微波輔助萃取-反相液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定玉米中4種砷形態(tài)的含量

陳 曦,周明慧,張潔瓊,伍燕湘,田 巍,王松雪

(國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院,北京 100037)

準(zhǔn)確提取樣品中的所有砷形態(tài)是進(jìn)行形態(tài)分析的首要條件,目前常用的提取劑為硝酸、甲醇、三氟乙酸或蛋白質(zhì)提取液等[8-11]。提取方法主要包括烘箱熱浸提法、微波輔助萃取法和超聲提取法等[12-14]。本課題組前期研究結(jié)果顯示,采用稀硝酸溶液進(jìn)行提取時(shí),稻米中不同砷形態(tài)的提取率接近100%,相對(duì)于烘箱熱浸提法和超聲提取法,微波輔助萃取法具有提取效率高、有利于保護(hù)砷形態(tài)間不發(fā)生轉(zhuǎn)化及損失等優(yōu)點(diǎn)[15]。在此研究基礎(chǔ)上,本工作對(duì)前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化,包括提取劑濃度、提取溫度和提取時(shí)間等,利用反相液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(RPLC-ICP-MS)對(duì)玉米中4種砷形態(tài){一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、三價(jià)砷[As(Ⅲ)]和五價(jià)砷[As(Ⅴ)]}進(jìn)行分離測(cè)定,通過優(yōu)化流動(dòng)相,4種砷形態(tài)可在4 min內(nèi)完成測(cè)定,可為相關(guān)從業(yè)人員提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1260型液相色譜儀;8900型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀;Topex型微波消解儀;Milli-Q 型超純水處理系統(tǒng);3-30K 型高速離心機(jī);FE28-Standard 型pH 計(jì);Pulverisette 14型粉碎機(jī)。

As(Ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)溶液:75.7μg·g-1(以砷計(jì),下同),編號(hào)為GBW 08666;As(Ⅴ)標(biāo)準(zhǔn)溶液:17.5μg·g-1,編號(hào)為GBW 08667;MMA 標(biāo)準(zhǔn)溶液:25.1μg·g-1,編號(hào)為GBW 08668;DMA 標(biāo)準(zhǔn)溶液:52.9μg·g-1,編號(hào)為GBW 08669。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:以水為稀釋劑,將各砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成100 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:用流動(dòng)相作稀釋劑,將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋,配制成質(zhì)量濃度分別為2,5,10,20,25,50μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

硝酸純度為BV-Ш 級(jí)(金屬雜質(zhì)總質(zhì)量分?jǐn)?shù)不超過10-5%～10-3%);磷酸氫二銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、己烷磺酸鈉、檸檬酸、氫氧化鈉均為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

侵襲性肺真菌感染（IPFI）是指真菌直接侵犯（非寄生、過敏或毒素中毒）肺或支氣管引起的急、慢性組織病理?yè)p害所導(dǎo)致的疾病。IPFI發(fā)病率正逐年增加[1]。因其臨床表現(xiàn)不典型，影像表現(xiàn)多樣，常常被誤診誤治。目前肺活檢病理仍是診斷侵襲性肺真菌病的金標(biāo)準(zhǔn)。通過活檢取得病理學(xué)資料早期、正確的指導(dǎo)抗真菌治療將大大節(jié)約醫(yī)療衛(wèi)生成本，改善IPFI患者的預(yù)后。近年來(lái)，CT引導(dǎo)下肺穿刺活檢術(shù)不斷成熟，該技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用彌補(bǔ)了電子支氣管鏡活檢的不足。本研究回顧性分析了我院2016年1月～2018年4月接受低劑量CT引導(dǎo)下經(jīng)皮同軸穿刺肺活檢技術(shù)的30例肺真菌病診斷病例，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 RPLC條件

Agilent ZORBAX SB-Aq 反相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相為5 mmol·L-1己烷磺酸鈉-20 mmol·L-1檸檬酸的混合溶液(pH 4.3);等度洗脫;流量1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量5μL。

1.2.2 ICP-MS條件

射頻功率1 550 W;載氣流量0.85 L·min-1;補(bǔ)償氣流量0.30 L·min-1;蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速0.5 r·min-1;采樣深度8 mm;氦氣碰撞反應(yīng)池分析模式,氦氣流量4.5 mL·min-1。

1.3 試驗(yàn)方法

玉米樣品經(jīng)高速粉碎機(jī)研磨后,過孔徑為0.45 mm 篩網(wǎng),保存于干燥器中。取0.5 g樣品,置于聚四氟乙烯消解罐中,加入0.15 mol·L-1硝酸溶液7 mL,按表1程序進(jìn)行微波輔助萃取。待提取液冷卻至室溫,以8 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min,上清液過0.22μm 有機(jī)濾膜,濾液供RPLC-ICP-MS分析。

表1 微波輔助萃取程序Tab.1 Microwave assisted extraction procedure

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的選擇

2.1.1 提取劑濃度

綜合考慮不同砷形態(tài)尤其是i As在提取液中的穩(wěn)定性、與色譜分離柱的適用性、對(duì)環(huán)境和人員友好性以及提取效率等因素,本試驗(yàn)擬采用GB 5009.11-2014 中的稀硝酸溶液作稀釋劑。以GBW(E)100380 玉米粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為待測(cè)對(duì)象,以0.15 mol·L-1硝酸溶液作提取劑,以烘箱熱浸提法作為提取方法,比較了不同提取溫度和提取時(shí)間下玉米中4種砷形態(tài)的提取量,結(jié)果見圖1。

圖1 0.15 mol·L-1硝酸溶液作提取劑時(shí)玉米中4種砷形態(tài)在不同條件下的提取量Fig.1 Extraction amount of the 4 arsenic species in corn under different conditions with 0.15 mol·L-1 nitric acid solution as extractant

由圖1可知,在不同砷形態(tài)中,As(Ⅲ)最不易提取,需要更高的提取溫度和更長(zhǎng)的提取時(shí)間,而DMA、MMA 和As(Ⅴ)均可用0.15 mol·L-1硝酸溶液在25～90 ℃下加熱0.5～2.5 h提取完全。鑒于此,參考GB 5009.11-2014,將提取溫度設(shè)置為90 ℃,硝酸溶液的濃度提升至0.30 mol·L-1,并與0.15 mol·L-1時(shí)i As的提取結(jié)果進(jìn)行比對(duì),如圖2所示。

由圖2可知:以0.30 mol·L-1硝酸溶液提取As(Ⅲ)時(shí),其完全提取時(shí)間(1.5 h)較0.15 mol·L-1時(shí)的(2.5 h)短,提取效率更高;以不同濃度硝酸溶液提取As(Ⅴ)時(shí),其提取量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)均沒有顯著變化。綜合圖1結(jié)果可知,As(Ⅴ)易被提取,且對(duì)提取劑濃度、提取時(shí)間及溫度沒有依賴性。高濃度硝酸溶液對(duì)色譜柱的柱效影響較為顯著,因此試驗(yàn)選擇以0.15 mol·L-1硝酸溶液作為玉米樣品中不同砷形態(tài)的提取劑。

圖2 不同濃度硝酸溶液下玉米中iAs的提取量Fig.2 Extraction amount of iAs in corn under different concentrations of nitric acid solution

2.1.2 微波輔助萃取條件

鑒于微波輔助萃取法提取時(shí)間更短,同時(shí)也是國(guó)際上廣泛采用的檢測(cè)iAs的前處理方法,因此試驗(yàn)也以此方法處理玉米。以0.15 mol·L-1硝酸溶液作提取劑,試驗(yàn)先參考文獻(xiàn)[15],以稻米的微波輔助萃取程序(表2)處理GBW(E)100380玉米粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

表2 微波輔助萃取程序[15]Tab.2 Microwave assisted extraction procedure[15]

結(jié)果顯示,MMA、DMA、As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的提取量為0.003,0.009,0.062,0.151 mg·kg-1,總砷值為0.225 mg·kg-1,顯著低于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的認(rèn)定值[(0.277±0.023)mg·kg-1],說(shuō)明以稻米的萃取程序提取時(shí),玉米樣品中各砷形態(tài)提取不完全,這可能與As(Ⅲ)未被完全提取有關(guān)。結(jié)合文獻(xiàn)研究可知,As(Ⅲ)易與蛋白質(zhì)和淀粉結(jié)合[16],而玉米中的蛋白質(zhì)含量普遍高于大米[17-18]。鑒于高溫可破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),使As(Ⅲ)完全釋放,試驗(yàn)嘗試適當(dāng)提高提取溫度和延長(zhǎng)提取時(shí)間,優(yōu)化得到的微波輔助萃取程序見表1。以此條件處理GBW(E)100380玉米粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),MMA、DMA、As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的提取量為0.004,0.011,0.096,0.150 mg·kg-1,總砷值為0.261 mg·kg-1,在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)認(rèn)定值的不確定度范圍內(nèi)。因此,試驗(yàn)選擇以表1的微波輔助萃取程序提取玉米樣品中的4種砷形態(tài)。

2.2 色譜條件的選擇

目前,糧食行業(yè)主要采用Hamilton 陰離子交換柱作固定相,采用15 mmol·L-1磷酸二氫銨溶液或磷酸氫二銨溶液等單一磷酸鹽溶液作流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離,而以此條件分析10μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí),所需分離時(shí)間近10 min,如圖3(a)所示。為節(jié)省分析時(shí)間,試驗(yàn)曾參考儀器生產(chǎn)商建議的12 mmol·L-1磷酸氫二鈉-44 mmol·L-1磷酸二氫鉀混合溶液作流動(dòng)相,所得10μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖3(b)所示,此時(shí)4種砷形態(tài)的分離時(shí)間可縮短至約8 min,但該流動(dòng)相對(duì)As(Ⅲ)的洗脫能力明顯弱于單一磷酸鹽溶液的,且其鹽含量較大,對(duì)色譜柱的柱效以及儀器管路的清潔均有不利影響,故不予考慮。

圖3 分別采用單一和混合磷酸鹽溶液作流動(dòng)相時(shí)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.3 Chromatograms of the mixed standard solution with single and mixed phosphate solutions as mobile phase

GB 5009.11-2014中第二篇第二法給出的流動(dòng)相為10 mmol·L-1無(wú)水乙酸鈉、3 mmol·L-1硝酸鉀、10 mmol·L-1磷酸二氫鈉和0.2 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉的混合溶液(pH 10),試驗(yàn)以此流動(dòng)相分離玉米中的砷形態(tài),并通過以下質(zhì)控方法對(duì)該流動(dòng)相的長(zhǎng)期使用效果進(jìn)行考察。即開始時(shí)每測(cè)5個(gè)樣品分析1次混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在分析10個(gè)樣品后,每測(cè)10個(gè)樣品分析1次混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分析60個(gè)樣品后,所得各砷形態(tài)信號(hào)強(qiáng)度占第1次分析時(shí)信號(hào)強(qiáng)度的比值(信號(hào)響應(yīng)率)見圖4。

圖4 玉米中4種砷形態(tài)信號(hào)響應(yīng)率隨樣品數(shù)量的變化曲線Fig.4 Variation curves of signal response rate of the 4 arsenic species in corn with sample number

由圖4可知,信號(hào)響應(yīng)率隨樣品數(shù)量的增加不斷下降,在分析60個(gè)樣品后,混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各砷形態(tài)的信號(hào)響應(yīng)率僅約60%,這是由于流動(dòng)相中鈉鹽和鉀鹽會(huì)沉積在電感耦合等離子體質(zhì)譜儀的關(guān)鍵配件,如樣品截取錐和采樣錐上,導(dǎo)致儀器的檢測(cè)靈敏度下降,方法的精確度變低。

為解決以上問題,本課題組經(jīng)過充分的文獻(xiàn)調(diào)研,以 Agilent ZORBAX SB-Aq 反相色譜柱(250 mm×4.6mm,5μm)作固定相,以5 mmol·L-1己烷磺酸鈉-20 mmol·L-1檸檬酸的混合溶液(pH 4.3)為流動(dòng)相,以1.0 mL·min-1流量進(jìn)行等度洗脫。在此條件下,10μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖5。

圖5 優(yōu)化的色譜條件下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.5 Chromatogram of the mixed standard solution under optimized chromatographic conditions

結(jié)果表明:4種砷形態(tài)可在4 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離,出峰時(shí)間僅為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[19]的1/2,極大地提高了檢測(cè)效率;As(Ⅴ)、MMA 和DMA 的信號(hào)強(qiáng)度明顯高于以單一和混合磷酸鹽溶液為流動(dòng)相時(shí)的,且流動(dòng)相僅會(huì)引入少量鈉鹽,可保持樣品進(jìn)樣系統(tǒng)的潔凈度,維持測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定;Agilent ZORBAX SB-Aq反相色譜柱價(jià)格低廉,對(duì)酸溶液具有較好的適用性。綜上,可采用上述流動(dòng)相分析實(shí)際樣品中的4種砷形態(tài)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以4種砷形態(tài)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,4種砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍均為2～50μg·L-1,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N),結(jié)果見表3。

表3 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.3 Linear regression equations,correlation coefficients and detection limits

由表3可知,4種砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系較好,檢出限為0.041～0.054μg·L-1。

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)空白玉米樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次平行測(cè)定,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表4。

由表4可知,4種砷形態(tài)的回收率為94.2%～102%,測(cè)定值的RSD 小于3.0%,方法準(zhǔn)確度和精密度均符合檢測(cè)要求。

表4 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.5 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析天然污染玉米樣品,并將總砷值與標(biāo)準(zhǔn)方法GB 5009.11-2014的進(jìn)行比對(duì),結(jié)果見表5。

表5 樣品分析結(jié)果Tab.5 Analytical results of the samples mg·kg-1

結(jié)果顯示:天然污染玉米樣品中不同砷形態(tài)的含量差異較大,iAs含量占總砷值的比例較高,有機(jī)砷的含量極低;所測(cè)樣品中總砷值與標(biāo)準(zhǔn)方法中所得的總砷值基本一致,進(jìn)一步證實(shí)了本方法的準(zhǔn)確度。

本工作通過優(yōu)化提取劑濃度、微波輔助萃取溫度和時(shí)間、色譜條件等,以RPLC-ICP-MS測(cè)定玉米中4種砷形態(tài)的含量,提高了玉米中不同砷形態(tài)的檢測(cè)效率和精確度。方法的檢出限、回收率和精密度均滿足行業(yè)檢測(cè)需求,通過對(duì)實(shí)際污染樣品的測(cè)定,進(jìn)一步驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確度和適用性,可為玉米中不同砷形態(tài)的高通量快速測(cè)定提供有價(jià)值的參考依據(jù)。