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    2個(gè)重組海帶a-碳酸酐酶(CA)的酶活性比較研究

    2022-08-16 03:10:54畢燕會(huì)周志剛
    海洋科學(xué) 2022年7期
    關(guān)鍵詞:泳道水合酯酶

    王 震, 畢燕會(huì), 周志剛, 2

    2個(gè)重組海帶a-碳酸酐酶(CA)的酶活性比較研究

    王 震1, 畢燕會(huì)1, 周志剛1, 2

    (1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)遺傳資源開(kāi)發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué) 國(guó)家海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心, 上海 201306)

    為了探究海帶()a-CA1和a-CA2是否具有催化CO2的可逆水合反應(yīng)和酯酶活性, 作者通過(guò)原核表達(dá)得到這兩種a-CA的可溶性的異源重組蛋白。分別用電極法和酯酶活性檢測(cè)法來(lái)檢測(cè)重組a-CA1(ra-CA1)和ra-CA2的水合酶活性和酯酶活性, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), ra-CA1的水合酶活性(1.52±0.120 U/mg)幾乎是ra-CA2(0.54±0.046 U/mg)的3倍, 表明ra-CA1催化CO2的水合能力明顯大于ra-CA2。而兩者的酯酶活性并沒(méi)有顯著的差別(ra-CA1比活力: 0.697±0.176 U/g, ra-CA2比活力: 0.743±0.129 U/g), 說(shuō)明催化乙酸對(duì)硝基苯酯(-NPA)生成對(duì)硝基苯酚(-NP)的能力是沒(méi)有顯著差別的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)這2個(gè)a-CA為功能蛋白, 可能參與海帶無(wú)機(jī)碳吸收和儲(chǔ)存過(guò)程, 因此, 本研究為海帶無(wú)機(jī)碳吸收和儲(chǔ)存機(jī)制的解析提供了生物化學(xué)依據(jù)。

    海帶();a-碳酸酐酶(CA); 原核表達(dá); 水合酶活性; 酯酶活性

    碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA; EC 4.2.1.1)是一種金屬酶, 絕大多數(shù)是以鋅(Zn)原子作為金屬配合物, 催化CO2的可逆水合反應(yīng), 實(shí)現(xiàn)CO2與HCO3–之間的快速轉(zhuǎn)化[1-3]。CA普遍存在于包括具有光合作用的所有生物中[4], 基于保守的核苷酸序列, CA目前被分為a、b、g、d、e、z、h、q和i9個(gè)亞型[5-11]。不同亞型CA序列沒(méi)有相似性, 屬于催化功能的趨同進(jìn)化。

    早在1967年, 在孔石莼()中首次檢測(cè)到大型海藻的CA活性[12]。隨后, 對(duì)不同海域150種海藻進(jìn)行CA活性檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)CA普遍存在于這些受檢的海藻中[13]。但這些均是對(duì)藻體CA總活性或胞內(nèi)及胞外CA總活性的報(bào)道, 尚無(wú)法完成CA家族單個(gè)成員在藻體內(nèi)的活性檢測(cè)。海帶()是一種大型褐藻, 具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。通過(guò)對(duì)海帶全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組分析, 目前認(rèn)為海帶CA家族具有11個(gè)成員, 分屬a-、b-和g-CA亞型[14]。類(lèi)似地, BI等[15]成功測(cè)得海帶配子體的胞內(nèi)及胞外CA總活性, 岳國(guó)峰等[16]報(bào)道胞外CA在海帶孢子體無(wú)機(jī)碳吸收中起著主要作用。為深入研究各CA成員在海帶無(wú)機(jī)碳吸收和儲(chǔ)存中的作用, 通過(guò)分子細(xì)胞學(xué)手段, 余貞等[17]自海帶配子體細(xì)胞中, 率先報(bào)道了第1個(gè)CA的基因特征; 隨后, 利用膠體金免疫電鏡手段, YE等[18]確定了a-CA1于海帶配子體細(xì)胞的葉綠體中發(fā)揮作用; BI等[19]明確了a-CA2位于海帶配子體細(xì)胞壁中; BI等[20]證實(shí)了γ-CA位于線粒體中。這些研究為海帶無(wú)機(jī)碳富集機(jī)制解析提供了分子細(xì)胞學(xué)證據(jù), 但具體各CA在海帶內(nèi)是否發(fā)揮功能, 還需對(duì)其活性進(jìn)行鑒定。

    基于YE等[18]和BI等[19]的研究結(jié)果, 本研究首先通過(guò)原核表達(dá)獲得a-CA1和a-CA2的可溶性重組蛋白; 然后分離純化可溶性的重組a-CA1和a-CA2, 利用電極法檢測(cè)它們水合反應(yīng)活性。鑒于a-CA還能催化羧酸酯[21]的水解反應(yīng), 利用分光光度法檢測(cè)了它們的酯酶活性, 并探討抑制劑AZ對(duì)重組a-CA酯酶活性的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)。本研究的結(jié)果不僅從功能上鑒定了這2個(gè)海帶a-CA基因, 也有助于進(jìn)一步比較分析兩者的生化特性, 為海帶無(wú)機(jī)碳利用途徑的解析奠定扎實(shí)的生物化學(xué)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 生物材料

    在溫度(17±1) ℃、光強(qiáng)40mmol photons/(m2·s)和光周期16 h/8 h(光照/黑暗)條件下[22], 將海帶雌、雄配子體培養(yǎng)于PES培養(yǎng)基[23]中; 每2個(gè)星期更換1次培養(yǎng)基。將大腸桿菌()的DH5a感受態(tài)細(xì)胞及BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技(北京)有限公司)接種于Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中。

    1.2 RNA提取及cDNA合成

    采用TRIzol試劑法(Clontech公司)抽提海帶配子體總RNA, 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 合成cDNA。具體操作參照各試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。-20 ℃保存cDNA備用。

    1.3 海帶a-CA2原核表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

    將BI等[19]已經(jīng)建立并攜帶pET28a-aCA2表達(dá)載體的大腸桿菌, 通過(guò)目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS- PAGE檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)絕大部分重組的(recombinant)a- CA2(ra-CA2)是以包涵體的形式表達(dá), 不利于后續(xù)的酶活性檢測(cè)。因而, 本研究選擇了表達(dá)載體pET- 32a(上海友科生物科技有限公司)來(lái)構(gòu)建pET32a-aCA2。

    根據(jù)pET-32a多克隆位點(diǎn)的堿基序列及a-CA2基因切去信號(hào)肽所對(duì)應(yīng)的cDNA序列, 設(shè)計(jì)上游引物HEP-F(ggatccCAACGGCAGCGTGGACCCA, 小寫(xiě)字母為BamHI酶切識(shí)別位點(diǎn))和下游引物HEP-R (ctcgagTCACACTATGTAAACGGCGCGCCCG, 小寫(xiě)字母為XhoI酶切識(shí)別位點(diǎn))。用這對(duì)引物以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR以擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)程序?yàn)? 94 ℃預(yù)變性4 min; 94 ℃變性30 s, 66.7 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 35個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min。

    PCR擴(kuò)增結(jié)束后, 取20mL樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。按照PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Aidlab公司)說(shuō)明書(shū)純化PCR產(chǎn)物, 將其連接至pMD19-T克隆載體(TaKaRa公司); 然后利用熱激法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞, 用藍(lán)白斑方法篩選陽(yáng)性克隆; 通過(guò)菌液PCR進(jìn)行重組子的鑒定, 并將挑取的陽(yáng)性重組子送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因的序列分析。

    利用質(zhì)粒提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取pMD19T-aCA2和表達(dá)質(zhì)粒pET-32a, 并用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和XhoI(TaKaRa公司)將這兩種質(zhì)粒于37 ℃分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)4 h, 再將純化的目的產(chǎn)物用T4連接酶連接, 得到含目的片段的重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-aCA2。按上述同樣方法經(jīng)藍(lán)白斑篩選和測(cè)序后, 利用熱激法將測(cè)序正確并經(jīng)雙酶切驗(yàn)證的pET32a-aCA2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)宿主細(xì)胞, 得到轉(zhuǎn)基因株ET32a-aCA2/ BL21。將測(cè)序正確的菌液與20%的甘油以1︰1(v/v)的比例混勻, 凍存于-80 ℃冰箱備用。用pET-32a空載作陰性對(duì)照。

    1.4 a-CA2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與電泳檢測(cè)

    采用Ye等[18]的方法, 將攜帶重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-aCA2和空載pET-32a的菌液分別接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中, 先后進(jìn)行活化、放大培養(yǎng)至菌液的OD600值為0.6~0.8, 添加終濃度為1.0 mmol/L的異丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG), 在37 ℃下、以180 r/min的轉(zhuǎn)速誘導(dǎo)表達(dá)4 h后收集菌體, 用25 mL的1′磷酸緩沖液(PBS)(pH 8.0)重懸菌體。取50 μL重懸的全菌與2×蛋白上樣緩沖液以1︰1的比例混合, 在液氮和30 ℃水浴鍋中反復(fù)凍融3次并超聲破碎至溶液透亮; 在4 ℃下、以14 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min; 收集上清并用1′PBS按10︰1(菌液: 1′PBS)的比例重懸沉淀, 分別留樣以用于十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的檢測(cè)。

    1.5 a-CA2重組蛋白的免疫印跡

    鑒于ra-CA2是與表達(dá)質(zhì)粒pET-32a中的聚His標(biāo)簽融合表達(dá)的, 因此可以利用商用的抗聚His標(biāo)簽的特異性抗體來(lái)進(jìn)行Western印跡分析。按照陳晶等[24]的方法, 將全菌經(jīng)SDS-PAGE后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上, 以抗聚His標(biāo)簽抗體(上海友科生物科技有限公司)作為一抗, HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗作為二抗, 對(duì)融合表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。最后按增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)的說(shuō)明書(shū)顯影, 并拍照記錄。

    1.6 a-CA2重組蛋白的純化

    收集轉(zhuǎn)基因菌株pET32a-aCA2/BL21的沉淀和上清液, 經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)上清液和沉淀中都出現(xiàn)目的蛋白表達(dá)的條帶。將上清液抽濾后, 按照Bio-ScaleTMMini ProfinityTMIMAC Cartridges蛋白親和層析純化預(yù)裝柱(Bio-Rad公司)的說(shuō)明書(shū), 用含不同濃度咪唑的緩沖液(50 mmol/L KH2PO4、300 mmol/L KCl, pH 8.0)洗脫以純化ra-CA2。

    洗脫液經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后, 收集含目的蛋白的部分。先用50倍體積的20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0) 4 ℃透析12 h; 再用50倍體積的去離子水透析12 h; 最后, 在4 ℃下用PEG-20000對(duì)樣品進(jìn)行濃縮并利用BRADFORD方法[25]測(cè)定其濃度, 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.7 海帶a-CA1重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

    將YE等[18]已經(jīng)建立并攜帶pET28a-aCA1表達(dá)載體的大腸桿菌, 按上述步驟經(jīng)菌株活化、擴(kuò)培、破碎和SDS-PAGE檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)ra-CA1大部分以可溶性蛋白的形式表達(dá)在上清液中。因此, 可按上述親和層析法, 從該轉(zhuǎn)基因菌株的上清液中直接純化目的蛋白, 用于后續(xù)酶活性的檢測(cè)。

    1.8 重組a-CA的CO2水合反應(yīng)酶活性檢測(cè)

    根據(jù)Wilbur等[26]的電極法原理測(cè)定純化后ra-CA的CO2水合酶活性。在預(yù)冷的4 mL巴比妥緩沖液(pH 8.4)中加入1 mL純化后的重組蛋白溶液(1.216 mg/mL), 待pH計(jì)讀數(shù)穩(wěn)定在8.3后, 立即加入3 mL飽和的CO2水(將CO2通入到0 ℃的去離子H2O中, 持續(xù)通氣1 h以上), 記錄pH下降1個(gè)單位所需的時(shí)間, 整個(gè)反應(yīng)過(guò)程的溫度控制在0 ℃左右。以不加重組蛋白的為對(duì)照組, 測(cè)定下降一個(gè)pH單位所需要的時(shí)間, 每組3個(gè)重復(fù), 將1個(gè)酶活性單位(U)定義為(0–)/[26]; 其中,0和代表分別代表不加酶液和加入酶液后pH下降1個(gè)單位所用的時(shí)間(min); 這樣, ra-CA的比活力則以“(0-)//mg蛋白質(zhì)”來(lái)計(jì)算。

    1.9 重組a-CA酯酶活性的測(cè)定

    a-CA能將乙酸對(duì)硝基苯酯(-NPA)水解成對(duì)硝基苯酚(-NP)[27]。本研究將0.2 mL 1×PBS溶液、0.6 mL的重組蛋白(0.533 mg/mL)與0.1 mL的-NPA迅速混合以構(gòu)建酯酶反應(yīng)體系, 并利用分光光度法立即記錄下此時(shí)的OD405, 隨后每隔3 min測(cè)1次OD405。以Tris-HCl緩沖液為對(duì)照, 根據(jù)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的OD405數(shù)值變化來(lái)檢測(cè)ra-CA的酯酶活性, 每組3個(gè)重復(fù)。若1個(gè)酶活性單位(U)定義為在0 ℃下、每min產(chǎn)生1mmol的-NP[28], 那么, ra-CA的比活力即可用“(–0)×//g蛋白質(zhì)”來(lái)計(jì)算; 其中、0分別代表加酶組和對(duì)照組產(chǎn)生的-NP濃度(mmol/mL),為總反應(yīng)體積(mL),為反應(yīng)時(shí)間(min)。反應(yīng)體系中所產(chǎn)生的-NP可根據(jù)-NP濃度與OD405之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。

    1.10 抑制劑AZ對(duì)重組a-CA酯酶活性的影響

    在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 本研究在上述酯酶反應(yīng)體系中, 添加10、30、50、100、200、250及500mmol/L等不同梯度濃度的AZ, 然后每隔3 min記錄在405 nm下的吸光度。最后按上述酯酶比活力的公式計(jì)算不同梯度濃度AZ處理后的ra-CA酶活性, 并計(jì)算相應(yīng)的抑制率, 從而推算出IC50的抑制劑濃度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pET32a-aCA2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

    基于a-CA2的全長(zhǎng)cDNA序列、pMD19-T及pET-32a多克隆位點(diǎn)的序列, 設(shè)計(jì)帶酶切識(shí)別位點(diǎn)的引物HEP-F和HEP-R, 以海帶配子體的cDNA為模板, 擴(kuò)增到a-CA2的開(kāi)放閱讀框(ORF)序列, 連接至克隆質(zhì)粒pMD19-T上以構(gòu)建pMD19T-aCA2; 提取該質(zhì)粒, 用BamHI和XhoI對(duì)其及表達(dá)質(zhì)粒pET-32a分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng), 連接目的片段以構(gòu)建pET32a-aCA2。提取pET32a-aCA2, 經(jīng)BamHI和XhoI的雙酶切反應(yīng), 其產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè), 只觀察到目的基因大小(816 bp)和載體序列大小(5854 bp)的片段(圖1泳道1); 目的基因的序列分析結(jié)果進(jìn)一步表明, 已準(zhǔn)確地將a-CA2插入至表達(dá)質(zhì)粒pET-32a中。

    2.2 ra-CA2的誘導(dǎo)表達(dá)、純化和免疫印跡檢測(cè)

    將pET32a-aCA2轉(zhuǎn)化大腸桿菌, 獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。經(jīng)放大培養(yǎng)并添加IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后, 收集菌體, 反復(fù)凍融以破碎細(xì)胞, 提取分別得到上清液和沉淀中的蛋白, 經(jīng)SDS-PAGE電泳, 發(fā)現(xiàn)上清液(圖1泳道2)和沉淀(圖1泳道3)中均出現(xiàn)目的蛋白的條帶; 它的預(yù)測(cè)分子量大小為45.57 kD, 包含29.27 kD由目的基因編碼的蛋白和15.3 kD由表達(dá)質(zhì)粒pET-32a中His標(biāo)簽及多克隆位點(diǎn)堿基所編碼的多肽。由于利用表達(dá)質(zhì)粒pET-32a中的His標(biāo)簽融合表達(dá)目的蛋白, 因此, 可利用商業(yè)提供的抗聚His標(biāo)簽的抗體, 對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的總蛋白進(jìn)行Western免疫印跡。結(jié)果(圖1泳道4)顯示, 在目的蛋白大小處只出現(xiàn)單一條帶的信號(hào), 說(shuō)明該處的重組蛋白中含有His標(biāo)簽; 印跡所對(duì)應(yīng)的分子量大小約為45 kD, 與目的蛋白的預(yù)測(cè)分子量大小相符, 從而表明重組表達(dá)的就是目的基因2所編碼的蛋白。

    圖1 a-CA2原核表達(dá)載體雙酶切凝膠電泳圖及重組a-CA2表達(dá)和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE與免疫印跡圖譜

    M1.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); M2.預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn); 泳道1. 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-aCA2的雙酶切產(chǎn)物; 泳道2和3. 重組菌的上清液和沉淀部分; 泳道4. 重組菌的全菌蛋白; 泳道5-11. 經(jīng)含5、10、50、100、150、200和250 mmol/L咪唑緩沖液洗脫的產(chǎn)物

    M1.1 kb DNA Ladder Marker; M2.PageRulerTMPrestained Protein Ladder; Lane 1. Double enzyme digested products of the construct pET32a-aCA2; Lanes 2 and 3. supernatant and insoluble, respectively, fractions of the transformed bacteria; Lane 4. crude proteins of the transformed bacteria; Lanes from 5 through 11. the eluted products with a buffer solution containing 5, 10, 50, 100, 150, 200 and 250 mmol/L imidazole, respectively

    利用Bio-ScaleTM Mini ProfinityTM IMAC Cartridges蛋白親和層析純化預(yù)裝柱, 對(duì)自上清中提取的粗蛋白依次用含不同濃度咪唑的洗脫緩沖液來(lái)洗脫以純化目的蛋白。其洗脫液經(jīng)SDS-PAGE電泳和染色, 結(jié)果(圖1泳道5-11)顯示, 用含150 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫下來(lái)的蛋白, 在目的蛋白大小處只顯現(xiàn)一條帶(圖1泳道9)而無(wú)雜帶。因此, 可以利用含150 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液來(lái)純化重組的a-CA2。

    2.3 ra-CA1的誘導(dǎo)表達(dá)、純化和免疫印跡檢測(cè)

    將YE等[18]已經(jīng)建立并攜帶pET28a-aCA1表達(dá)載體的大腸桿菌, 按上述ra-CA2的方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。全菌蛋白的電泳結(jié)果顯示: 相對(duì)于未誘導(dǎo)表達(dá)的菌株(圖2泳道1), 在約34 kD處出現(xiàn)一不同的條帶(圖2泳道2); 其大小與重組a-CA1大小(30.3 kD)及目的基因上游His標(biāo)簽和多克隆位點(diǎn)等堿基編碼蛋白(2.2 kD)之和相近; 利用His標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫印跡, 結(jié)果顯示在目的蛋白大小處只出現(xiàn)一條印跡(圖2泳道5); 這些結(jié)果均表明, 該條帶即為目的蛋白條帶。轉(zhuǎn)基因菌株上清液及沉淀物的SDS凝膠電泳結(jié)果顯示,a-CA1經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后主要表達(dá)在上清液中(圖2泳道3)。按上述ra-CA2親和層析的方法純化ra-CA1; 不同濃度咪唑洗脫緩沖液的SDS凝膠電泳結(jié)果顯示, 20 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液有利于從上清液中純化到ra-CA1(圖2泳道9); 這樣就可以利用含20 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液來(lái)純化重組的a-CA1。

    2.4 ra-CA的CO2水合反應(yīng)活性

    利用上述經(jīng)親和層析純化制備的ra-CA1和ra-CA2, 分別構(gòu)建體外的CO2水合反應(yīng)(即CO2+ H2O?HCO3–+H+)體系, 經(jīng)電極法測(cè)定可知: 在不加ra-CA1的體系中, 需要約239 s的時(shí)間, pH才能自8.0下降到7.0; 但在加入ra-CA1的體系中, 只需要約84 s的時(shí)間, pH就下降到7.0; 從而表明ra-CA1具有加速CO2的水合反應(yīng)能力。經(jīng)計(jì)算可知, ra-CA1的水合反應(yīng)比活力為1.52±0.120 U/mg蛋白(3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, 以下同, 圖3)。同樣, 檢測(cè)結(jié)果表明, ra-CA2約需要140 s的時(shí)間, 使反應(yīng)體系的pH下降1個(gè)單位; 經(jīng)計(jì)算可知, ra-CA2的水合反應(yīng)比活力為0.54±0.046 U/mg蛋白(圖3), 極顯著地低于ra-CA1的CO2水合酶活性(<0.01)。

    2.5 ra-CA的酯酶水解活性

    a-CA能將p-NPA水解成p-NP, 而后者在405 nm波長(zhǎng)處具有特殊的吸收峰, 可用于p-NP的定量或定性分析。因此在a-CA酯酶活性檢測(cè)之前, 需建立p-NP量與OD405之間的關(guān)系式。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 通過(guò)檢測(cè), 作者發(fā)現(xiàn)在0.05~6mmol/L的p-NP之間, OD405與p-NP的量呈現(xiàn)正比例的線性關(guān)系, 從而建立=0.015 9+0.017 9(2=0.980 7)。該方程式中的代表OD405,代表p-NP的濃度(mmol/L)。

    圖2 ra-CA1表達(dá)和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE與免疫印跡圖譜

    M. 預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn); 泳道1. 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因菌株的全菌蛋白; 泳道2、5和6. 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因菌株的全菌蛋白; 泳道3和4. 重組菌株的上清液和沉淀部分; 泳道7. 流穿; 泳道8-12. 經(jīng)含10、20、50、200和500 mmol/L咪唑緩沖液洗脫的產(chǎn)物

    M. Prestained Protein Ladder; Lane 1: crude proteins expressed in the transgenic bacterium cultured without addition of IPTG; Lanes 2, 5 and 6. crude proteins expressed in the transgenic bacterium cultured with IPTG as an inducer; Lanes 3 and 4. soluble and insoluble fractions extracted from the transgenic bacterium after induced culture with addition of IPTG; Lane 7. Flow through; Lanes from 8 through 12. the eluted products with a buffer solution containing 10, 20, 50, 200 and 500 mmol/L imidazole, respectively

    圖3 ra-CA1和ra-CA2的CO2水合反應(yīng)及p-NPA的酯酶水解活性

    利用制備的ra-CA1和ra-CA2分別構(gòu)建體外水解p-NPA的酯酶反應(yīng)體系, 經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng), OD405值也會(huì)相應(yīng)地增加, 說(shuō)明加入的ra-CA能水解p-NPA, 使p-NPA逐漸水解從而生成p-NP。但在不添加重組蛋白的對(duì)照組中, 12 min時(shí), OD405值就不再發(fā)生明顯的變化, 表明此時(shí)這個(gè)反應(yīng)體系幾乎不產(chǎn)生新的p-NP。為此, 作者以12 min的反應(yīng)時(shí)間來(lái)計(jì)算酶促反應(yīng)的活性。

    檢測(cè)后經(jīng)計(jì)算可知, ra-CA1的酯酶比活力為0.697±0.176 U/mg; ra-CA2的酯酶比活力為0.743±0.129 U/mg, 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析, 二者差異不顯著(>0.05)。

    2.6 抑制劑AZ對(duì)ra-CA酯酶活性的影響

    在上述建立的體外酯酶反應(yīng)體系中添加不同濃度的抑制劑AZ來(lái)探究該抑制劑對(duì)ra-CA酯酶活性的影響, 結(jié)果表明當(dāng)AZ的濃度增加到250mmol/L或500mmol/L, 反應(yīng)體系中的OD405幾乎不再發(fā)生顯著變化, 說(shuō)明此時(shí)兩個(gè)重組a-CA的酯酶活性已接近完全被抑制(表1)。

    表1 不同濃度乙酰唑胺(AZ)對(duì)ra-CA酯酶活性的抑制率

    利用SigmaPlot 4.0軟件對(duì)表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸, 從而計(jì)算出ra-CA1的IC50=30.2mmol/L, ra-CA2的IC50=53.6mmol/L。由此可以看出ra-CA1對(duì)AZ的敏感度明顯高于ra-CA2。

    3 討論

    本研究根據(jù)已報(bào)道的海帶配子體a-CA1和a-CA2的cDNA序列[18, 19], 利用原核表達(dá)技術(shù), 在大腸桿菌中異源表達(dá)了這兩個(gè)a-CA的可溶性蛋白, 經(jīng)親和柱層析純化并利用純化的ra-CA構(gòu)建了體外CO2水合反應(yīng)的體系, 利用電極法檢測(cè)了它們的水合反應(yīng)活性, 這不僅從功能上鑒定了這兩個(gè)基因, 也有助于進(jìn)行兩者的功能比較并分析它們可能的生物學(xué)作用。

    本研究的結(jié)果指出, 海帶ra-CA2的水合反應(yīng)比活力為1.52 U/mg蛋白, 而ra-CA2的為0.54 U/mg蛋白(圖3)。兩者的水合反應(yīng)比活力, 雖然明顯低于衣藻周質(zhì)b-CA(比活力為4.2 U/mg)[29]和三角褐指藻()類(lèi)囊體腔q-CA(比活力為30.9 U/mg)[10], 但卻高于自生長(zhǎng)于南極冰中一種衣藻(sp. ICE-L)以及綠潮藻滸苔()經(jīng)異源重組的a-CA(比活力分別為0.437 和0.267 U/mg)[30, 31]。至于酯酶活性, 海帶ra- CA與南極冰中那種衣藻(sp. ICE-L) (0.319 U/mg[30])的結(jié)果相近。

    值得指出的是, 本研究所檢測(cè)的酶活性是攜帶His標(biāo)簽的融合蛋白, 而非海帶配子體的天然a-CA。盡管His標(biāo)簽的分子量小, 對(duì)目標(biāo)蛋白的酶活性及結(jié)構(gòu)等的負(fù)面影響較小[32], 但越來(lái)越多的研究[33]表明,它的負(fù)面影響不容忽視。同時(shí), 在ra-CA的純化過(guò)程中, 作者使用了IMAC蛋白親和層析純化預(yù)裝柱(即Ni柱); 在此過(guò)程中,a-CA的金屬輔基Zn2+有可能被Ni柱中的氨三乙酸吸附[34]。另外, 人類(lèi)a-CA的催化作用機(jī)理是目前研究最透徹的, 作者將海帶的a-CA氨基酸序列與人類(lèi)水合反應(yīng)活性很高(a-CAII)、中等(a-CAI)及很低(a-CAIII)的3個(gè)a-CA[35]作比較, 發(fā)現(xiàn), 海帶的a-CA1和a-CA2均與人類(lèi)水合反應(yīng)活性很低的a-CAIII的氨基酸序列最接近, 一致性和相似性分別為27.57%和44.40%, 及28.52%和43.35%。這些都可能是導(dǎo)致海帶ra-CA催化活性較低的原因。因此, 若進(jìn)行海帶a-CA的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究, 建議使用分離純化的天然蛋白或?qū)⑷诤媳磉_(dá)蛋白的標(biāo)簽利用蛋白酶除去。

    岳國(guó)峰等[16]曾利用AZ處理海帶雌配子體細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液的pH與對(duì)照之間沒(méi)有發(fā)生顯著變化, 說(shuō)明沒(méi)有胞外CA參與無(wú)機(jī)碳的吸收; 但最近BI等[15]自海帶配子體中檢測(cè)到胞外CA的活性。據(jù)BI等[19]報(bào)道,a-CA2因位于配子體細(xì)胞的周質(zhì)空間發(fā)揮作用, 因而屬于胞外CA。本研究自重組的a-CA2中檢測(cè)到酶活性, 不僅支持了海帶配子體胞外CA具有生物學(xué)活性的觀點(diǎn)[15], 也表明a-CA2應(yīng)對(duì)海帶配子體胞外CA的活性作出較大的貢獻(xiàn)。鑒于衣藻()[2]、硅藻(,)[3]及高等植物[36]的細(xì)胞中都存在不同類(lèi)型的胞外CA, 作者推測(cè)海帶配子體細(xì)胞也可能存在著其他類(lèi)型但目前尚未知的胞外CA, 它們的共同作用, 才能使配子體細(xì)胞的胞外CA活性達(dá)到33.92 U/g鮮質(zhì)量[15]。

    同樣, 通過(guò)本研究還可以了解到,a-CA1應(yīng)是海帶配子體胞內(nèi)CA的活性[15]的主要貢獻(xiàn)者, 因?yàn)閍-CA1位于配子體細(xì)胞的葉綠體中[18]; 但位于線粒體的g-CA[20]的貢獻(xiàn)也不能被忽視。這樣才能使海帶配子體細(xì)胞胞內(nèi)CA的活性達(dá)到36.83 U/g鮮質(zhì)量[15]。但這些胞內(nèi)、胞外CA與海帶配子體細(xì)胞吸收和利用無(wú)機(jī)碳之間存在著什么關(guān)系, 有待進(jìn)一步揭示。

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    Comparative analysis of enzyme activities of two recombinanta-carbonic anhydrases (a-CAs) of

    WANG Zhen1, BI Yan-hui1, ZHOU Zhi-gang1, 2

    (1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources Conferred by Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. International Research Center for Marine Biosciences Conferred by Ministry of Science and Technology, Shanghai 201306, China)

    In order to explore whether the two reported alpha carbonic anhydrases (a-CA1 anda-CA2) ofwere active, the soluble recombinant proteins of them expressed inwere obtained. After purification, the hydratase activity as well as esterase activity of the two recombinanta-CAs (ra-CA1 and ra-CA2) were detected. The results showed that the hydratase activity of ra-CA1 (1.52±0.120 U/mg) was almost three times higher than that of ra-CA2 (0.54±0.046 U/mg), indicating that ra-CA1exibited much higher catalytic activity for CO2hydration than ra-CA2. There was no significant difference between the esterase activities of ra-CA1 (0.697±0.176 U/g) and ra-CA2 (0.743±0.129 U/g), indicating that there was no significant difference between the two ra-CAs in catalyzing the conversion of p-nitrophenyl acetate (p-NPA) to p-nitrophenol (p-NP). The results confirmed that these twoa-CAs were functional proteins, and might participate in the process of inorganic carbon absorption and storage in. This study provided biochemical proofs for the CO2concentrating mechanism of this kelp.

    ;a-carbonic anhydrase (CA); procaryotic expression; hydration activity; esterase activity

    Jan. 5, 2022

    [National Natural Science Foundation of China, No. 41376136; The National Key R & D Program of China, No. 2018YFD0901500]

    S968.31

    A

    1000-3096(2022)07-0061-09

    10.11759/hykx20220105001

    2022-01-05;

    2022-02-23

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41376136); 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFD0901500)

    王震(1990—), 男, 山東菏澤人, 碩士研究生, 主要從事藻類(lèi)生物技術(shù)研究, E-mail: 740352930@qq.com; 周志剛(1964—),通信作者, E-mail: zgzhou@shou.edu.cn

    (本文編輯: 譚雪靜)

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