二硫蘇糖醇保護-改進的QuEChERS吸附劑凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定丹參中30種農(nóng)藥的殘留量

唐玉菲,王 雷,楊成偉,劉必勇

(安徽省第二人民醫(yī)院 職業(yè)衛(wèi)生實驗室,合肥 230022)

丹參作為一種中藥材,有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消痛等效用,在臨床中應用廣泛。在丹參大規(guī)模人工種植中會施用農(nóng)藥來保障其產(chǎn)量與質(zhì)量,而栽培過程中的不合理用藥,會引起藥材中部分農(nóng)藥殘留超標的問題,這不僅直接影響丹參藥材的安全性和有效性,還會給人類的生命健康帶來潛在威脅[1]。為了保障丹參藥材的質(zhì)量,有必要對丹參中農(nóng)藥的殘留水平進行監(jiān)測。

在多組分農(nóng)藥殘留的檢測方法中,氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)具有靈敏度高、選擇性好、通量高等優(yōu)點,是目前主要的農(nóng)藥殘留檢測方法[2-3]。測定前,樣品前處理方法的選擇也很重要,其中Qu ECh ERS是一種基于固相萃取和基質(zhì)固相分散技術于一身的方法,具有經(jīng)濟高效、簡單穩(wěn)定的特點,在水果、蔬菜的多農(nóng)藥殘留檢測方面應用廣泛[4-9]。Qu ECh ERS在中藥材檢測中的應用也有報道,但由于中藥材種類繁多且基質(zhì)復雜,在采用Qu ECh ERS提取凈化時,需要根據(jù)樣品基質(zhì)和目標組分的性質(zhì)選用合適的吸附劑[10-12]。文獻[4]以QuECh ERS提取,分散固相萃取法凈化,LC-MS/MS測定丹參中農(nóng)藥的殘留量[13],但該方法未涉及內(nèi)吸磷、殺蟲脒等《中華人民共和國藥典》(2020年版)第五法規(guī)定的檢測項目。文獻[14]以石墨化碳黑(GCB)作吸附劑,結果顯示,中藥材丹參中有機磷類和磺隆類農(nóng)藥回收率偏低,推測和這兩類農(nóng)藥易被GCB吸附、難以洗脫有關。

本研究團隊發(fā)現(xiàn),使用傳統(tǒng)的含有GCB 的Qu ECh ERS吸附劑凈化丹參藥材時,不僅存在上述部分農(nóng)藥難以洗脫的現(xiàn)象,還存在內(nèi)吸磷、甲拌磷砜等降解導致回收率偏低的現(xiàn)象。二硫蘇糖醇是一種具有線性分子結構的有機還原劑,氧化后會形成穩(wěn)定的氧化態(tài)六元環(huán),常作為還原劑或保護劑應用于環(huán)境或醫(yī)學領域[15-16]。鑒于此,本工作以1.0 mol·L-1二硫蘇糖醇溶液作保護劑,以不添加GCB 的Qu ECh ERS吸附劑進行凈化,以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)同時測定丹參中30種農(nóng)藥的殘留量,方法操作簡便、快捷、靈敏度高、重復性好,適用于丹參中多種殘留農(nóng)藥的快速高效的定性與定量分析,在滿足農(nóng)殘檢測要求的同時避免了部分磺隆類和有機磷類農(nóng)藥在前處理過程中的損失。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 II型超高效液相色譜;6470型三重四極桿質(zhì)譜儀;SPEX Geno/Grinder 2010-QuEChERs型高通量動植物組織研磨機;ME104E型電子天平;XW-80A 型渦旋儀;N-EVAP型12位氮吹儀;5910R 型高速冷凍離心機。

30種農(nóng)藥混合標準溶液:100 mg·L-1,編號為IST29486。

混合標準儲備溶液:1 mg·L-1,由30種農(nóng)藥混合標準溶液用乙腈稀釋制得,于4℃冰箱中儲存。

基質(zhì)匹配混合標準溶液系列:配制空白樣品溶液6份,分別加入10,20,50,100,150,200μL 混合標準儲備溶液,加入150 μL 水,用乙腈定容至1 mL,配制成質(zhì)量濃度為10,20,50,100,150,200μg·L-1基質(zhì)匹配混合標準溶液系列。

乙腈、乙酸為色譜純;甲酸、甲酸銨、二硫蘇糖醇、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉均為分析純;N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、硅膠;試驗用水為超純水。

丹參樣品購自亳州市某中藥材市場。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱(150 mm×3.0 mm,1.8μm);柱溫40 ℃;流動相A 為含0.1%(體積分數(shù),下同)甲酸的10 mmol·L-1甲酸銨溶液,B為乙腈;流量0.3 mL·min-1;進樣量5μL。梯度洗脫程序:0～1 min,A 為95%;1～4 min,A由95%降至40%;4～14 min,A 由40%降至0,保持4 min;18～20 min,A 由0 升至95%,保持6 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子模式;干燥氣溫度250℃,流量11 L·min-1;鞘氣溫度350 ℃,流量12 L·min-1;噴霧壓力140 kPa;毛細管電壓3 500 V;噴嘴電壓500 V;多反應監(jiān)測(MRM)模式。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

表1 (續(xù))

1.3 試驗方法

將樣品均勻粉碎,過三號篩[篩網(wǎng)孔徑(355±13)μm],轉移至干凈的樣品袋中,于4 ℃冰箱中保存。分取(3±0.05)g樣品,置于50 mL聚苯乙烯離心管中,加入1.0 mol·L-1二硫蘇糖醇溶液100μL和1%(體積分數(shù),下同)乙酸溶液15 mL,渦旋,使藥粉被充分浸潤,放置30 min。加入15 mL 乙腈,渦旋混勻,以500 r·min-1轉速振蕩5 min,加入質(zhì)量比4∶1 的無水硫酸鎂和無水硫酸鈉混合粉末7.5 g,立即搖散,以500 r·min-1轉速振蕩3 min,于冰浴中冷卻10 min,以4 000 r·min-1轉速離心5 min。分取上清液9 mL,置于預先加好4 種Qu ECh ERS吸附劑(無水硫酸鎂900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅膠300 mg)的凈化管中,渦旋混勻后置于振蕩器上劇烈振蕩5 min,以4 000 r·min-1轉速離心5 min。分取上清液5 mL于玻璃試管中,于40 ℃氮吹濃縮至約0.4 mL,加入150μL 水,用乙腈定容至1 mL,渦旋混勻后過0.22μm 濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

基質(zhì)匹配混合標準溶液的色譜圖見圖1。

圖1 基質(zhì)匹配混合標準溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the matrix matched mixed standard solution

2.2 提取條件的選擇

乙腈作為Qu ECh ERS 最常用的提取溶劑,適用于極性分布較寬的多殘留農(nóng)藥組分的同時提取,因此本工作采用乙腈作為提取溶劑。QuEChERS最佳使用環(huán)境為弱酸性環(huán)境,且大多有機磷類農(nóng)藥在酸性環(huán)境中較穩(wěn)定,因此試驗選擇在提取前增加乙酸溶液浸泡步驟,并比較了不同體積分數(shù)(0.2%,0.5%,1%,2%,3%)乙酸溶液的浸泡效果[17]。結果顯示:當乙酸溶液體積分數(shù)不大于1%時,提取溶液為淺紅色;乙酸溶液體積分數(shù)繼續(xù)增加,提取溶液的顏色隨之加深,說明共萃取物色素雜質(zhì)增多?？紤]到基質(zhì)效應影響,試驗選擇乙酸溶液的體積分數(shù)為1%。

為了提高農(nóng)藥在提取溶劑中的溶解度,試驗選擇在用乙腈提取時加入質(zhì)量比4∶1的無水硫酸鎂和無水硫酸鈉混合粉末,并考察了混合粉末用量(5,7.5,10 g)對加標樣品中30種農(nóng)藥回收率的影響。結果顯示:回收率隨著混合粉末用量的增加而增大,尤其是甲胺磷和涕滅威;當混合粉末的用量不小于7.5 g時,回收率均達到80.0%以上,且基本穩(wěn)定,說明此時的鹽析效果較好。綜合考慮,試驗選擇混合粉末的用量為7.5 g。

2.3 凈化條件的選擇

分別采用傳統(tǒng)QuECh ERS 吸附劑(無水硫酸鎂900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅膠300 mg、GCB 90 mg)和去除GCB 后的Qu ECh ERS吸附劑(無水硫酸鎂900 mg,PSA 300 mg,C18300 mg、硅膠300 mg)凈化加標樣品(加標量0.05 mg·kg-1),并比較了其中殺蟲脒和磺隆類農(nóng)藥回收率的變化。結果顯示:傳統(tǒng)吸附劑去除丹參中色素的效果稍好,但是由于GCB對于部分農(nóng)藥有很明顯的吸附,氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆和殺蟲脒的回收率明顯下降,其中殺蟲脒的回收率低于50.0%,磺隆類農(nóng)藥的回收率為69.0%～82.0%;而采用去除GCB后的Qu ECh ERS吸附劑凈化時,殺蟲脒回收率提高至87.2%,磺隆類農(nóng)藥的回收率提高至85.0%～96.0%,且其他農(nóng)藥的回收率沒有明顯變化。鑒于此,試驗選擇采用不添加 GCB 的Qu ECh ERS吸附劑凈化樣品。

2.4 保護劑種類及用量的選擇

試驗發(fā)現(xiàn),樣品溶液在空氣中的暴露時間(包括樣品前處理時間和前處理后樣品溶液放置時間)越長,丹參中部分有機磷類農(nóng)藥回收率越低。如當整個暴露時間達到90 min時,內(nèi)吸磷、甲拌磷砜、苯線磷的回收率分別為48.0%,70.0%和75.0%,推測丹參提取溶液中這幾種有機磷類農(nóng)藥在前處理過程中發(fā)生了氧化或降解。鑒于此,試驗選擇在樣品前處理過程中加入一定量的保護劑,如抗壞血酸和二硫蘇糖醇等來降低有機磷類農(nóng)藥的降解。當二硫蘇糖醇溶液和抗壞血酸溶液的質(zhì)量濃度均為1.0 mol·L-1時,比較了添加不同抗氧化劑后30種農(nóng)藥的穩(wěn)定時間。結果顯示:添加二硫蘇糖醇溶液后,30種農(nóng)藥峰面積在8 h內(nèi)無明顯變化;添加抗壞血酸溶液后,內(nèi)吸磷的峰面積在4 h后逐漸降低,8 h時后下降了33%。因此,試驗選擇的保護劑為二硫蘇糖醇溶液,并考察了不同二硫蘇糖醇溶液用量(0,10,50,100,200μL)對加標樣品(加標量0.05 mg·kg-1)中內(nèi)吸磷、甲拌磷砜、苯線磷回收率的影響,結果見圖2。

圖2 不同二硫蘇糖醇溶液用量下苯線磷、甲拌磷砜、內(nèi)吸磷的回收率Fig.2 Recoveries of phenophos,phorate sulfone and fenamiphos with different amounts of dithiothreitol solution

由圖2 可知:添加了二硫蘇糖醇溶液后,內(nèi)吸磷、甲拌磷砜和苯線磷的回收率有明顯的提高,且隨著用量的增加而增大,當二硫蘇糖醇溶液用量不小于100μL時,回收率較高且保持穩(wěn)定。因此,試驗選擇的二硫蘇糖醇溶液用量為100μL,并進一步考察了此用量的二硫蘇糖醇溶液添加前后加標樣品(加標量0.05 mg·kg-1)中30種農(nóng)藥回收率的變化,結果見表2。

表2 添加二硫蘇糖醇溶液前后30種農(nóng)藥的回收率Tab.2 Recoveries of the 30 pesticides before and after addition of dithiothreitol solution

由表2可知,添加二硫蘇糖醇溶液100μL 后,內(nèi)吸磷、甲拌磷砜和苯線磷的回收率分別從48.0%,70.0%,75.0%提高至94.3%,95.5%,98.7%,其他農(nóng)藥的回收率并無明顯變化,30種農(nóng)藥的回收率為85.8%～108%,說明以二硫蘇糖醇溶液作保護劑時方法的準確度較高。

2.5 標準曲線、檢出限和測定下限

為了降低基質(zhì)效應的影響,以基質(zhì)匹配法定量。按照試驗方法測定基質(zhì)匹配混合標準溶液系列,以各農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示,30種農(nóng)藥標準曲線的線性范圍為10～150μg·L-1,其他線性參數(shù)見表3。

以空白樣品溶液加標的方法進行試驗,分別以不小于3倍、10倍信噪比對應的質(zhì)量濃度計算檢出限和測定下限,結果見表3。

表3 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.3 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

表3 (續(xù))

由表3 可知,30 種農(nóng)藥的檢出限為0.001～0.005 mg·kg-1,測定下限為0.005～0.020 mg·kg-1。

2.6 精密度和回收試驗

按照試驗方法對空白樣品進行3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平均重復測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表4。

由表4 可知,30 種農(nóng)藥的回收率為81.3%～110%,測定值的RSD為1.3%～11%,說明方法的精密度和準確度均較好。

表4 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

表4 (續(xù))

2.7 樣品分析

按照試驗方法分析3批市售丹參樣品,僅在一批樣品中檢出滅線磷,檢出量為0.012 mg·kg-1,其他農(nóng)藥均未檢出。

本工作在酸性環(huán)境中,以乙腈作提取溶劑提取丹參樣品中30 種殘留農(nóng)藥;以去除了GCB 的QuEChERS吸附劑凈化樣品溶液,有效降低了丹參中氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆和殺蟲脒的吸附損失;以二硫蘇糖醇作保護劑,降低了內(nèi)吸磷、甲拌磷砜和苯線磷的降解損失;以UHPLC-MS/MS測定30種農(nóng)藥的殘留量,方法檢測對象涵蓋了《中華人民共和國藥典》(2020年版)第五法中全部農(nóng)藥殘留檢測項目,檢出限、精密度和準確度滿足農(nóng)藥殘留檢測的技術要求,可為中藥材丹參中農(nóng)藥殘留的快速篩查提供一種高效、可靠的分析手段。