副豬嗜血桿菌血清7型菌株的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

王治方，朱文豪，徐引弟，張青嫻，焦文強(qiáng)，李海利，王克領(lǐng)

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002）

副豬嗜血桿菌是當(dāng)前規(guī)模化豬場主要的細(xì)菌性病原，是一種革蘭氏陰性、需NAD的多形態(tài)細(xì)小桿菌，可長期寄生于健康豬的上呼吸道中，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)，可使各年齡、品種的豬只感染發(fā)病，4～8周齡的保育仔豬發(fā)病率、死亡率相對(duì)較高，臨床常表現(xiàn)多發(fā)性纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等病理特征，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。

副豬嗜血桿菌致病機(jī)制非常復(fù)雜，通常認(rèn)為與菌株攜帶的毒力基因有密切關(guān)系。副豬嗜血桿菌已鑒定出15個(gè)血清型，還有20%左右的臨床分離菌株用現(xiàn)有方法無法分型，不同血清型菌株的毒力及致病性存在較大差異，同一血清型不同分離菌株的致病力也有一定差異，發(fā)病情況也有一定的不同[3]。因此，開展副豬嗜血桿菌臨床分離菌株生物學(xué)特性的研究，對(duì)該病綜合防控具有重大意義。

2021年5月，河南省三門峽某豬場一棟保育豬出現(xiàn)食欲減退、發(fā)燒、消瘦、被毛粗亂、咳嗽、呼吸困難、關(guān)節(jié)腫大或跛行等臨床癥狀，先后死亡20多頭豬只。為了確診發(fā)病原因，河南省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所傳染病研究室對(duì)送檢的發(fā)病豬只進(jìn)行了剖檢，根據(jù)剖檢情況采集了相關(guān)樣品，進(jìn)行細(xì)菌病原分離鑒定、血清型鑒定、藥敏試驗(yàn)以及毒力基因檢測，旨在為豬場臨床有效防控該病提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 病料

病料采自河南省三門峽某規(guī)?；i場瀕死期的發(fā)病保育豬，病料包括肺、氣管黏液、心血、關(guān)節(jié)液。

1.2 主要儀器及試劑

Thermo 5020 PCR擴(kuò)增儀、Thermo 1300SERIES A2生物安全柜購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；電泳儀（DYY-6型）購自北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)購自沙船（天津）生物科技發(fā)展有限公司；5418臺(tái)式高速離心機(jī)購自eppendorf公司。胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購自碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（輔酶Ⅰ，NAD）購自 Roche公司；胎牛血清、Tap PCR master mix、DL 2 000 DNA Marker、DNA提取試劑盒等 PCR 試劑購自北京擎科生物科技有限公司；基因引物由北京擎科生物科技有限公司合成。藥敏片購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

體重250 g左右的健康雄性豚鼠10只，購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 試驗(yàn)方法

2.1 病原的分離、純化

無菌將樣品接種于TSA平板（含5%的新生牛血清，1/10萬的NAD）上，放置于5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取可疑單個(gè)菌落純化，分別接種含有NAD的TSA平板和不含NAD的TSA平板上，再培養(yǎng)24～48 h后觀察菌落形態(tài)；挑取純化的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

2.2 菌株P(guān)CR鑒定及序列分析

按照DNA提取試劑盒說明書提取菌株的DNA作為模板。參照文獻(xiàn)[4-7]設(shè)計(jì)合成副豬嗜血桿菌16S rRNA基因特異性引物和副豬嗜血桿菌血清型1～15型引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司測序，對(duì)測序結(jié)果用BLAST進(jìn)行同源性比較。

表1 副豬嗜血桿菌及血清型引物序列信息

2.3 毒力基因檢測

以可疑菌株的DNA為模板，參照文獻(xiàn)[8-10]合成副豬嗜血桿菌毒力基因的引物（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，鑒定該株副豬嗜血桿菌毒力基因攜帶情況。

表2 毒力基因引物序列信息

2.4 致病性試驗(yàn)

將試驗(yàn)豚鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，5只/組。挑選純化好的單個(gè)菌落接種于TSB（含5%的新生牛血清）液體培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)備用。試驗(yàn)組豚鼠腹腔注射2.0×109濃度的菌液0.5 mL/只；對(duì)照組豚鼠腹腔注射生理鹽水0.5 mL/只。接種后仔細(xì)觀察記錄每組發(fā)病情況，對(duì)發(fā)病豚鼠做細(xì)菌分離鑒定。

2.5 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法。挑取典型菌落用生理鹽水制成濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海脺缇藓炚喝≈瞥纱龣z細(xì)菌懸液，均勻涂滿TSA平板（含5%的新生牛血清，1/10萬NAD）表面；用滅菌鑷子夾取藥敏紙片均勻有規(guī)律的貼于TSA平板上，并用鑷子輕按紙片中心，使藥敏紙片與平板培養(yǎng)基附著嚴(yán)密，置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)36 h，取出測量抑菌圈大小，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照藥敏片說明書。

判定結(jié)果分為敏感、中介、耐藥?？股厮幟羝蓄^孢噻呋、頭孢他啶、阿莫西林、青霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明、左氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、卡那霉素、阿米卡星、壯觀霉素、替米考星、阿奇霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、土霉素。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 細(xì)菌的分離、純化

37 ℃培養(yǎng)36 h后，在接種肺臟、心血的TSA平板（含5%的新生牛血清，1/10萬NAD）上均長有一種光滑、濕潤、邊緣整齊、略帶熒光、露珠樣、針尖大小的菌落。該菌株在含有NAD的TSA平板上生長良好，在不含NAD的TSA平板上不生長。革蘭氏染色鏡檢，該細(xì)菌為革蘭氏陰性、球桿狀、棒桿狀和長絲狀多形態(tài)桿菌（圖1）。

圖1 菌體形態(tài)（1 000×）

3.2 菌株鑒定和分型鑒定

用副豬嗜血桿菌16S rRNA鑒定引物和分型引物對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果分別擴(kuò)增出822 bp、490 bp兩條條帶，大小和副豬嗜血桿菌、血清7型目的條帶一致，表明該分離菌株為副豬嗜血桿菌，血清型為7型（圖2），暫命名為HNSMX1 。回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司測序，對(duì)測序結(jié)果用BLAST進(jìn)行同源性比較，該菌株與副豬嗜血桿菌vHPS7菌株（GenBank No.:CP049089）同源性高達(dá)100%。

圖2 HNSMX1菌株P(guān)CR鑒定及分型

3.3 毒力基因測定結(jié)果

通過PCR擴(kuò)增測定HNSMX1菌株的毒力基因。結(jié)果基因vta1、vta2、vta3、wza、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC、espP2為陽性（圖3）。

圖3 HNSMX1毒力基因PCR檢測結(jié)果

3.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果

在攻毒24 h后，試驗(yàn)組有2只豚鼠逐漸出現(xiàn)被毛粗亂、蜷縮發(fā)抖等癥狀；對(duì)照組豚鼠生長狀態(tài)良好，未出現(xiàn)任何臨床癥狀。攻毒5 d后，試驗(yàn)組和對(duì)照組豚鼠均未發(fā)生死亡，對(duì)試驗(yàn)組發(fā)病豚鼠進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，胸腔、腹腔有少量積液，有纖維性滲出物附著；用心血、肝臟觸片，革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)有革蘭氏陰性、長短不一的細(xì)絲狀菌體。同時(shí)無菌采集試驗(yàn)組死亡豚鼠的心血、肝臟接種TSA平板（含5%的新生牛血清，1/10萬的NAD），37 ℃培養(yǎng)30 h后，分離獲得和接種菌株相一致的單一細(xì)菌。

3.5 藥敏結(jié)果

HNSMX1菌株常規(guī)藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表3。結(jié)果可見，該菌株對(duì)頭孢噻呋、頭孢他啶、強(qiáng)力霉素、土霉素、四環(huán)素、阿奇霉素6種藥物敏感；對(duì)替米考星藥物為中介；對(duì)青霉素G、阿莫西林、氨芐西林、復(fù)方新諾明、左氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、壯觀霉素、卡那霉素、阿米卡星11種藥物耐藥。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

副豬嗜血桿菌病已經(jīng)成為當(dāng)前養(yǎng)豬行業(yè)的重要細(xì)菌性疾病之一，常常單獨(dú)發(fā)生或作為繼發(fā)病原繼發(fā)感染于病毒病之后，給養(yǎng)豬行業(yè)造成不小的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)從患病保育仔豬病料分離獲得1株病原菌，通過培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)觀察、PCR擴(kuò)增鑒定及分型鑒定，表明該株細(xì)菌為副豬嗜血桿菌，血清型為7型。通過BLAST比對(duì)，該菌株與副豬嗜血桿菌vHPS7菌株（GenBank No.:CP049089）同源性高達(dá)100%。

副豬嗜血桿菌臨床血清型較多，不同血清型菌株的毒力及致病性不同，臨床感染發(fā)病情況也不盡相同。菌株毒力的強(qiáng)弱與其攜帶的毒力因子有著直接關(guān)系，副豬嗜血桿菌毒力因子較多且尚未完全研究清楚。本試驗(yàn)篩選檢測的14個(gè)毒力基因很有可能是副豬嗜血桿菌的致病關(guān)鍵因子。通過毒力因子檢測，結(jié)果表明HNSMX1菌株攜帶vta1、vta2、vta3、wza、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC、espP2毒力基因，與張青嫻等[11]檢測報(bào)道的HPS血清7型只攜帶vta1、ompP2、nanH、espP2毒力基因有很大差異。一般情況下，毒力基因vta2、vta3、wza、cdtA、cdtB、cdtC存在于中等毒力和強(qiáng)毒力菌株中，wza基因在菌株莢膜多糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用，缺失wza基因能使HPS菌株毒力顯著降低；在體內(nèi)感染情況下，cdtA、cdtB、cdtC毒力基因均出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，是HPS菌株直接發(fā)揮細(xì)胞毒性的重要武器，而vta2、vta3毒力基因主要被致病菌株所攜帶。

抗生素對(duì)細(xì)菌性疾病的控制起著非常關(guān)鍵的作用，但由于養(yǎng)殖過程中不科學(xué)的、長期盲目濫用抗生素，臨床很多致病性細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，使得藥物的抗菌效果越來越差，不但造成藥物浪費(fèi)，而且還延誤病情，給養(yǎng)殖戶造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。HNSMX1菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對(duì)β內(nèi)酰胺類的頭孢噻呋、頭孢他啶敏感，對(duì)阿莫西林、青霉素G、氨芐西林耐藥，這和劉英玉[12]的研究結(jié)果相同。該菌株對(duì)四環(huán)素類的強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、土霉素均敏感，與王治方等[13]的研究結(jié)果一致。該菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的阿奇霉素敏感，對(duì)替米考星表現(xiàn)為中介，這可能和本場對(duì)替米考星的長期使用有關(guān)。該菌株對(duì)氨基糖苷類、磺胺類、喹諾酮類8種藥物均表現(xiàn)為耐藥。該菌株表現(xiàn)出明顯的多重耐藥現(xiàn)象，其耐藥性與先前有關(guān)報(bào)道結(jié)果既有部分相符，又有明顯差異。因此，生產(chǎn)實(shí)際中對(duì)臨床分離菌株進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確的耐藥性檢測，對(duì)防控、治療副豬嗜血桿菌病非常重要。

本試驗(yàn)從河南三門峽病例中分離獲得的HPS血清7型HNSMX1菌株，根據(jù)菌株毒力基因檢測結(jié)果、致病性試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合臨床發(fā)病情況，表明該HPS血清7型菌株有一定的毒力，在一定條件下，能夠引起豬群發(fā)病，和先前報(bào)道的HPS血清7型為無毒力菌株有一定差異，可能是部分菌株在臨床自然進(jìn)化過程中，出現(xiàn)毒力增強(qiáng)現(xiàn)象，在臨床副豬嗜血桿菌病的防控中，應(yīng)引起廣大養(yǎng)豬場的重視。