Smad2基因在肺癌組織和細胞中的表達特點

盧其香，辛 勇，陳 辰，楊 冬，孫立柱

(1.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221006；2.江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇 南京 210018；3.徐州醫(yī)科大學附屬沭陽醫(yī)院，江蘇 沭陽 223600)

肺癌發(fā)病率和死亡率位居全球首位，也是我國發(fā)病率和死亡率第一的惡性腫瘤[1].肺癌對放療和化療的敏感性較差，且復發(fā)、轉移風險高，多數(shù)患者就診時已處于中晚期，錯失了最佳治療時機[2]，因此，探尋早發(fā)現(xiàn)、診斷和治療肺癌的生物標志物具有重要意義.Smad2基因是哺乳動物轉化生長因子-β(TGF-β)信號傳導通路的下游信號因子[3]；既往研究[4]顯示：Smad家族基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，其中Smad1、Smad8介導哺乳動物的中樞神經(jīng)發(fā)育；Smad4、Smad7缺失會促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[5-6]；Smad4可能參與胰腺癌、胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，且在不同腫瘤中的作用存在差異[7-8]，因此，需要進一步深入研究.目前，關于Smad2基因在肺癌中作用的研究十分少見.本研究探討了Smad2基因在肺癌組織和細胞中的表達特點及意義，旨在為肺癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供新的生物學標志物.

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月—2016年12月徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院收治的肺癌患者128例，其中，男68例，女60例；年齡52～76歲，平均(64.81±6.35)歲.患者均接受手術治療，收集肺癌組織，并經(jīng)病理學檢查證實，同時取與腫瘤邊緣相距5 cm以上的癌旁正常組織.組織樣本取出后立即放入液氮中速凍，之后存放于 80 ℃超低溫冰箱中.本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意后進行組織標本采集(倫理批號：LLP-2015012)，患者均簽署知情同意書.

1.2 細胞株及主要試劑、儀器

人正常肺上皮細胞BEAS-2B、人肺癌細胞A549(上海通派生物科技有限公司)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(上海撫生實業(yè)有限公司)；鼠抗人Smad2單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(上海銘修生物科技有限公司)；Trizol試劑(上海杰美醫(yī)藥科技有限公司)；CCK-8、Transwell小室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)；3-甲基膽蒽(武漢易泰科技有限公司).7500型實時熒光定量PCR儀(賽默飛公司，美國)；IX53光學顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)；多功能酶標儀(北京悅昌行科技有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與轉染

將人正常肺上皮細胞BEAS-2B、人肺癌細胞A549置于細胞培養(yǎng)皿中，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃下5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期細胞用于實驗.取對數(shù)生長期BEAS-2B細胞，使用10 μg/L的3-甲基膽蒽連續(xù)染毒培養(yǎng)至第10代、第20代、第30代、第40代用于實驗.取對數(shù)生長期A549細胞，Smad2過表達組A549細胞轉染Smad2過表達質粒，Smad2低表達組轉染Anti-Smad2質粒，對照組僅常規(guī)培養(yǎng).

1.3.2 RT-PCR檢測肺癌組織和細胞中Smad2 mRNA表達

取300～400 mg肺癌組織，加入500 μL裂解液進行組織勻漿.Trizol試劑提取組織勻漿和人正常肺上皮細胞BEAS-2B、人肺癌細胞A549的RNA，反轉錄得到cDNA，進行實時熒光定量PCR擴增.引物設計由重慶波爾生物科技有限公司設計、合成，Smad2正向引物：5′-CCGGTAGACCGTGTCCCTAG-3′，反向引物：5′-AAGCATTGGACCTACGACCA-3′；內參GAPDH正向引物：5′-CGGACCTAT CGTTGCA TGTAC-3′，反向引物：5′-TAGCACGCACTGTAATT CCTC-3′.反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 60 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共45個循環(huán).相對定量法測定Smad2基因表達水平.

1.3.3 Western blot檢測肺癌組織和細胞中Smad2蛋白表達

取300～400 mg肺癌組織，加入500 μL裂解液進行組織勻漿.RIPA裂解液提取組織勻漿和人正常肺上皮細胞BEAS-2B、人肺癌細胞A549的蛋白，BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白量加入適量的10×DNA Loading Buffer混合均勻，加熱變性，-20 ℃保存.電泳分離蛋白并轉至PVDF膜，BSA室溫下封閉1 h，滴加鼠抗人Smad2單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶400)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶1 000)；4 ℃過夜，滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(稀釋倍數(shù)1∶2 000)；ECL顯影，使用Image J軟件讀取各條帶的灰度值，計算Smad2蛋白的相對表達量.

1.3.4 資料收集與隨訪

收集肺癌患者的性別、年齡、吸煙史、T分期、N分期、M分期、腫瘤分期.術后對患者進行為期5 a的隨訪，記錄生存時間、3 a生存率、5 a生存率.以Smad2 mRNA表達的中位數(shù)為界值，將肺癌患者分為Smad2低表達組和過表達組進行比較分析.

1.3.5 細胞增殖實驗

分別將對照組、Smad2過表達質粒組、Smad2低表達質粒組A549細胞均勻鋪于96孔板中，每孔加入細胞培養(yǎng)液100 μL，細胞計數(shù)20個/μL，每組設置12個復孔，培養(yǎng)72 h后更換為含有10%CCK-8的細胞培養(yǎng)液，37 ℃避光孵育1 h，應用多功能酶標儀讀取光密度值.

1.3.6 Transwell細胞遷移和侵襲實驗

細胞遷移實驗：對照組、Smad2過表達質粒組、Smad2低表達質粒組A549細胞使用含1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，取1×105個A549細胞加入Transwell細胞小室中，下層孔室中加入含1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃下5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；擦除Transwell細胞小室中的剩余細胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色，顯微鏡下計數(shù).

細胞侵襲實驗：基底膠與不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶15比例混合，然后取100 μL加入Transwell細胞小室中，加入1×105個A549細胞，其余步驟同遷移實驗.

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 Smad2基因在癌旁正常組織和肺癌組織中mRNA和蛋白表達水平

肺癌組織中Smad2的 mRNA表達水平明顯高于癌旁正常組織(P<0.01)；肺癌組織中Smad2的蛋白表達水平明顯高于癌旁正常組織(P<0.01).見表1、圖1.

表1 癌旁正常組織和肺癌組織中Smad2的mRNA和蛋白表達水平

圖1 Western blot檢測癌旁正常組織和肺癌組織中Smad2的蛋白表達

2.2 Smad2基因在人正常肺上皮細胞BEAS-2B與人肺癌細胞A549中表達水平

本研究結果顯示：人肺癌細胞A549中Smad2的mRNA表達水平明顯高于人正常肺上皮細胞BEAS-2B(P<0.01)；人肺癌細胞A549中Smad2的蛋白表達水平明顯高于人正常肺上皮細胞BEAS-2B(P<0.05).見表2、圖2.

1、2.對照組、3-甲基膽蒽組第10代Smad2的蛋白表達；3、4.對照組、3-甲基膽蒽組第20代Smad2的蛋白表達；5、6.對照組、3-甲基膽蒽組第30代Smad2的蛋白表達；7、8.對照組、3-甲基膽蒽組第40代Smad2的蛋白表達.

表2 Smad2基因在人正常肺上皮細胞BEAS-2B與人肺癌細胞A549中表達水平

圖2 Western blot檢測人正常肺上皮細胞BEAS-2B與人肺癌細胞A549中Smad2的蛋白表達

2.3 Smad2基因在3-甲基膽蒽誘導人正常肺上皮細胞BEAS-2B惡性轉化過程中mRNA和蛋白表達水平

隨著3-甲基膽蒽誘導人正常肺上皮細胞BEAS-2B惡性轉化傳代數(shù)的增加，Smad2的mRNA和蛋白表達水平逐漸降低，其中傳代數(shù)至第20代、第30代、第40代時3-甲基膽蒽組Smad2的mRNA和蛋白表達水平均明顯低于對照組(P<0.05).見表3、圖3.

表3 不同傳代數(shù)的人正常肺上皮細胞BEAS-2B的mRNA和蛋白表達水平

2.4 Smad2基因表達與肺癌患者臨床病理特征的關系

Smad2基因表達情況在不同N分期、腫瘤分期的肺癌患者間比較差異顯著(P<0.01)；其中，N2～N3期的肺癌患者Smad2基因低表達率明顯高于N0～N1期患者，腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者Smad2基因低表達率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者.Smad2基因表達情況在不同性別、年齡、吸煙史、T分期、M分期的肺癌患者間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05).見表4.

表4 Smad2基因表達與肺癌患者臨床病理特征的關系

2.5 Smad2基因表達與肺癌患者術后生存時間和生存率的關系

Smad2基因低表達肺癌患者術后生存時間明顯短于 Smad2基因過表達患者(P<0.01)；Smad2基因低表達肺癌患者術后3 a生存率、5 a生存率均明顯低于Smad2基因過表達患者(P<0.01).Kaplan-Meier曲線分析顯示：隨著Smad2基因表達增加，肺癌患者的院內累積生存率逐漸降低；經(jīng)Log-rank法檢驗，不同Smad2基因表達水平的肺癌患者5 a生存率之間差異顯著(χ2=53.948，P<0.001).見表5、圖4.

表5 Smad2基因表達與肺癌患者術后生存時間和生存率的關系

圖4 Smad2基因表達與肺癌患者術后生存情況Kaplan-Meier曲線

2.6 Smad2基因表達對人肺癌細胞A549增殖、遷移和侵襲能力的影響

人肺癌細胞A549增殖能力、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)在各組間比較差異顯著(P<0.01)；其中，Smad2過表達組細胞增殖能力、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)明顯低于對照組，Smad2低表達組細胞增殖能力、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)明顯高于對照組和Smad2過表達組.見表6.

表6 Smad2基因表達對人肺癌細胞A549增殖、遷移和侵襲能力的影響

3 討 論

人Smad2基因能夠編碼467個氨基酸，其轉錄生成的Smad2蛋白是TGF-β調節(jié)轉錄和細胞增殖應答的重要級聯(lián)因子，也是TGF-β/Smad信號通路中的主要傳導分子，受上游和下游多個活性因子的共同調控，其活性改變能夠影響細胞結構、細胞周期的改變[9].TGF-β/Smad信號通路功能復雜，對不同條件下腫瘤細胞的增殖、分化具有不同的調節(jié)作用，與腫瘤發(fā)生與發(fā)展密切相關[10].相關研究[11-12]顯示，Smad2基因表達可能與胃癌、骨髓增生性疾病、肺動脈高壓等疾病明顯相關.其中，胃癌組織中Smad2基因表達水平明顯下調，骨髓增生性疾病中Smad2的mRNA低表達，肺組織中Smad2基因突變與肺動脈高壓的發(fā)生與發(fā)展密切相關[13].但目前關于Smad2基因在肺癌發(fā)生、進展中作用的研究仍十分少見，尤其是對肺癌患者術后生存和標志物篩查的研究還未見報道.

本研究結果顯示：肺癌組織中Smad2的mRNA和蛋白表達水平明顯高于癌旁正常組織；人肺癌細胞A549中Smad2的mRNA和蛋白表達水平明顯高于人正常肺上皮細胞BEAS-2B；且隨著3-甲基膽蒽誘導人正常肺上皮細胞BEAS-2B惡性轉化過程傳代數(shù)的增加，Smad2基因表達水平呈逐漸下降趨勢，提示Smad2基因可能參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展過程.進一步使用Smad2基因過表達載體和干擾載體轉染人肺癌細胞A549，結果顯示：Smad2過表達抑制了細胞增殖、遷移、侵襲能力，Smad2低表達促進了細胞增殖、遷移、侵襲能力，提示Smad2基因可能是肺癌的候選抑癌基因.相關研究[14]顯示：胃癌患者胃黏液中Smad2基因與慢性胃炎患者胃黏液相比呈明顯的高甲基化，使用去甲基化藥物處理胃癌細胞后，Smad2基因表達明顯上調，提示其在胃癌中可能受甲基化調控.目前，關于Smad2基因可能產(chǎn)生的抑癌表型信號通路和調控的下游基因的研究較為少見.在Smad家族其他基因的相關研究[15]中發(fā)現(xiàn)：Smad1、Smad5缺失會誘發(fā)小鼠性腺細胞轉移瘤，其機制可能與影響B(tài)MP/Smad1/Smad5信號通路、抑制內皮細胞遷移相關.結合本研究結果可推測，Smad2基因在肺腺癌病情進展中可能受甲基化調控，通過與BMP、TGF等多種因子相互作用而發(fā)揮抑癌活性.

相關研究[16]顯示：Smad2的mRNA表達在鑒別正常組織和腫瘤組織方面具有較高的敏感度和特異度，說明Smad2在惡性腫瘤的診斷和預后評估方面可能具有一定的價值.本研究結果顯示：N2～N3期、Ⅲ～Ⅳ期的肺癌患者Smad2基因低表達率明顯高于N0～N1期、Ⅰ～Ⅱ期的患者.提示Smad2基因表達水平與肺癌腫瘤分期密切相關，這可能對患者術后生存情況評估具有一定的參考價值.Smad2基因低表達肺癌患者術后生存時間、3 a生存率、5 a生存率均明顯低于Smad2基因過表達患者，進一步證實了Smad2基因低表達是肺癌不良預后的危險因素，可用于肺癌患者的術后生存預測.

綜上所述，Smad2基因是肺癌的一個潛在抑癌基因，其表達與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和術后生存密切相關，可成為肺癌診治的生物標志物.因此，在今后的研究中有必要進一步探討Smad2基因在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機制，為肺癌的預防、診斷和治療提供更多依據(jù).