dá)水平明顯低于對照組(P<0.05)，提示四君子湯含藥血清處理能夠降低人胃癌SGC7901細(xì)胞中S100A4基因的表達(dá)。

注：與對照組比較：*P<0.05 圖6 四君子湯含藥血清對人胃癌SGC7901細(xì)胞中S100A4 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

目前諸多醫(yī)家認(rèn)為，脾胃虛弱是胃癌發(fā)病的主要因素，兼有氣虛、陰虛、血瘀、氣滯、痰濁和濕邪等其他致病因素，因此治療應(yīng)“從脾論治”，健脾助運(yùn)，氣機(jī)流利，以充元?dú)鈩t能驅(qū)癌毒外出[14]。四君子湯是益氣健脾的代表方劑，方中人參為君，甘溫益氣，健脾養(yǎng)胃；臣以苦溫之白術(shù)健脾燥濕，加強(qiáng)益氣助運(yùn)之力；佐以甘淡茯苓健脾滲濕，苓術(shù)相配則健脾祛濕之功益著；使以炙甘草益氣和中，調(diào)和諸藥[15，16]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯具有抑制腫瘤生長和血管生成的作用，并且在影響腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等方面都發(fā)揮著重要作用[12,17-22]。本研究利用四君子湯制備含藥血清，對人胃癌SGC7901細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理，通過觀察其對胃癌細(xì)胞干樣特性的影響，探討其治療胃癌的潛在機(jī)制。

腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因，具有先天耐藥性。目前，腫瘤干細(xì)胞已成為腫瘤治療的重要靶向細(xì)胞，對靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)以治療腫瘤成為新的研究方向之一。成球以及軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)是研究腫瘤干樣特性的主要體外研究方法，用于證實(shí)腫瘤細(xì)胞的自我更新能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四君子湯含藥血清可以明顯降低胃癌細(xì)胞的成球和集落形成能力，提示其具有抑制胃癌細(xì)胞干樣特性的作用。OCT4、SOX2和CD44是腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志基因[23，24]。本研究采用熒光定量PCR法檢測上述3個基因mRNA水平，發(fā)現(xiàn)四君子湯含藥血清能夠顯著降低其表達(dá)，且與順鉑組比較，CD44在四君子+順鉑組中的表達(dá)水平明顯更低，提示順鉑與四君子聯(lián)用對胃癌細(xì)胞干樣特性的抑制效果更為顯著。此外，鑒于CD44+是胃癌干細(xì)胞表面典型的標(biāo)志分子[25]，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析了CD44+細(xì)胞亞群在胃癌細(xì)胞中的比例，發(fā)現(xiàn)在四君子湯含藥血清的作用下CD44+細(xì)胞亞群比例顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)四君子湯對胃癌細(xì)胞干樣特性的抑制作用。

S100A4是鈣離子結(jié)合蛋白S100家族的成員之一，是一種具有多向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤組織中均呈高表達(dá)，且與腫瘤轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)及患者預(yù)后不良密切相關(guān)[26-29]。研究人員現(xiàn)已證實(shí)，S100A4高表達(dá)與胃癌浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[30，31]。抑制S100A4基因表達(dá)后，胃癌細(xì)胞凋亡增加、增殖力及裸鼠成瘤能力均顯著降低[32]。課題組前期研究并報道了S100A4能夠與GDF15基因啟動子區(qū)域結(jié)合，進(jìn)而對其轉(zhuǎn)錄起正向調(diào)控作用。GDF15可介導(dǎo)S100A4對胃癌細(xì)胞干樣特性的促進(jìn)作用[33]。Yu等[34]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)S100A4可以有效降低胃癌細(xì)胞中SOX2的表達(dá)，提示S100A4可能通過影響下游靶基因的表達(dá)進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的干樣特性。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)四君子湯含藥血清處理后胃癌細(xì)胞中S100A4 mRNA的表達(dá)水平顯著降低，提示四君子湯可能通過抑制S100A4的表達(dá)，進(jìn)而降低多種促癌基因表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的干樣特性，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，四君子湯含藥血清能夠有效降低胃癌細(xì)胞的成球力、軟瓊脂集落形成能力、腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)及CD44+細(xì)胞亞群比例，抑制胃癌細(xì)胞的干樣特性，其上述作用可能是由S100A4介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。這可能成為四君子湯治療腫瘤的潛在作用機(jī)制之一。