大菱鲆CD55負(fù)調(diào)控補(bǔ)體激活及其廣譜細(xì)菌結(jié)合能力

吳 蒙, 李墨非, 孫 黎

大菱鲆CD55負(fù)調(diào)控補(bǔ)體激活及其廣譜細(xì)菌結(jié)合能力

吳 蒙1, 2, 李墨非3, 孫 黎1, 2

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300387)

CD55蛋白在哺乳動(dòng)物中是一種補(bǔ)體調(diào)控因子, 但其在魚(yú)類(lèi)中的功能未知。本研究探索了大菱鲆()CD55(SmCD55)蛋白的功能。結(jié)果表明, SmCD55蛋白由344個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成, 含有一個(gè)N端信號(hào)肽和3個(gè)補(bǔ)體調(diào)控蛋白(CCP)功能域?；蛟诖罅怫叶喾N組織中均有表達(dá), 其中, 在肌肉中表達(dá)量最低, 在腦組織的表達(dá)量最高。通過(guò)原核表達(dá)獲得了重組的SmCD55(rSmCD55)蛋白, 發(fā)現(xiàn)rSmCD55蛋白能夠抑制大菱鲆血清的溶血活性和殺菌活性, 表明其負(fù)調(diào)控補(bǔ)體系統(tǒng)的激活。此外, 本研究還發(fā)現(xiàn)rSmCD55蛋白可以結(jié)合包括重要水產(chǎn)病原菌遲緩愛(ài)德華氏菌()、熒光假單胞桿菌()、鰻弧菌()、哈維氏弧菌() 和海豚鏈球菌()在內(nèi)的多種細(xì)菌, 其中與哈維氏弧菌的結(jié)合能力最強(qiáng)。以上這些研究結(jié)果豐富了魚(yú)類(lèi)補(bǔ)體系統(tǒng)的理論知識(shí), 加深了對(duì)魚(yú)類(lèi)補(bǔ)體激活調(diào)控的了解。

大菱鲆(); CD55蛋白; 補(bǔ)體激活; 細(xì)菌結(jié)合

補(bǔ)體系統(tǒng)是免疫系統(tǒng)重要的組成部分, 在先天性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。補(bǔ)體系統(tǒng)由30多種存在于血清、組織液和細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)構(gòu)成, 主要通過(guò)經(jīng)典途徑、旁路途經(jīng)和凝集素途徑這3種方式激活[2]。C3的活化是所有補(bǔ)體激活途徑中的關(guān)鍵步驟, 在3條補(bǔ)體激活途徑中共生成兩種類(lèi)型的C3轉(zhuǎn)化酶, 即經(jīng)典途徑和凝集素途徑生成的C3轉(zhuǎn)化酶為C4b2a以及旁路途徑生成的C3轉(zhuǎn)化酶C3bBb[3]。C3轉(zhuǎn)化酶進(jìn)一步激活后續(xù)的補(bǔ)體通路[4]。補(bǔ)體系統(tǒng)激活后能夠在靶細(xì)胞表面組裝形成膜攻擊復(fù)合物(MAC), 從而引起靶細(xì)胞裂解死亡[5]。在正常情況下, 補(bǔ)體系統(tǒng)通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募せ钫{(diào)控機(jī)制可以清除入侵機(jī)體的病原微生物, 但在補(bǔ)體系統(tǒng)功能失調(diào)的情況下, 補(bǔ)體系統(tǒng)的激活會(huì)危害宿主自身的健康細(xì)胞[6]。為了防止損傷自身細(xì)胞, 宿主體內(nèi)存在多種補(bǔ)體調(diào)控蛋白可以調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)的激活, 如CD55、C1抑制劑(C1INH)、CD35、CD46和CD59, 這些調(diào)控蛋白能夠防止補(bǔ)體的異常激活, 從而保護(hù)自身細(xì)胞[7]。CD55蛋白, 也被稱(chēng)為補(bǔ)體衰變加速因子(DAF), 哺乳動(dòng)物中CD55蛋白是一種大約40 kDa的細(xì)胞外糖蛋白, 通過(guò)糖基磷脂酰肌醇(GPI)連接固定在細(xì)胞膜上, 廣泛分布在不同的組織細(xì)胞表面和細(xì)胞分泌物中[8]。在哺乳動(dòng)物的研究中表明, CD55蛋白能夠通過(guò)加速C3轉(zhuǎn)化酶和C5轉(zhuǎn)化酶中C2a和Bb因子的衰變解離而抑制補(bǔ)體系統(tǒng)激活[9], 從而阻止MAC在細(xì)胞膜上的生成。CD55蛋白在體內(nèi)表達(dá)異?？梢鹱陨砻庖咝约膊? 如陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿癥[10]。另外, 細(xì)胞表面的CD55蛋白可以作為病原微生物(如致病性大腸桿菌()、幽門(mén)螺桿菌()和?？刹《?echovirus)等)感染細(xì)胞的受體[11]。目前, 針對(duì)CD55蛋白的研究主要集中在哺乳動(dòng)物中, 在硬骨魚(yú)還未見(jiàn)有相關(guān)的研究報(bào)道。

大菱鲆()是中國(guó)主要水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一, 具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究以大菱鲆CD55(SmCD55)蛋白為研究對(duì)象, 首次在硬骨魚(yú)中探究了CD55蛋白的生物學(xué)功能。作者克隆得到了基因, 檢測(cè)了基因在大菱鲆組織中的表達(dá)情況, 獲得了重組表達(dá)的SmCD55蛋白(rSmCD55), 檢測(cè)了rSmCD55蛋白對(duì)大菱鲆補(bǔ)體系統(tǒng)的激活, 探索了rSmCD55蛋白與水產(chǎn)病原菌等細(xì)菌的相互作用, 研究結(jié)果提升了我們對(duì)硬骨魚(yú)補(bǔ)體調(diào)控系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康大菱鲆(500±20 g)采購(gòu)自山東省青島市一魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖場(chǎng)。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前, 將大菱鲆在持續(xù)充氧的21 ℃水箱中暫養(yǎng)兩周。

1.1.2 菌株和培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)中所使用的菌株包括大腸桿菌、遲緩愛(ài)德華氏菌()、熒光假單胞桿菌()、鰻弧菌()、哈維氏弧菌()、海豚鏈球菌()、枯草芽孢桿菌()和藤黃微球菌()。鰻弧菌、哈維氏弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、熒光假單胞桿菌和枯草芽孢桿菌在28 ℃條件下在Luria–Bertani broth (LB) 培養(yǎng)基中培養(yǎng);和在37 ℃條件下在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng);在28 ℃條件下在Trypticase Soy Broth (TSB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

RNA提取試劑盒(FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix)和同源重組試劑盒購(gòu)自諾維贊公司; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix)購(gòu)自東洋紡公司; 克隆(DH5α)和表達(dá)(BL21)感受態(tài)大腸桿菌購(gòu)自擎科生物技術(shù)有限公司; Hank’s平衡鹽溶液購(gòu)自索萊寶公司; 脫纖維羊血紅細(xì)胞購(gòu)自貝博公司; 小鼠抗his抗體和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1基因序列分析

利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI) 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得基因的序列(登錄號(hào): XP_035488277.1)信息, 采用SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/ service.php?SignalP-5.0)進(jìn)行信號(hào)肽分析, 采用SMART在線工具進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析, 利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì), 使用MEGA軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)基因的表達(dá)

qRT-PCR方法參照以前的研究[4]。為了檢測(cè)正常生理?xiàng)l件下基因的表達(dá), 在無(wú)菌條件下, 取5條大菱鲆的鰓、肌肉、脾、頭腎、腸、血、腦、心和肝組織, 按照RNA提取試劑盒說(shuō)明提取總RNA, 使用Nanodrop測(cè)定260/280吸光度比值來(lái)檢測(cè)RNA的質(zhì)量。cDNA的合成借助東洋紡公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。采用諾維贊公司的AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR, 內(nèi)參基因選擇β-actin[12], 實(shí)驗(yàn)中所用到的引物為: β-actin-RT-F (5′-ATGGATGAGGAAATCGCTGCC-3′)、β-actin-RT-R (5′-CTCCCTGATGTCTGGGTCGTC-3′)、SmCD55-RT-F (5′-GCCAAGTGTGAAACCGTGAC-3′)、SmCD55-RT-R (5′-AGGAGGCCCAGAGTCGTATT-3′)。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL, 包括qPCR Master Mix 10 μL, 引物各1 μL, ddH2O 6 μL, 模板2 μL。采用2–ΔΔCT法分析基因的表達(dá)水平[13]。

1.2.3 SmCD55重組蛋白(rSmCD55)的表達(dá)和純化

以基因cDNA序列為模板, 用引物SmCD55-F(5′-GAACAGATTGGTGGTGGATCCATGA ACTGCCCTAAACCTCGGGCA-3′, 下劃線部分為同源臂序列)和SmCD55-R(5′-AGGTGCATATTCGATACGCGT-3′, 下劃線部分為同源臂序列)擴(kuò)增不包含信號(hào)肽(27～298位)的SmCD55胞外段。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)膠回收, 通過(guò)同源重組的方式插入表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Sumo[4]。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到克隆感受態(tài)大腸桿菌DH5a中, 然后挑選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序, 測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pEtSmCD55-Sumo。將質(zhì)粒pEtSmCD55-Sumo(表達(dá)重組蛋白rSmCD55-Sumo)和pET28a-Sumo(表達(dá)重組對(duì)照蛋白rSumo)轉(zhuǎn)化到表達(dá)大腸桿菌BL21中。重組蛋白的純化按之前報(bào)道的方法進(jìn)行[14]。將菌株接種到LB培養(yǎng)基中, 37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 添加終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-?-D-硫代半乳糖(IPTG), 于16 ℃培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)12 h后收集菌體。對(duì)菌體進(jìn)行超聲破碎, 離心后收集上清。將含有重組蛋白rSmCD55-Sumo的上清液中加入Sumo蛋白酶去除融合蛋白中的Sumo標(biāo)簽, 然后利用鎳柱純化rSmCD55蛋白。rSumo按照同樣方法純化。最后, 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法檢測(cè)純化得到的蛋白。

1.2.4 檢測(cè)rSmCD55蛋白處理后血清的溶血活性和殺菌活性

將大菱鲆血清用Hank’s平衡鹽溶液稀釋8倍、16倍和32倍, 分別與rSmCD55蛋白、rSumo蛋白或 PBS(對(duì)照)混合, rSmCD55蛋白和rSumo蛋白的終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。室溫下孵育1 h。在溶血試驗(yàn)中, 將羊血紅細(xì)胞用Hank’s平衡鹽溶液洗滌并制備細(xì)胞濃度為1×109細(xì)胞/mL的重懸液。在96孔板中, 將10 μL(約107細(xì)胞)的羊紅細(xì)胞重懸液與100 μL蛋白或PBS處理后的不同稀釋度的血清混合, 22 ℃孵育20 min, 然后離心10 min(4 000 r/min), 緩慢吸出上清并測(cè)定OD450。為方便比較, 將血清稀釋8倍時(shí)對(duì)照組的溶血活性設(shè)為100%, 以此計(jì)算其他組的溶血活性。在殺菌試驗(yàn)中, 將大腸桿菌用Hank’s平衡鹽溶液洗滌并制備濃度為1×106CFU/mL的細(xì)菌重懸液。取300 μL蛋白或PBS處理后的不同稀釋度的血清與等體積的細(xì)菌重懸液均勻混合, 室溫下孵育1 h。孵育完成后, 將混合液進(jìn)行梯度稀釋并均勻涂布到LB固體平板上, 隨后將平板倒置放置于37 ℃培養(yǎng)箱中, 12 h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。為方便比較, 將血清稀釋8倍時(shí)對(duì)照組的殺菌活性設(shè)為100%, 以此計(jì)算其他組的殺菌活性。

1.2.5 檢測(cè)rSmCD55蛋白結(jié)合細(xì)菌以及對(duì)細(xì)菌生存的影響

將大腸桿菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、熒光假單胞桿菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、海豚鏈球菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌進(jìn)行接種培養(yǎng)至OD600為0.8, 細(xì)菌離心后用PBS清洗并重懸于PBS至108CFU/mL。細(xì)菌與蛋白質(zhì)的相互作用按照之前的報(bào)道用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)[15]。為了檢測(cè)rSmCD55蛋白對(duì)細(xì)菌生存的影響, 將細(xì)菌懸液與終濃度為100 μg/mL的rSmCD55蛋白、rSumo蛋白或PBS在22 ℃條件下孵育2 h。然后稀釋混合液, 均勻涂布到含瓊脂的培養(yǎng)平板上, 在37 ℃或28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 SmCD55蛋白序列分析

SmCD55蛋白由344個(gè)氨基酸殘基組成, 理論分子量為36.8 kDa, 預(yù)測(cè)等電點(diǎn)(pI)為7.85。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明, SmCD55蛋白序列N-端1～26位氨基酸殘基為信號(hào)肽(Signal peptide)序列, 其后有3個(gè)補(bǔ)體調(diào)控蛋白(CCP)結(jié)構(gòu)域(28～86氨基酸殘基、91～143氨基酸殘基和148～204氨基酸殘基)。選取硬骨魚(yú)和哺乳動(dòng)物CD55蛋白的同系物與SmCD55蛋白進(jìn)行序列比對(duì), 結(jié)果表明, SmCD55蛋白與所選同系物序列的相似性在27%～68%(圖1), 其中SmCD55蛋白與射水魚(yú)()CD55蛋白相似性最高(68%), 在硬骨魚(yú)中與虹鱒()CD55蛋白相似性最低(37%), 在哺乳動(dòng)物中與人類(lèi)()的CD55蛋白相似性最低(27%)。構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)分析表明, SmCD55蛋白與硬骨魚(yú)類(lèi)CD55蛋白分子在進(jìn)化上關(guān)系較近, 與射水魚(yú)關(guān)系最近, 與虹鱒關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)。用于和SmCD55蛋白序列進(jìn)行比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析的物種包括:, XP_ 040890444.1;, XP_022617127.1;, XP_031157844.1;, XP_030277131.1;, XP_033483710.1;, XP_024915538.1;, XP_ 005458494.1;, XP_021425213.2;, XP_006249779.1;, ANF06964.1。

2.2 SmCD55基因的組織特異性表達(dá)譜

在健康大菱鲆中, 利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)基因在大菱鲆各個(gè)組織中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 大菱鲆肌肉、腸、鰓、頭腎、心、脾、血、肝和腦組織中均有基因的表達(dá), 其中在腦組織中表達(dá)量最高(圖3)。

2.3 rSmCD55蛋白對(duì)補(bǔ)體激活的影響

為了研究SmCD55蛋白在補(bǔ)體激活中的作用, 作者利用原核表達(dá)系統(tǒng)純化出了rSmCD55蛋白和rSumo蛋白(圖4)。采用不同濃度的rSmCD55蛋白、rSumo蛋白或PBS (對(duì)照組)處理大菱鲆血清, 然后檢測(cè)血清的溶血活性和殺菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在血清稀釋8倍和16倍時(shí), 用rSmCD55蛋白處理后血清的溶血活性顯著低于對(duì)照組, 8倍和16倍稀釋血清的溶血活性分別下降了5%和21%; 而用對(duì)照蛋白rSumo處理的血清在溶血活性方面沒(méi)有顯著變化(圖5a)。在血清稀釋8倍、16倍和32倍時(shí), 用rSmCD55蛋白處理后血清的殺菌活性顯著降低; 相比對(duì)照組, rSmCD55蛋白處理后的8倍、16倍和32倍稀釋血清的殺菌活性分別下降了45%、75%和46%(圖5b)。

圖1 SmCD55蛋白同系物序列的比對(duì)

括號(hào)中的數(shù)字表示SmCD55蛋白和被比較序列的整體相似度。完全相同的氨基酸殘基用藍(lán)色標(biāo)記, 相似度≥75%的氨基酸殘基用黑色標(biāo)記, 相似度≥50%的氨基酸殘基用灰色標(biāo)記。Signal peptide和CCP (complement control protein)結(jié)構(gòu)域用紅色箭頭在圖中標(biāo)記

The numbers in parentheses represent the overall similarity between SmCD55 protein and the sequence being compared. Identical amino acid residues were marked in blue, those with similarity ≥75% were marked in black, and those with similarity ≥50% were marked in gray. The signal peptide and CCP (Complement Control Protein) domains are marked with red arrows

2.4 rSmCD55結(jié)合細(xì)菌情況

為了檢測(cè)rSmCD55蛋白是否能夠與細(xì)菌相互作用, 將不同濃度的rSmCD55蛋白或rSumo蛋白與大腸桿菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、熒光假單胞桿菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、海豚鏈球菌、枯草芽孢桿菌或藤黃微球菌孵育。ELISA結(jié)果顯示, rSmCD55蛋白能夠以濃度依賴(lài)的方式結(jié)合所有檢測(cè)的細(xì)菌(圖6)。與rSmCD55蛋白結(jié)合最強(qiáng)的細(xì)菌是哈維氏弧菌, 結(jié)合最弱的細(xì)菌是遲緩愛(ài)德華氏菌。進(jìn)一步檢測(cè)了rSmCD55蛋白是否對(duì)細(xì)菌具有殺傷作用。結(jié)果顯示, rSmCD55蛋白對(duì)這些細(xì)菌沒(méi)有明顯的殺傷作用(數(shù)據(jù)未展示)。

3 討論

本研究對(duì)SmCD55蛋白進(jìn)行了序列分析、組織分布和生物功能的研究。序列分析表明, SmCD55蛋白氨基酸序列與射水魚(yú)CD55蛋白相似度最高, 在進(jìn)化上與硬骨魚(yú)CD55蛋白同系物距離最近。預(yù)測(cè)的SmCD55蛋白氨基酸序列中含有一個(gè)信號(hào)肽和3個(gè)CCP功能域。之前的研究表明, 哺乳動(dòng)物CD55蛋白中存在4個(gè)CCP功能域, 其中第2、3和4個(gè)CCP功能域可以特異性地結(jié)合旁路途徑的C3轉(zhuǎn)化酶(C3bBb), 引起B(yǎng)b片段與C3b結(jié)合的不穩(wěn)定性, 從而釋放Bb片段, 造成C3轉(zhuǎn)化酶的衰變解離[16, 17]。CCP功能域在SmCD55蛋白的保守性存在表明, SmCD55蛋白可能在補(bǔ)體激活調(diào)控中具有與哺乳動(dòng)物CD55蛋白相似的生物學(xué)功能。CD55蛋白在哺乳動(dòng)物體內(nèi)分布十分廣泛, 存在于粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴以及許多上皮細(xì)胞的表面[8, 18]。在本研究中, 作者發(fā)現(xiàn)基因在所有被檢測(cè)的9種大菱鲆組織中都表達(dá), 說(shuō)明SmCD55蛋白可能與哺乳動(dòng)物CD55蛋白類(lèi)似, 在保護(hù)自身組織細(xì)胞免受補(bǔ)體損傷中發(fā)揮作用。

圖2 SmCD55蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 6.0軟件, 使用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 測(cè)定了大菱鲆SmCD55蛋白與其他硬骨魚(yú)和哺乳動(dòng)物CD55蛋白在進(jìn)化上的關(guān)系

The phylogenetic tree of turbot SmCD55 protein was constructed by ortho-linkage method using MEGA 6.0 software, and the evolutionary relationship between SmCD55 protein and other teleost and mammals was determined

圖3 SmCD55基因在健康大菱鲆組織中的表達(dá)情況

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法, 檢測(cè)健康大菱鲆肌肉、腸、鰓、頭腎、心、脾、血、肝和腦組織中基因的表達(dá)。為了便于各組織間比較, 作者將肌肉組織表達(dá)水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)是3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值, 用±表示標(biāo)準(zhǔn)誤差

The expression ofgene in muscle, intestine, gill, head kidney, heart, spleen, blood, liver and brain of healthy turbot was detected by real-time quantitative PCR.In order to facilitate the comparison between tissues, the authors set the expression level of muscle tissue as 1.Data are the means of three independent assays and presented as means±SEM

圖4 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析rSmCD55蛋白

泳道1為蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker, 泳道2為rSumo蛋白, 泳道3為rSmCD55蛋白。將純化后的蛋白利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析, 利用考馬斯亮藍(lán)R-250染色進(jìn)行觀察

Lane 1 was the protein standard Marker, lane 2 was rSumo protein, and lane 3 was rSmCD55 protein.The purified protein was analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and observed by Coomassie bright blue R-250 staining

已有報(bào)道表明, 從人紅細(xì)胞中純化的天然CD55蛋白可以插入兔()和羊()的紅細(xì)胞膜中, 并抑制人類(lèi)補(bǔ)體對(duì)兔和羊紅細(xì)胞的裂解能力[9], 這種抑制作用是通過(guò)CD55蛋白加速C3轉(zhuǎn)化酶的衰變解離造成的[18]。CD55蛋白異?？蓪?dǎo)致疾病, 例如, 陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿癥是一種以紅細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體溶血活性異常敏感為特征的自身免疫性疾病, 紅細(xì)胞表面CD55蛋白表達(dá)缺陷是造成這種疾病的主要原因[19-21]。在我們的研究中, 發(fā)現(xiàn)用rSmCD55蛋白處理的大菱鲆血清的溶血活性和殺菌活性明顯降低, 說(shuō)明rSmCD55蛋白抑制了大菱鲆補(bǔ)體系統(tǒng)的激活, 是一種補(bǔ)體激活的負(fù)調(diào)控因子。

圖5 rSmCD55蛋白對(duì)補(bǔ)體激活的影響

用rSmCD55蛋白、rSumo蛋白或PBS (對(duì)照) 處理不同稀釋度的大菱鲆血清, 隨后測(cè)定血清的溶血活性(a)和殺菌活性(b)。數(shù)據(jù)以平均值±表示標(biāo)準(zhǔn)誤差(= 3)表示。為實(shí)驗(yàn)次數(shù)。*.<0.05, **.<0.01

The serum of turbot was treated with rSmCD55 protein, rSumo protein or PBS (Control), and the hemolytic activity (a) and bactericidal activity (b) of the serum were determined.Data are shown as means±SEM (= 3). n, the number of times the experiment was performed. *.<0.05, **.<0.01

圖6 rSmCD55蛋白與細(xì)菌的結(jié)合情況

將大腸桿菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、熒光假單胞桿菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、海豚鏈球菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌分別與不同濃度的rSmCD55蛋白孵育, 對(duì)照組細(xì)菌與PBS孵育, 利用ELISA法檢測(cè)細(xì)菌與蛋白的結(jié)合。數(shù)據(jù)是3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值, 用±表示標(biāo)準(zhǔn)誤差

、、、、、、andwere incubated with different concentrations of rSmCD55 protein, respectively. The control group was incubated with PBS, and the binding between bacteria and protein was detected by ELISA.Data are the means of three independent assays and presented as means±SEM

人類(lèi)CD55蛋白在所有暴露于血清的細(xì)胞上都高水平表達(dá)。這種廣泛性表達(dá)使得CD55蛋白被某些病原微生物利用, 成為微生物感染宿主細(xì)胞的受體[22]。NOWICKI等[23-24]首次報(bào)道了人類(lèi)CD55蛋白可以被泌尿系統(tǒng)致病性大腸桿菌結(jié)合并充當(dāng)細(xì)菌感染細(xì)胞的受體。幽門(mén)螺桿菌是一種人類(lèi)常見(jiàn)病原菌, 其誘導(dǎo)多種胃部疾病。研究表明, 在幽門(mén)螺桿菌感染后, 胃組織細(xì)胞中CD55蛋白表達(dá)增加, 并且與幽門(mén)螺桿菌結(jié)合, 在宿主-病原體的相互作用中充當(dāng)病原的細(xì)胞受體[11]。在本研究中, ELISA結(jié)果顯示rSmCD55蛋白可以結(jié)合多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌, 包括常見(jiàn)的魚(yú)類(lèi)病原菌, 但這種結(jié)合作用并不影響細(xì)菌的生存與繁殖。鑒于上述哺乳動(dòng)物CD55蛋白在幾種病原體黏附和入侵宿主細(xì)胞中的作用, 我們推測(cè), SmCD55蛋白有可能作為病原菌感染大菱鲆組織細(xì)胞的受體, 病原菌能夠通過(guò)結(jié)合CD55蛋白逃逸魚(yú)類(lèi)血清的殺傷作用, 達(dá)到感染宿主細(xì)胞的目的。這種推測(cè)的正確性有待將來(lái)的研究檢驗(yàn)。

4 結(jié)論

綜上所述, 研究結(jié)果表明, SmCD55蛋白是哺乳動(dòng)物CD55蛋白的同系物, 在健康大菱鲆的多種組織中呈組成型表達(dá)。rSmCD55蛋白可以抑制大菱鲆補(bǔ)體系統(tǒng)的激活, 顯著降低血清補(bǔ)體的溶血活性和殺菌活性。另外, rSmCD55蛋白可以與包括水產(chǎn)致病菌在內(nèi)的多種細(xì)菌結(jié)合。這些結(jié)果表明大菱鲆CD55蛋白在補(bǔ)體系統(tǒng)的激活中起負(fù)調(diào)控作用, CD55蛋白也可能作為病原菌在細(xì)胞表面的受體, 協(xié)助病原菌逃逸宿主補(bǔ)體的殺傷。因此, CD55蛋白不僅在魚(yú)類(lèi)自身免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用, 而且可能參與病原感染過(guò)程。這些結(jié)果為魚(yú)類(lèi)補(bǔ)體激活調(diào)控機(jī)制提供了新的認(rèn)知。

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TurbotCD55 negatively regulates complement activation and binds a variety of bacteria

WU Meng1, 2, LI Mo-fei3, SUN Li1, 2

(1. CAS Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, College of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China)

Turbot () is an important commercial fish species in China. CD55protein is known to be a complement regulator in mammals, but its function in fish is unknown. In this study, we examined the function of turbot CD55 (SmCD55) protein. The results showed that SmCD55 protein consisted of 344 amino acid residues and contained an N-terminal signal peptide and three complement control protein domains.gene was expressed in several tissues of turbot, with the lowest expression level in muscle and the highest expression level in brain. A recombinant SmCD55 (rSmCD55) protein was obtained from a prokaryotic expression system. rSmCD55 protein significantly inhibited the hemolytic and bactericidal activities of turbot serum, suggesting that rSmCD55 negatively regulates complement activation.In addition, rSmCD55 protein is bound to a variety of bacteria, including the aquaculture pathogens,,,, and. Of these bacteria,exhibited the strongest binding ability to rSmCD55 protein.These results add new insight into the complement system in fish and promote our understanding of complement activation and regulation in fish.

; CD55; complement regulation; bacterial binding

Apr. 1, 2022

[National Key Research and Development Program of China, No. 2018YFD0900500]

S917.4

A

1000-3096(2022)07-0024-08

10.11759/hykx20220410001

2022-04-10;

2022-04-29

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFD0900500)

吳蒙(1996—), 男, 山東菏澤人, 碩士研究生, 主要從事魚(yú)類(lèi)固有免疫方面的研究, 電話: 17865528977, E-mail: 251300798@ qq.com; 李墨非(1986—),通信作者, 電話: 15969820960, E-mail: limofei@tjnu.edu.cn; 孫黎(1965—), 通信作者, 電話: 0532-82898829, E-mail: lsun@qdio.ac.cn

(本文編輯: 譚雪靜)