蛋白酶體抑制劑RA190對口腔腺樣囊性癌的調節(jié)作用*

趙曦，鄭黎薇，周丹，王春

[1.德陽市人民醫(yī)院口腔科，四川德陽 618000；2.四川大學華西口腔醫(yī)院（口腔疾病研究國家重點實驗室），四川成都 610041；3.德陽市人民醫(yī)院麻醉科，四川德陽 618000]

口腔腺樣囊性癌主要發(fā)生在唾液腺，約占所有唾液腺惡性腫瘤的22%。臨床資料分析表明，口腔腺樣囊性癌治療后10年生存率約為29%～40%，唾液腺樣囊性癌死亡的主要原因是局部復發(fā)和遠處轉移[1-2]。因此本研究尋找口腔腺樣囊性癌新的治療靶點，為有效的治療方案提供參考依據(jù)。 泛素- 蛋白酶體通路（ubiquitin-proteasome pathway, UPS）是非細胞內溶酶體，參與多個細胞通路相關基因蛋白的降解，調節(jié)細胞凋亡、細胞周期等生理過程[3-5]。非ATP 酶依賴性調節(jié)顆粒13（regulatory particle non-ATPase 13, Rpn13）是蛋白酶體19 S 亞單位上的泛素受體，而雙芐基吡啶酮（RA190）是一種新的蛋白酶體抑制劑。目前尚未有關于Rpn13、RA190 與口腔腺樣囊性癌作用的相關研究，因此，本研究通過觀察RA190 對ACC-2細胞增殖、凋亡及Survivin、TIP30、泛素化蛋白表達的影響，探討RA190 是否可能通過Rpn13 抑制蛋白酶體的功能，起到抗口腔腺樣囊性癌的作用及其可能機制，為其進行臨床應用提供實驗依據(jù)和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

右腭小唾液腺腺樣囊性癌ACC-2 細胞、唾液腺上皮細胞（中國科學院上海生命科學研究院）。10%小牛血清（美國Invitrogen 公司），DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），100 μL/mL 抗生素（美國HyClone 公司），胰蛋白酶（美國Gibco 公司），opti-MEM 低血清培養(yǎng)基（美國Invitrogen 公司），lipofectamineTM2000（美國Invitrogen 公司），siRNA（中國Ribo Bio 公司），RA190（美國San Diego 公司），MTT 試劑盒（美國Sigma-Aldrich 公司），逆轉錄試劑盒（加拿大Fermentas 公司），PCR 混合試劑、Trizol（美國Invitrogen 公司），預染蛋白質分子量標準（Marker）（美國Bio-Rad 公司），NC 膜（美國GE 公司），SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（美國Sigma公司），抗β -actin、抗Rpn13、抗ubiquitin、抗survivin、抗TIP30（美國Cell Signaling 公司）。

SW-CJ-2FD 型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），細胞培養(yǎng)盤（美國BD FALCAN 公司），15AC 型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司），TS-2 脫色搖床、漩渦混合器（中國其林貝爾有限公司），IMS-40 制冰機（中國雪科有限公司），HQ-320XT 醫(yī)用膠片沖洗機（中國虎丘影像科技有限公司），MyiQ thermocycler（美國Bio-Rad 公司），紫外分光光度計（日本島津公司），BSA124S型電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司），5418 型離心機（德國Eppendorf 公司），全自動酶標儀、SDS-PAGE 凝膠電泳設備（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)ACC-2 細胞用DMEM 培養(yǎng)基在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞密度達到80%的時候，傳代分盤備用。

1.2.2 干擾ACC-2 細胞中Rpn13 的表達通過LipofectamineTM2000 作為轉染劑敲除Rpn13，通過多次的條件摸索優(yōu)化得到最優(yōu)的細胞密度及質粒，選擇最有效的敲除序列和濃度。在干擾Rpn13基因表達時，設計了S1、S2、S3 序列，經多次試驗，選用細胞濃度為60%，siRNA 為S2 序列，濃度為10 μL/mL。

1.2.3 RA190 處理ACC-2 細胞為確定RA190 是否能有效地抑制ACC-2 的細胞生長，用4 種不同劑量（分別為400 nmol/L、500 nmol/L、600 nmol/L 和700 nmol/L）的RA190 處理A 組細胞，處理48 h 后，MTT 法觀察各組細胞增殖、凋亡情況。

1.2.4 實驗分組ACC-2 細胞通過不同方法處理后，分為ACC-2 組、ACC-2-Rpn13-siRNA 組（通過敲除來改變ACC-2 細胞中Rpn13 的表達）、RA190-ACC-2 組（用RA190 處理ACC-2 細胞）、RA190-ACC-2-Rpn13-siRNA 組（用RA190 處理ACC-2-Rpn13-siRNA 細胞）。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖、凋亡取4 組對數(shù)生長期細胞接種于24 孔培養(yǎng)板內，每孔細胞數(shù)為2×104個/mL，每組細胞設6 個復孔，每孔加入500 μL 的1 mg/mL MTT 工作液，在培養(yǎng)箱中放置3 h，吸取上清液，再在每孔中加入500 μL 0.4%酸化異丙醇（0.04 mol/L HCL），搖床震蕩后，每孔吸取200 μL 至96 孔酶標板中，用全自動酶標儀檢測570 nm 波長處的光密度（OD）值。

1.2.6 Western blotting 檢測Rpn13、Survivin、TIP30、泛素化蛋白的表達處理后的細胞培養(yǎng)24 h，提取4 組細胞的蛋白，Western blotting 檢測Rpn13、Survivin、TIP30、泛素化蛋白的表達，用Quantity One Vesion 4.5.0 軟件分析結果圖像的灰度值。

1.2.7 qRT-PCR 檢測Survivin 和TIP30 mRNA 相對表達量取對數(shù)生長期密度為1×106個/mL 的細胞各2 mL 接種于6 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，采用Trizol法提取各組細胞總RNA，每組取總RNA 模板建立20 μL 逆轉錄反應體系：10 μL 2×qPCR Mix；0.5 μL Forward Primer（10 μmol/L）；0.5 μL Reverse Primer（10 μmol/L）；2.0μL cDNA；加ddH2O 至20 μL。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 min，58℃退火30 min，72℃延伸20 min，共42 個循環(huán)，95℃保溫10 min。計算目的基因和β-actin 相對表達量（2-ΔΔCt）。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ACC-2 組細胞與ACC-2-Rpn13-siRNA 組Rpn13蛋白相對表達量的比較

對ACC-2 細胞進行siRNA 轉染后，ACC-2 組Rpn13 蛋白相對表達量為（0.942±0.053），ACC-2-Rpn13-siRNA 組Rpn13 蛋白相對表達量為（0.217±0.037），兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=0.786，P=0.000），ACC-2-Rpn13-siRNA 組Rpn13 蛋白相對表達量較ACC-2 細胞組降低。見圖1。

圖1 ACC-2細胞組和ACC-2-Rpn13-siRNA組Rpn13蛋白的表達

2.2 不同劑量RA190作用ACC-2細胞后OD值的比較

MTT 法檢測結果顯示，不同劑量的RA190 作用ACC-2 細胞后OD 值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），隨著RA190 劑量增加，OD 值下降，RA190劑量達到600 nmol/L 后，OD 值下降趨于穩(wěn)定，因此本實驗選擇RA190 的劑量為600 nmol/L。見表2和圖2。

表2 不同劑量RA190作用ACC-2細胞后OD值的比較 （±s）

表2 不同劑量RA190作用ACC-2細胞后OD值的比較 （±s）

注：?與0 nmol/L組比較，P<0.05。

組別0 nmol/L組400 nmol/L組500 nmol/L組600 nmol/L組700 nmol/L組F 值P 值OD值0.746±0.004 0.625±0.006?0.523±0.007?0.347±0.006?0.331±0.008?2.520 0.000

圖2 不同劑量RA190作用ACC-2細胞后的OD值比較（±s）

2.4 各組細胞OD值比較

MTT 法檢測結果顯示，各組ACC-2 細胞OD值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。相較于ACC-2組，其他3 組的OD 值均降低。見表3和圖3。

圖3 4組細胞的OD值比較 （±s）

表3 各組細胞的OD值比較 （±s）

表3 各組細胞的OD值比較 （±s）

注：?與ACC-2細胞組比較，P<0.05。

組別ACC-2組ACC-2-Rpn13-siRNA組RA190-ACC-2組RA190-ACC-2-Rpn13-siRNA組F 值P 值OD值0.776±0.031 0.610±0.027?0.366±0.031?0.536±0.035?89.220 0.000

2.5 各組Survivin、TIP30、泛素化蛋白相對表達量的比較

各組Survivin 蛋白、TIP30 蛋白、泛素化蛋白相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與ACC-2 組比較，其余3 組Survivin 蛋白相對表達量均降低（P<0.05），TIP30 蛋白、泛素化蛋白相對表達量均升高（P<0.05），RA190-ACC-2 組TIP30 蛋白相對表達量最高，泛素化蛋白聚集最明顯，其余兩組與ACC-2 組比較也有差異，但增加幅度小于RA190-ACC-2 組。見圖4和表4。

圖4 Survivin、TIP30、泛素化蛋白的表達

表4 各組Survivin、TIP30、泛素化蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組Survivin、TIP30、泛素化蛋白相對表達量比較（±s）

注：?與ACC-2細胞組比較，P<0.05。

組別ACC-2組ACC-2-Rpn13-siRNA組RA190-ACC-2組RA190-ACC-2-Rpn13-siRNA組F 值P 值Survivin蛋白1.051±0.047 TIP30蛋白0.873±0.119泛素化蛋白1.133±0.158 0.846±0.047?3.546±0.140?2.431±0.207?0.109±0.026?7.205±0.093?4.053±0.256?0.993±0.064?5.354±0.217?1.956±0.196?105.600 0.000 249.200 0.000 974.900 0.000

2.6 各組Survivin 和TIP30 mRNA 相對表達量的比較

各組Survivin mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與ACC-2 組比較，其余3 組Survivin mRNA 相對表達量均降低（P<0.05），RA190-ACC-2 組Survivin mRNA 相對表達量最低。各組TIP30 mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與ACC-2 組比較，其余3 組TIP30 mRNA 相對表達量均升高（P<0.05），RA190-ACC-2 組TIP30 mRNA 相對表達量最高。見表5和圖5。

表5 各組Survivin和TIP30 mRNA相對表達量的比較 （±s）

表5 各組Survivin和TIP30 mRNA相對表達量的比較 （±s）

注：?與ACC-2組比較，P<0.05。

組別ACC-2組ACC-2-Rpn13-siRNA組RA190-ACC-2組RA190-ACC-2-Rpn13-siRNA組F 值P 值TIP30 mRNA 1.000±0.021 1.185±0.031?1.773±0.044?1.276±0.021?345.000 0.000 Survivin mRNA 1.000±0.031 0.907±0.022?0.518±0.028?0.788±0.013?211.300 0.000

圖5 各組Survivin mRNA、TIP30 mRNA相對表達量（±s）

3 討論

研究表明，26 S 蛋白酶體可降解大多數(shù)的細胞蛋白，參與DNA 修復、細胞周期調節(jié)、細胞凋亡、胞內信號傳導等多種生理進程，對維持細胞穩(wěn)態(tài)具有重要意義[6-7]，因此蛋白酶體的降解失調與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及治療相關[8-9]。而26 S 蛋白酶體的組成包括了20 S 核心顆粒和19 S 調節(jié)顆粒[10]，其中19 S 調節(jié)顆粒上的亞基Rpn13 是泛素識別靶蛋白的重要受體，在識別泛素分子共價結合的靶蛋白后，將蛋白連接到20 S 核心顆粒中進行降解[11-12]，以往研究[13-14]表明，在多種腫瘤細胞中Rpn13 表達水平異常升高，包括卵巢腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤等，因此認為Rpn13是一種致癌基因。近年來有基因沉默實驗也發(fā)現(xiàn)Rpn13低表達時會抑制腫瘤細胞增殖，阻斷細胞周期，從而使細胞增殖停滯在G0/G1期[15-17]。本研究中RA190 是一種雙芐基吡啶酮，在19 S 調節(jié)粒子中，RA190 是第一個與Rpn13 相互作用的蛋白酶體抑制劑，與Rpn13 N 端上的PRU 結構域C88 共價結合[18]，RA190 與Rpn13 結合后，抑制了Rpn13 識別泛素化蛋白的作用，從而抑制26 S 蛋白酶體對蛋白質的降解[19-20]。

研究證實通過激活細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤活性是腫瘤治療最重要的途徑[21]，可以通過恢復凋亡路徑來作為口腔腺樣囊性癌靶向治療的前提，因此本實驗將Rpn13 的致癌作用與口腔腺樣囊性癌的治療靶點聯(lián)系在一起進行研究。結果顯示，RA190 通過Rpn13 促進ACC-2 細胞的凋亡，抑制增殖，同時引起泛素化蛋白表達增加，表明RA190 促凋亡的活動主要取決于Rpn13，Rpn13 為口腔腺樣囊性癌的致癌基因，可能成為治療口腔腺樣囊性癌的靶點。

本研究還發(fā)現(xiàn)，RA190 可以調節(jié)癌癥治療重要靶點Survivin 和TIP30 的表達。Survivin 是一種凋亡蛋白抑制因子，其在腫瘤細胞中過度表達，也是多種癌癥中腫瘤發(fā)生、復發(fā)及不良疾病轉歸的診斷標志物[22-23]，本研究表明RA190 可通過Rpn13 靶向Survivin，誘導癌細胞死亡，可能改善口腔腺樣囊性癌的預后。另一種基因TIP30 通過其促凋亡及抗轉移和抑制血管生成的能力被認為是一種腫瘤抑制因子，在肺癌、腸癌等癌癥中表達下調[24-25]，本實驗表明RA190 可通過Rpn13 上調TIP30 的表達來發(fā)揮其抑制腫瘤的作用。

本研究證實了RA190 對口腔腺樣囊性癌細胞的抑制作用，接下來會進一步探索RA190 對體內癌癥的有效性，從而讓蛋白酶體抑制劑成為口腔腺樣囊性癌患者有效的治療選擇，為治療口腔腺樣囊性癌提供新的途徑。