COL1A1基因在3個豬群體內(nèi)的多態(tài)性分析

吳華莉，張鶯鶯，黃 濟，涂尾龍，王洪洋，曹建國，談永松

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 閔行 201106；2.上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 浦東新區(qū) 201302）

COL1A1基因（Ⅰ型膠原α1亞基基因）是人類骨質(zhì)疏松病的重要候選基因[1]。它編碼Ⅰ型膠原蛋白的α1鏈，Ⅰ型膠原蛋白在骨骼和結(jié)締組織中含量豐富[2]。人COL1A1基因定位于17q21.33，由51個外顯子構(gòu)成[3]。人COL1A1基因多態(tài)性被證實與絕經(jīng)后婦女患骨質(zhì)疏松風險有關(guān)[4]。據(jù)報道，COL1A1基因突變與成骨不全癥、骨關(guān)節(jié)炎和軟組織損傷有關(guān)[5-7]。COL1A1基因的突變可能會影響膠原蛋白的生物合成途徑，影響細胞外基質(zhì)-受體的相互作用，因此，COL1A1可能在成骨不全癥的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[3]。COL1A1基因多態(tài)性對骨原性肉瘤患者的生存率有預后價值[8]。豬COL1A1基因序列存在突變位點，其產(chǎn)生的AA基因型的屠宰率與AG基因型的屠宰率差異顯著（P＜0.05）[9]。本研究通過檢測豬COL1A1基因突變位點在杜洛克豬、長白豬和大白豬群體內(nèi)的基因型和等位基因頻率，以及在3個豬群體內(nèi)群體遺傳學指標，期望為尋找豬生長發(fā)育和疾病方面的分子遺傳標記提供基礎數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

試驗于2021年12月至2022年2月在上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所進行。采集樣品包括92頭杜洛克豬、77頭長白豬和152頭大白豬的耳組織塊，總計321頭，來源于上海祥欣畜禽有限公司。PCR試驗所用試劑和內(nèi)切酶AluⅠ購于寶生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取采用AXYGEN基因組試劑盒提取豬耳組織DNA，測定DNA濃度，統(tǒng)一稀釋樣品濃度為50.0 ng/mL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增引物及反應條件。上游引物：5'-GCAACCTGGACGCCATCAAA-3'；下游引物：5'- TCTGGGAAGCCTCAGTGGACAT-3'[9]。PCR反應體系按照如下步驟配置： 2×Taq PCR Master Mix 27.5 μL，DNA 模板 1.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，RNase-Free ddH2O 20.5 μL，總體積為50 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，64 ℃30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 20 min。PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測試驗結(jié)果。

1.2.3 基因型分析豬COL1A1基因PCR擴增片段長度為529 bp，存在AluⅠ酶切位點。采用具有單一目的條帶PCR產(chǎn)物，進行限制性內(nèi)切酶試驗，采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。限制性內(nèi)切酶消化試驗的反應體系：PCR產(chǎn)物5 μL，10×Buffer 2 μL，AluⅠ0.5 μL， ddH2O 8.5 μL，總體積為16 μL。反應時間為1 h。豬COL1A1基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的不同基因型判定標準見表1。

表1 豬COL1A1基因酶切后的3種基因型

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

計算COL1A1基因在3個豬群體內(nèi)的基因型頻率、等位基因頻率以及合并基因型頻率，計算方法參見參考文獻[10]。采用GENEPOP 3.1軟件計算基因雜合度（Heterozygosity, He）、純合度（Homozygosity, Ho）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles, Ne）和多態(tài)信息含量（polymorphism information content, PIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-RFLP檢測

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。如圖1所示AA型為1條帶，GG型為2條帶，AG型雜合子為3條帶。根據(jù)電泳檢測結(jié)果統(tǒng)計所有樣品的基因型。

圖1 豬COL1A1基因酶切結(jié)果檢測電泳

2.2 豬COL1A1基因在3個豬群體內(nèi)的基因型頻率、等位基因頻率和群體遺傳學指標

采用PCR-RFLP技術(shù)，COL1A1基因在3個豬群體內(nèi)的多態(tài)性檢測結(jié)果見表2。COL1A1基因的基因型頻率和等位基因頻率表現(xiàn)為：在杜洛克豬群體內(nèi)檢測出AA型為主要基因型，雜合子AG基因型略少，只有少量GG基因型，A等位基因為優(yōu)勢等位基因；在長白豬和大白豬群體內(nèi)檢測AG基因型為優(yōu)勢基因型，GG基因型略少，AA基因型較少，G等位基因為優(yōu)勢等位基因。群體遺傳學指標分析結(jié)果顯示，COL1A1基因在杜洛克豬、大白豬和長白豬群體內(nèi)PIC值在0.25～0.5之間，表現(xiàn)為中度多態(tài)。

表2 COL1A1基因在3個豬群體內(nèi)的基因型頻率、等位基因頻率和群體遺傳學指標

3 討論

膠原蛋白是骨基質(zhì)中最豐富的蛋白質(zhì)，約占骨組織總蛋白質(zhì)的80%。骨基質(zhì)中膠原性質(zhì)及其相對數(shù)量的改變會影響骨組織的力學特性，增加脆性骨折的易感性。膠原蛋白由α1和α2兩條肽鏈組成，它們以2∶1的比例存在于膠原纖維中，分別由COL1A1和COL1A2（Collagen type Ⅰalpha 2）基因編碼[6]。有研究證實在COL1A1 基因中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個突變與人類疾病相關(guān)，其中大多數(shù)與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)[11]。COL1A1不僅是預測嚴重骨相關(guān)疾病的主要候選基因，而且在一般人群中也是天然骨變異的主要候選基因[12]。本試驗的研究結(jié)果顯示COL1A1基因在杜洛克豬、長白豬和大白豬群體內(nèi)呈現(xiàn)3種基因型。在杜洛克豬群體內(nèi)AA基因型為優(yōu)勢基因型，在長白豬和大白豬群體內(nèi)AG基因型為優(yōu)勢基因型，COL1A1基因在杜洛克豬、長白豬和大白豬群體內(nèi)PIC值在0.25～0.5之間，表現(xiàn)為中度多態(tài)。A等位基因頻率在杜洛克豬群體內(nèi)為優(yōu)勢等位基因，G等位基因在長白豬和大白豬群體內(nèi)為優(yōu)勢等位基因。這與楊金娥的研究結(jié)果一致[9]。豬在養(yǎng)殖過程也患有骨骼疾病，如佝僂病、軟骨病和骨質(zhì)疏松及后肢癱瘓等[13]。盡管加強飼料營養(yǎng)可以改善癥狀，但關(guān)于豬骨骼疾病與基因突變位點是否存在相關(guān)性仍需要研究。接下來可以深度挖掘豬COL1A1基因更多的突變位點，結(jié)合豬機體的生長發(fā)育指標和疾病情況，尤其是豬的骨骼代謝指標，進一步分析這些突變位點與性狀之間的相關(guān)性，從而尋求與豬骨骼疾病相關(guān)的候選基因。