聚乙烯、聚丙烯微塑料致雄性小鼠生殖毒性的聯(lián)合效應(yīng)

王洪艷，李 環(huán)，張 晶

(北華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林 132013)

環(huán)境污染在誘發(fā)男性不育中起著重要作用，微塑料作為一種新型污染物近年來受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注.微塑料(MPs)是粒徑小于5 mm的塑料碎片，研究[1-3]表明：在海洋、河流、空氣、飲用水、食物中均可檢測(cè)到MPs，近年來在人類糞便樣本中也發(fā)現(xiàn)了MPs的蹤跡[4]，MPs的廣泛污染及其對(duì)人體健康的影響已不容忽視.微塑料的主要組成成分為聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、聚酯類(PET)等聚合物.目前，MPs對(duì)生物體影響的研究多集中于水生生物或探討單一種類微塑料的毒性作用[5-6]，在實(shí)際生活中常常是多種微塑料物質(zhì)同時(shí)接觸機(jī)體，對(duì)各物質(zhì)間聯(lián)合效應(yīng)的研究更具有實(shí)際價(jià)值.本研究選擇PE、PP兩種常見的微塑料成分作為受試物，探討二者對(duì)雄性小鼠生殖功能的聯(lián)合毒性效應(yīng).

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

PE、PP粉末過100目網(wǎng)篩后，制成粒徑小于150 μm的微塑料(廣東勝浩塑膠原料有限公司)；小鼠血清黃體生成素(LH)、卵泡刺激素 (FSH)、睪酮(T)放免試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、總蛋白(TP)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；WLJY-9000 彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)(北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司).

1.2 微塑料聯(lián)合染毒動(dòng)物模型建立

清潔級(jí)6周齡C57BL/6雄性小鼠(吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)2010-0005)32只.適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境1周后隨機(jī)分為4組：陰性對(duì)照組、微塑料PE染毒組、微塑料PP染毒組及微塑料PE和PP聯(lián)合染毒組.微塑料組喂飼添加1%PE或/和1%PP的塑料顆粒飼料.對(duì)照組喂飼正常飼料.連續(xù)喂養(yǎng)60 d后稱重，各組小鼠眼球取血，室溫靜置后2 500 r/min離心15 min，取血清，置4 ℃冰箱保存.脊髓脫臼處死動(dòng)物后，取睪丸稱重，并計(jì)算睪丸臟器系數(shù).

1.3 小鼠精子質(zhì)量分析

取小鼠雙側(cè)附睪，用預(yù)熱的生理鹽水清洗后放入盛有適量37 ℃生理鹽水的平皿中，將附睪縱向剪1～2刀，溫育1～2 min，制備精子懸液.將精子懸液滴加到預(yù)溫的精子計(jì)數(shù)板上，應(yīng)用WLJY-9000型精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)行精子質(zhì)量分析.取4個(gè)視野，于2 min內(nèi)完成檢測(cè).檢測(cè)指標(biāo)包括精子密度 (1×106個(gè)/mL)、精子活力(%)、總畸形率(%).

1.4 小鼠血清性激素水平檢測(cè)

各組小鼠血清中睪酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)的含量采用ELISA試劑盒檢測(cè)，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作.

1.5 睪丸組織氧化指標(biāo)測(cè)定

每只小鼠取單側(cè)睪丸組織，放入置于冰水的玻璃勻漿管中，加入9倍體積的生理鹽水，用組織勻漿機(jī)(2 500 r/min)上下移動(dòng)將組織研磨均勻，制成10%的組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液低溫保存.按照試劑盒說明書分別測(cè)定上清液中總蛋白濃度、MDA含量及CAT、SOD活性.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 微塑料對(duì)小鼠體質(zhì)量、睪丸質(zhì)量及睪丸臟器系數(shù)的影響

喂飼60 d后，微塑料單獨(dú)及聯(lián)合染毒組小鼠體質(zhì)量、睪丸質(zhì)量、睪丸臟器系數(shù)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).見表1.

表1 各組小鼠體質(zhì)量、睪丸質(zhì)量及臟器系數(shù)

2.2 微塑料對(duì)小鼠精子質(zhì)量的影響

與對(duì)照組比較，PE和PP單獨(dú)染毒組的精子密度和精子活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在精子畸形率方面則表現(xiàn)為增高(P<0.05)；PE+PP聯(lián)合組精子密度和精子活力下降(P<0.05)，精子畸形率增加(P<0.05)；聯(lián)合染毒組各指標(biāo)與單獨(dú)染毒組比較差異顯著(P<0.05).見表2.

表2 各組小鼠精子密度、精子活力和精子總畸形率

聯(lián)合作用析因分析表明：微塑料PE和PP聯(lián)合喂食后對(duì)小鼠精子密度(F=4.767，P=0.038)、精子活力(F=4.400，P=0.045)的影響存在交互作用.圖1、圖2所示：兩條量-效曲線隨劑量增加而遠(yuǎn)離，提示微塑料PE和PP聯(lián)合喂食可使小鼠精子密度減少(精子活力降低)，具有協(xié)同作用，即二種微塑料聯(lián)合喂食引起的精子密度減少(精子活力降低)作用要大于各自單獨(dú)喂食時(shí)引起的精子密度減少(精子活力降低)作用之和.

圖1 微塑料PE和PP聯(lián)合染毒精子密度分析

圖2 微塑料PE和PP聯(lián)合染毒精子活力分析

2.3 微塑料對(duì)小鼠血清生殖激素的影響

與對(duì)照組比較，聯(lián)合組小鼠血清睪酮(T)、黃體生成素(LH)下降，卵泡刺激素(FSH)上升(P<0.05)；單獨(dú)染毒組與對(duì)照組比較，除FSH水平上升外(P<0.05)，其他激素水平差異不顯著(P>0.05)；與單獨(dú)染毒組比較，聯(lián)合染毒組作用更明顯(P<0.05).聯(lián)合作用析因分析表明：微塑料PE和PP聯(lián)合應(yīng)用后在降低睪酮(F=4.278，P=0.048)生成方面存在協(xié)同作用.見表3.

表3 各組小鼠血清生殖激素水平

2.4 微塑料對(duì)小鼠睪丸組織氧化應(yīng)激作用

微塑料單獨(dú)及聯(lián)合染毒均可降低睪丸組織SOD、CAT的活性，增加MDA的含量，與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，而且聯(lián)合染毒組比單獨(dú)染毒組作用更明顯(P<0.05).析因分析表明：微塑料PE和PP聯(lián)合使用后在升高M(jìn)DA(F=6.438，P=0.017)含量方面存在協(xié)同作用.見表4.

表4 各組小鼠睪丸組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)

3 討 論

許多毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)[7-10]已證實(shí)：MPs對(duì)海洋和淡水動(dòng)物的健康有不利影響，可導(dǎo)致受試水生物發(fā)生代謝改變、生長(zhǎng)受阻、內(nèi)分泌紊亂、生殖能力降低、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、發(fā)育異常和細(xì)胞死亡等.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[11-12]表明：MPs經(jīng)口吸收后可以在肝臟、腎臟、腸道、心臟、肺、脾、睪丸等器官中積累，可能引起多器官毒性.相關(guān)研究[13-15]證實(shí)睪丸是MPs的靶器官，可導(dǎo)致血睪屏障破壞、睪丸臟器系數(shù)降低、小鼠精子數(shù)量和活力下降、精子畸形率升高等毒性作用.本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，微塑料PE、PP無論是單獨(dú)還是聯(lián)合染毒，對(duì)小鼠的體質(zhì)量、睪丸質(zhì)量、睪丸臟器系數(shù)影響不明顯，這與文獻(xiàn)報(bào)道[16]不符，分析原因可能是由于染毒微塑料種類、粒徑大小、劑量、染毒途徑、染毒周期以及模型鼠屬性不同所致.精子質(zhì)量分析顯示：微塑料PE、PP聯(lián)合染毒在減少小鼠精子密度、降低精子活力方面具有協(xié)同作用，在增加精子畸形率上雖無交互作用，但單獨(dú)染毒與聯(lián)合染毒組都可使精子畸形率升高，精子質(zhì)量降低.

為進(jìn)一步闡明微塑料對(duì)雄性動(dòng)物生殖的影響，本研究又通過分析下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)反饋回路中雄性生殖激素的分泌情況以揭示微塑料對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸的影響.精子發(fā)生依賴于FSH、LH和T的比例，垂體促性腺激素細(xì)胞受到下丘腦中促性腺激素釋放激素(GnRH)的刺激，后者釋放LH和FSH，LH和FSH能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物的精子發(fā)生[17].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，PE+PP聯(lián)合染毒組小鼠血清LH、T的濃度顯著降低，F(xiàn)SH水平升高(P<0.05).聯(lián)合作用分析結(jié)果顯示：微塑料PE、PP聯(lián)合應(yīng)用后具有協(xié)同減低血清中T濃度的作用，從而降低睪丸的精子發(fā)生功能，與聯(lián)合染毒組精子密度結(jié)果協(xié)同減少相符合.SUN L等[18]也證明了微塑料導(dǎo)致的生殖中斷是由于促性腺激素釋放激素的正常功能受到干擾.由于HPG軸主要控制生殖系統(tǒng)的功能，因此，微塑料聯(lián)合作用誘導(dǎo)的血清睪酮水平的變化可能是由于HPG軸受到干擾而發(fā)生的.

氧化應(yīng)激是男性不育的主要原因之一，可誘導(dǎo)睪丸生殖毒性[19].CAT、 SOD的活性間接反映了機(jī)體清除活性氧(ROS)的能力，MDA是細(xì)胞內(nèi)氧化損傷積累的脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量可以間接反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度和ROS對(duì)組織細(xì)胞的損傷程度.本研究中，微塑料PE、PP單獨(dú)或聯(lián)合染毒均可誘導(dǎo)小鼠睪丸脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 MDA 的形成，并抑制抗氧化酶 CAT 和 SOD 的活性.CAT抗氧化酶是機(jī)體抗氧化損傷的第一道防線，它通過減少 ROS 的產(chǎn)生而保護(hù)DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)免受損害.SOD 酶將超氧自由基催化為 H2O2和O2，通常情況下，抗氧化酶可以消除由ROS產(chǎn)生的毒性.當(dāng)ROS過度產(chǎn)生時(shí)，超過機(jī)體抗氧化系統(tǒng)能力，就會(huì)導(dǎo)致氧化損傷.睪丸對(duì)ROS特別敏感，有研究[20]報(bào)道，5 mm的微塑料就可引起小鼠睪丸發(fā)生氧化應(yīng)激.ROS的過量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致精子膜的黏度和滲透性的破壞，同時(shí)還可影響精子細(xì)胞的線粒體，使ATP的生成減少，從而損害鞭毛的功能，導(dǎo)致精子活動(dòng)力下降[21].本研究析因統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明：聯(lián)合染毒組的氧化損傷效應(yīng)明顯高于單獨(dú)染毒組和對(duì)照組(P<0.05)，微塑料PE、PP在升高M(jìn)DA水平上具有協(xié)同作用，氧化應(yīng)激結(jié)果與聯(lián)合組使精子活力協(xié)同降低結(jié)果相一致.說明微塑料PE、PP共同作用是通過降低抗氧化酶系統(tǒng)的活性使睪丸組織中蓄積更高水平的ROS，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激性睪丸毒性，降低了精子質(zhì)量.

綜上所述，微塑料PE、微塑料PP在降低精子數(shù)量和精子活力、增加睪丸組織MDA含量、降低睪酮生成方面存在協(xié)同作用，可導(dǎo)致雄性小鼠的生殖損傷，初步認(rèn)為其機(jī)制與氧化應(yīng)激及干擾生殖內(nèi)分泌功能有關(guān)，但具體的相關(guān)協(xié)同機(jī)制還需進(jìn)一步探討.

致謝：本文是國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(201910201025)研究成果的一部分，公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)2016級(jí)錢鴻昊、2017級(jí)劉天祥同學(xué)參加了本實(shí)驗(yàn)研究工作.