北五味子多糖對(duì)人膀胱癌細(xì)胞體外增殖和凋亡作用的研究

孫紅霞，劉春旭，安學(xué)俊，崔光華，王靖宇，佟雙喜，楊曉秋

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013，2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)位列第一的惡性腫瘤，膀胱癌在臨床上的治療方法主要為經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)(TUR-Bt)，但術(shù)后5 a復(fù)發(fā)率高達(dá)60%～70%，且有25%左右的患者復(fù)發(fā)后會(huì)進(jìn)展為浸潤(rùn)性膀胱癌[1].臨床上為防止患者術(shù)后復(fù)發(fā)，常輔以膀胱灌注(免疫抑制劑或化療藥物)，但均存在不同程度的全身或局部毒副反應(yīng)，且仍有20%左右的患者雖經(jīng)膀胱灌注治療但腫瘤仍會(huì)復(fù)發(fā)[2].而根治性膀胱切除術(shù)加尿流改道術(shù)后仍有高達(dá)50%的患者可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，且對(duì)轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者采用的化療方案療效不能持久，患者5 a生存率僅為20%～40%[2].鑒于目前膀胱癌灌注藥物及化療藥物療效的不穩(wěn)定性及其顯著的毒副作用，尋找安全有效、來(lái)源于天然產(chǎn)物的抗腫瘤藥物是近年來(lái)腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn).

五味子為木蘭科多年生落葉木質(zhì)藤本植物，五味子多糖(SCP)是從五味子中提取出來(lái)的，具有多種生物學(xué)活性，如保肝、增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等作用，特別是其抗腫瘤活性日益受到廣泛關(guān)注[3-5]，SCP抗腫瘤作用已經(jīng)明確，但有關(guān)其抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的作用迄今國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道.鑒于課題組前期篩選五味子功效成分時(shí)觀察到其可能對(duì)膀胱癌有一定抑制作用，但未做深入研究，因此，本實(shí)驗(yàn)擬觀察SCP對(duì)體外生長(zhǎng)膀胱癌細(xì)胞的抑制作用并探討其作用機(jī)制，為五味子深度開(kāi)發(fā)利用和探索研制抗膀胱癌作用的中藥新藥提供藥理學(xué)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材 料

北五味子多糖由吉林省五味子開(kāi)發(fā)及產(chǎn)業(yè)化科學(xué)研究中心制備.首先通過(guò)超臨界CO2流體萃取，將北五味子中水溶性成分和脂溶性成分分離，然后利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、高加速度、強(qiáng)烈空化效應(yīng)及攪拌作用，經(jīng)超聲波預(yù)處理40 min后進(jìn)行浸提，再經(jīng)酶法與三氯乙酸結(jié)合脫蛋白得北五味子粗多糖，提取率為77.6%，純度可達(dá)50%以上.

人膀胱癌T24細(xì)胞株(上?；鄯f生物科技有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(批號(hào)：12100046，Gibco公司，美國(guó))；胎牛血清(批號(hào)：SH30396.03，Hyclone公司，美國(guó))；胰蛋白酶 (批號(hào)：25200-056，Gibco公司，美國(guó))；MTT(批號(hào)：11465007001，Sigma公司，日本)；Annexin V-FITC流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：E-CK-A111，武漢伊萊瑞特生物科技公司)；β-actin(批號(hào)：sc-69879)、PTEN(批號(hào)：sc-377573)、PI3K、p-PI3K(批號(hào)：sc-365290)、AKt、 p-Akt(批號(hào)：sc-5298)、一抗鼠抗人、二抗兔抗鼠(Santa cruz公司，美國(guó))；CO2培養(yǎng)箱(BBD6220，Hyclone公司，美國(guó))；酶標(biāo)儀(MR-96A，武漢邁瑞科技有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(Avanti J-15R，貝克曼公司，美國(guó))；凝膠成像系統(tǒng)(Invitrogen，E-Gel Imager，Hyclone公司，美國(guó))；奧林巴斯倒置顯微鏡(CKX53，奧林巴斯株式會(huì)社，日本)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人膀胱癌細(xì)胞T24細(xì)胞株在含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃，含5%CO2細(xì)胞的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞均為接種后24 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞.

1.2.2 分組及處理

實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組和SCP 50、100、200 μg/mL 3個(gè)不同劑量實(shí)驗(yàn)組.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24細(xì)胞3×104/mL 接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24 h后加入不同濃度的 SCP(50、100、200 μg/mL)，作用48 h后胰酶消化、離心，將細(xì)胞懸浮于磷酸鹽緩沖液(PBS)中備用.

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膀胱癌T24細(xì)胞，用胰酶消化后，以4×103/孔接種于96孔板培養(yǎng)24 h，然后加入SCP，使其終濃度分別為0(即未加藥)、50、100、200 μg/mL；培養(yǎng)0(即細(xì)胞接種于96孔板24 h后)、48 h后，再加入5 mg/mL MTT，20 μL/孔，孵育4 h，棄上清液；加DMSO 150 μL/孔，避光振蕩10 min.同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)吸光度OD490nm值.細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算：抑制率(IR)=[1-(A值(實(shí)驗(yàn)孔)-A值(空白孔))/(A值(對(duì)照孔)-A值(空白孔)]×100%.

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

SCP作用24 h后，收集空白對(duì)照組和SCP不同濃度組的T24細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液.用PBS洗滌1次，細(xì)胞沉淀用預(yù)冷的70%乙醇在-20 ℃固定過(guò)夜.取固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次并懸浮之，加入終濃度為50 mg/L的核糖核酸酶A(RNaseA)36 ℃水浴30 min，再加入800 μL碘化丙啶(PI)染液至終濃度為50 mg/L，搖勻后4 ℃避光靜置30 min，200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾.應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及凋亡情況，低于G1期DNA含量細(xì)胞為凋亡細(xì)胞.

1.2.5 Hoechst 33258熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T24細(xì)胞按3×105/孔接種于6孔板，細(xì)胞貼壁融合60%～70%后，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入SCP使其終濃度分別為0(空白對(duì)照組)、50、100、200 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入0.5 mL固定液，10 min后去固定液，用PBS洗2次，加入0.5 mL Hoechst33258染色液，避光染色5 min.在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)(激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm)，了解細(xì)胞凋亡情況.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.6 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集不用濃度SCP處理48 h的T24細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)后BCA法測(cè)定其總蛋白含量.分別取各組40 μg總蛋白上樣，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入適量稀釋的Bax、 Bcl-2 (1∶1 000)、 cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、β-actin (1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗(1∶500)，室溫下?lián)u蕩孵育2 h；采用ECL發(fā)光液發(fā)光，與發(fā)光試劑充分反應(yīng)后，應(yīng)用分析軟件分析各顯影條帶的A值(p-Akt與Akt的比值)、各目標(biāo)蛋白與β-actin的比值.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)SCP對(duì)細(xì)胞增殖及抑制率的影響

不同劑量的SCP均能抑制T24細(xì)胞的OD值，SCP干預(yù)后，OD值呈下降趨勢(shì)，SCP作用后OD值與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05及P<0.01).SCP各組抑制率分別為18.69%、39.13%及64.76%.見(jiàn)表1.

表1 MTT法檢測(cè)SCP對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.2 倒置顯微鏡下觀察T24細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變

使用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化.在用SCP 50、100、200 μg/mL處理前列腺癌T24細(xì)胞24 h后，直接置于顯微鏡下觀察，可見(jiàn)處理后的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞體積縮小、皺縮、變圓，與周圍細(xì)胞脫離，死細(xì)胞呈明亮的圓形，與對(duì)照組比較，活細(xì)胞數(shù)量明顯減少.見(jiàn)圖1.

圖1 SCP對(duì)膀胱癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響(×40)

2.3 FCM檢測(cè)SCP對(duì)細(xì)胞周期分布(凋亡峰)的影響

前列腺癌T24細(xì)胞經(jīng)SCP不同濃度處理48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)可見(jiàn)在G1期峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰，說(shuō)明不同濃度SCP能引起T24細(xì)胞的凋亡，SCP 3個(gè)組的細(xì)胞凋亡率分別為28.73%、38.35%和60.52%，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05).同時(shí)，SCP高劑量組影響了T24細(xì)胞的生長(zhǎng)周期分布，G0/G1期的T24細(xì)胞最高達(dá)80.71%，與對(duì)照組比較，T24細(xì)胞G0/Gl期的細(xì)胞數(shù)目明顯增多，而S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)目減少，即SCP使T24細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯在G0/G1期，從而誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生.見(jiàn)圖2.

組別與對(duì)照組比較，*.P<0.05，#. P<0.01.

2.4 Hoechst 33258熒光法檢測(cè)SCP對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響

熒光顯微鏡下可以清晰地觀察到細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的固縮與斷裂，呈現(xiàn)出典型的細(xì)胞凋亡學(xué)形態(tài)特征.圖3 b、d可看到固縮的細(xì)胞核，細(xì)胞核皺縮是細(xì)胞凋亡最明顯的特征之一，SCP能夠使T24細(xì)胞核嚴(yán)重皺縮，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.與對(duì)照組比較，SCP干預(yù)組隨劑量增加出現(xiàn)凋亡數(shù)目的細(xì)胞明顯增多(P<0.05).見(jiàn)圖3.

圖3 Hoechst 33258 熒光染色觀察SCP對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響(×400)

2.5 WB檢測(cè)SCP對(duì)凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，各給藥干預(yù)組Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸減少，Bax蛋白表達(dá)逐漸增加(P<0.05)；與空白對(duì)照組比較，cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9的蛋白表達(dá)量隨SCP劑量增加而逐漸增加(P<0.05)，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系.見(jiàn)圖4(a、b、c、d、e).

圖4 Western blot檢測(cè)SCP對(duì)Bcl-2，Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，占我國(guó)泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率的第一位，2014年統(tǒng)計(jì)顯示其發(fā)病率為6.61/10萬(wàn)，在惡性腫瘤發(fā)病率中占第九位[6-8].流行病學(xué)研究[9]表明：化學(xué)致癌物是膀胱癌的致病元兇，如存在于煙草中的芳香胺類化合物等，與膀胱癌相關(guān)的癌基因有H-Ras、BcL-2、c-erbB-2等[9]，與膀胱癌細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因主要有死亡受體基因家族、Bcl-2基因家族、Caspase基因家族.Bcl-2基因家族包括Bad、Bcl-2、Bcl-xL等基因，有些基因具有抗凋亡作用，如Bcl-2等；有的基因具有促凋亡作用，如Bax等.Bax與Bcl-2的功能相反，Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白.Bcl-2蛋白和Bax蛋白能夠形成二聚體，這兩種蛋白的比值調(diào)控細(xì)胞的凋亡，Bcl-2/Bax比值增高時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，比值降低時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡.

細(xì)胞凋亡途徑有線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、死亡受體途徑.Caspase家族(cysteinyl aspeantate-specific proteinase family)是指一群含有半胱氨酸的蛋白酶，在凋亡執(zhí)行過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，而且細(xì)胞凋亡的過(guò)程實(shí)際上是Caspase被活化并發(fā)生凋亡蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10].半胱氨酸蛋白酶家族有14 名成員，Caspase-3、9均參與細(xì)胞凋亡，Caspase介導(dǎo)凋亡的第一個(gè)途徑是線粒體途徑，涉及Caspase-9，這一過(guò)程需要Caspase-9的激活[11-13]，Caspase-3處于細(xì)胞凋亡的下游，是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的酶之一，是凋亡的終結(jié)執(zhí)行者之一.Caspase-3 是參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，通常情況下，Caspase-3以沒(méi)有活性的酶原形式(pro-Caspase-3)存在于胞漿中.凋亡發(fā)生時(shí)，pro-Caspase-3被激活，表現(xiàn)為激活型，即cleaved Caspase-3.有研究[14-15]表明，Caspase-3與Bcl-2相互作用促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生.

五味子是我國(guó)常用的一種傳統(tǒng)中藥，有多種生物學(xué)活性.SCP是五味子作用的主要成分之一，主要組成成分有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖等.本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SCP能夠抑制膀胱癌細(xì)胞的體外增殖作用，3種劑量的SCP干預(yù)作用結(jié)果與對(duì)照組比較，差異明顯(P<0.05).形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示：SCP作用后，能明顯地誘導(dǎo)T24細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，出現(xiàn)細(xì)胞核固縮或胞質(zhì)化，與后面的促凋亡結(jié)果相一致.細(xì)胞周期是反映細(xì)胞增殖是否活躍的指標(biāo)，SCP作用后，可使細(xì)胞S期比例減少，G0/G1期比例增加，G2/M相應(yīng)下降，說(shuō)明SCP能夠阻止T24細(xì)胞的增殖作用.SCP誘導(dǎo)凋亡峰值出現(xiàn)，凋亡率明顯升高，與對(duì)照組比較有明顯差異(P<0.05).凋亡是由一系列凋亡基因參與的過(guò)程，其中Bax、Bcl-2在凋亡過(guò)程中起重要作用，Bax、Bcl-2相互作用改變線粒體膜通透性，促進(jìn)CytC釋放，激活Caspase-9啟動(dòng)凋亡進(jìn)程，進(jìn)而激活Caspase-3[16-17].本研究結(jié)果顯示：SCP能夠明顯升高促凋亡基因Bax蛋白表達(dá)，降低Bcl-2抗凋亡基因蛋白表達(dá)，使二者比例發(fā)生改變，起到促進(jìn)凋亡作用.作為Caspase-9的下游基因，與Caspase-3共同參與了線粒體的凋亡途徑，即Caspase-9激活了Caspase-3，再通過(guò)ROCK啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生.作為Akt的下游信號(hào)，Caspase-9、Caspase-3在凋亡中的作用十分關(guān)鍵，SCP能夠促進(jìn)二者的激活，使cleaved Caspase-9和cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)增加，最終啟動(dòng)T24細(xì)胞凋亡.

因此，SCP能夠抑制T24細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，其作用可能與激活促凋亡基因Caspase-3和Caspase-9啟動(dòng)凋亡過(guò)程，促進(jìn)下游基因bcl-2活化，SCP通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用最終抑制癌癥的發(fā)生.