新型黃病毒NALSV檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

車 金 ，姜 峰，陳 瑤，畢譽(yù)丹，周奕辰，姜鳳華，馬永春，楊鵬飛，趙永祥，陳澤良，韓小虎

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 重要家畜疫病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110161；2.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110161；3.丹東市農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 丹東 118000；4.丹東市第六人民醫(yī)院，遼寧 丹東 118002）

蜱隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門（Arthropoda）、蛛型綱（Arachnida）、螨亞綱（Acari）、寄螨總目（Parasitiformes）、蜱目（Ixodides）、蜱總科（Ixodoidea），其下又包括4 個(gè)科：硬蜱科（

Ixodidae

）、軟蜱科（

Argasidae

）、納蜱科（

Nuttalliellidae

）和恐蜱科（

Deinocrotonidae

）。蜱是專性吸血的非永久性寄生蟲，其生活史分為卵、幼蜱、若蜱和成蜱4 個(gè)階段，后3 個(gè)階段的蜱可以自由活動(dòng)，且均需要吸血寄生。全球現(xiàn)有蜱類約900 余種，我國(guó)蜱類物種多樣性較高，已報(bào)道1 25 種，其中硬蜱111 種，軟蜱14 種。蜱可攜帶并傳播多種病原體，并可經(jīng)期傳播，是僅次于蚊子的第二大病原傳播媒介，也是家畜和野生動(dòng)物病原體最重要的傳播媒介。黃病毒科病毒為單股正鏈且不分節(jié)段的RNA 病毒，長(zhǎng)度約為11kb，包括肝炎病毒屬（

Hepacivirus

）、黃病毒屬（

Flavivirus

）、瘟病毒屬（

Pestivirus

）和持續(xù)性 G 病毒屬（

Pegivirus

）。其中黃病毒屬共有70余種病毒，包括熟知的登革病毒（Dengue virus）、流行性乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus）、森林腦炎病毒（Tick-borne encephalitis virus）、寨卡病毒（Zika virus）、黃熱病病毒（Yellow fever virus）、西尼羅河病毒（West Nile virus）等。這些病毒中的大部分可通過蜱、蚊等媒介生物傳播給人類、家畜及野生動(dòng)物，對(duì)人類公共衛(wèi)生安全構(gòu)成威脅。隨著對(duì)蜱、蚊等媒介生物的反向病原學(xué)的深入研究，越來越多的未知病原將會(huì)被人們所識(shí)別，并且預(yù)測(cè)其中以黃病毒科成員居多。荊門病毒（Jingmenvirus，JMV）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種RNA 病毒，與黃病毒的NS3 和NS5 基因具有同源性，主要傳播媒介為節(jié)肢動(dòng)物，因此被歸為黃病毒科。后來通過高通量測(cè)序技術(shù)又發(fā)現(xiàn)了與荊門病毒基因組結(jié)構(gòu)相似的病毒，包括Alongshan virus（即阿龍山病毒）、Wuhan flea virus、Mogiana tick virus及Guaico Culex virus 等。在國(guó)際病毒分類委員會(huì)對(duì)其正式命名前，這些病毒暫時(shí)被歸為一個(gè)新的屬，即荊門病毒屬。其中除Alongshan virus外，其余病毒尚無直接導(dǎo)致人類感染發(fā)病的證據(jù)。

阿龍山病毒（Alongshan Virus，ALSV）是全球范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)感染人的分節(jié)段黃病毒，分為4 個(gè)節(jié)段，全基因組長(zhǎng)度為11350bp。在我國(guó)內(nèi)蒙古呼倫貝爾、芬蘭東南部和俄羅斯均有發(fā)現(xiàn)，可通過蜱叮咬感染哺乳動(dòng)物，并在此間循環(huán)傳播。ALSV 引起新發(fā)傳染病阿龍山熱，主要臨床癥狀有發(fā)熱（體溫38.5～39.2℃）、持續(xù)性中度頭痛、乏力、惡心并伴有咳嗽、咽部不適、右側(cè)頸淋巴結(jié)腫大疼痛、精神沉郁、肌痛、關(guān)節(jié)痛、皮疹等，目前無專門針對(duì)ALSV 感染后的特效治療藥物，只能進(jìn)行對(duì)癥治療。阿龍山病毒在養(yǎng)殖動(dòng)物和野生動(dòng)物中的感染與流行情況，目前尚無系統(tǒng)的研究，也沒有相關(guān)報(bào)道。

2018 年，本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)采集自遼寧省丹東市的蜱進(jìn)行宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序時(shí)，發(fā)現(xiàn)一種新的病毒核酸（GenBank登錄號(hào)：MZ676705.1），與其親緣關(guān)系最為接近的是阿龍山病毒（糖蛋白VP1 基因相似度為72%），尚未能人工分離得到該病毒，暫命名為新型阿龍山病毒（New Alongshan Virus，NALSV）。丹東地區(qū)蜱分布廣泛，是多種蜱傳病流行的熱點(diǎn)地區(qū)，每年都有部分不明原因的發(fā)熱病人未能明確病原。目前尚無確切證據(jù)表明NALSV可感染人類，但其作為一種潛在人獸共患病病原的可能性隨時(shí)存在。因此，建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，對(duì)蜱傳病尤其是不明原因發(fā)熱病人的病原學(xué)檢測(cè)，以及對(duì)該病毒開展進(jìn)一步的病原生態(tài)學(xué)研究都具有重要意義。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)（Quantitative Real-time PCR）具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可定量等多種優(yōu)點(diǎn)，廣泛運(yùn)用于各種分子生物學(xué)檢測(cè)，結(jié)果可靠且效果顯著。本實(shí)驗(yàn)選取NALSV的糖蛋白VP1基因序列進(jìn)行引物探針設(shè)計(jì)，優(yōu)化反應(yīng)條件，最終建立了該病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法。采用該技術(shù)對(duì)采集自遼寧及內(nèi)蒙古部分地區(qū)環(huán)境中的游離蜱進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該技術(shù)具有良好的實(shí)用性，同時(shí)顯示NALSV 在部分地區(qū)的蜱體內(nèi)具有較高的感染率，需引起足夠的警惕與重視。

1 材料與方法

1.1 材料

供試NALSV 核酸來自本實(shí)驗(yàn)室提取的蜱核酸；陽性對(duì)照為載有阿龍山病毒（GenBank 登錄號(hào)：MH158416）、黃熱病病毒（GenBank 登錄號(hào)：MZ604855）、流行性乙型腦炎病毒（GenBank 登錄號(hào)：DQ648597）和森林腦炎病毒（GenBank登錄號(hào)：MF565480）相應(yīng)序列核酸的質(zhì)粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；540 頭蜱樣本是2020～2021 年使用布旗法采集自遼寧省及內(nèi)蒙古自治區(qū)的游離蜱，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察判定：采集自遼寧省內(nèi)的蜱樣本為草原革蜱（

Dermacentor nuttalli

）和長(zhǎng)角血蜱（

Haemaphysalis longicornis

），采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)的蜱樣本為森林革蜱（

Dermacentor silvarum

）和草原革蜱。試驗(yàn)采用的QuantStudio 3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀為Applied Biosystems 公司生產(chǎn)；pET-28a 載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；核酸提取試劑盒、BL21 大腸桿菌表達(dá)菌株感受態(tài)細(xì)胞（

Escherichia coli

）、限制性內(nèi)切酶QuickCutEcoRⅠ及QuickCutHind Ⅲ購自全式金生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、AceQ Universal UProbe Master Mix V2 酶購自南京Vazyme 生物科技股份有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)宏基因組測(cè)序結(jié)果，結(jié)合NCBI上的核酸序列，選擇NALSV 糖蛋白VP1基因片段，選取其保守區(qū)，根據(jù)引物和TaqMan 探針設(shè)計(jì)原則（Tm 值、GC%等），使用Primer 6.0 設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物，通過GenBank 數(shù)據(jù)庫BLAST 進(jìn)行特異性和保守性比較分析，確定NALSV 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)的引物及 TaqMan 探針。上游引物：5’- TACGCATTTGCCGTCTGACC-3’，下游引物：5’- AACGGAGTCATCTGGGGGAG -3’，片段長(zhǎng)度為126bp，探針：5’- TCACGTTGTGGTGTTGCCTGGCCGT -3’，5’端FAM 熒光素標(biāo)記，3’端 BHQ1 標(biāo)記。普通 PCR 上游引物：5’- CTCAACTTCCGCCGTCTC -3’，下游引物：5’- GCACCTACTACCTCGTCCC-3’，片段長(zhǎng)度為473bp。引物探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 NALSV標(biāo)準(zhǔn)品的制備 蜱清洗研磨，經(jīng)離心處理后，取蜱懸液上清200μL，移到1.5mL的離心管中，按照試劑盒（EasyPure Viral DNA/RNA Kit）內(nèi)說明書進(jìn)行核酸提取，對(duì)已經(jīng)提取的RNA 按照試劑盒（Vazyme HiS-cript ⅡQRT Super Mix）內(nèi)說明書進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

取蜱核酸進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增；將瓊脂糖凝膠電泳后的PCR 產(chǎn)物連接到pET-28a 載體上，然后轉(zhuǎn)化到BL21大腸桿菌表達(dá)菌株感受態(tài)細(xì)胞，小提質(zhì)粒后利用分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒的濃度為75ng·μL，計(jì)算其拷貝數(shù)。

1.2.3 反應(yīng)體系的優(yōu)化 以構(gòu)建好的NALSV標(biāo)準(zhǔn)品為陽性模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，引物探針濃度的優(yōu)化采用矩陣法，引物濃度從 0.1～1.0μmol·L區(qū)間每 0.1μmol·L遞增，探針濃度從 50～250nmol·L區(qū)間每50nmol·L遞增，根據(jù)各組所得C值以及擴(kuò)增曲線形態(tài)，確定引物探針的最佳濃度及配比；模板濃度的優(yōu)化采用每20μL體系模板的加入量從1～6μL區(qū)間每1μL遞增，根據(jù)各組所得C值及擴(kuò)增曲線形態(tài)，確定模板的最佳濃度。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以連續(xù)10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，所用濃度為1.0×10～1.0×10copies·μL，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)5個(gè)重復(fù)，所得結(jié)果舍去1個(gè)最大值、1個(gè)最小值，余下的3個(gè)結(jié)果取平均值。選取5組連續(xù)數(shù)據(jù)，以C值為Y軸、拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為X軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算斜率及相關(guān)系數(shù)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的評(píng)價(jià) 用所建立的方法，對(duì)ALSV、YFV、JEV、TBEV進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，測(cè)試所建立方法的特異性。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，并用ddHO設(shè)陰性對(duì)照組。

陽性標(biāo)準(zhǔn)品用TE 緩沖液稀釋到最低拷貝數(shù)（1.0×10copies·μL），采用最終優(yōu)化條件進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)試所建立方法的敏感性。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，并用ddHO設(shè)陰性對(duì)照組。

在同組實(shí)驗(yàn)中，使用已稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（1.0×10～1.0×10copies·μL）進(jìn)行反應(yīng)，計(jì)算平均C值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)，測(cè)試所建立方法的重復(fù)性。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，并用ddHO設(shè)陰性對(duì)照組。

為分析不同時(shí)段實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異性，即實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，每間隔1周進(jìn)行1次反應(yīng)，計(jì)算平均C值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，并用ddHO設(shè)陰性對(duì)照組。

選用不同濃度的NALSV 陽性標(biāo)準(zhǔn)品[（1.0×10～1.0×10）copies·μL]，進(jìn)行普通PCR 反應(yīng)，反應(yīng)程序：94℃5min，94℃ 30s，56℃ 20s，72℃ 30s，72℃ 10min，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6 蜱樣本檢測(cè) 蜱樣本經(jīng)核酸提取及逆轉(zhuǎn)錄后（方法同1.4），進(jìn)行NALSV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

測(cè)得的OD/OD為1.8～2.1，所得的NALSV標(biāo)準(zhǔn)品濃度為75ng·μL，經(jīng)計(jì)算得出NALSV標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為1.17×10copies·μL，陽性標(biāo)準(zhǔn)品用TE緩沖液進(jìn)行連續(xù)10倍梯度稀釋（10～10copies·μL）。

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過引物探針濃度的配比以及模板濃度的篩選（圖1 和圖2），優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：AceQ Universal UProbe Master Mix V2 混合液 10μL，探針（10nmol·L）0.5μL，上、下游引物（10nmol·L）各 0.6μL，cDNA 模板3μL，ddHO 補(bǔ)足至 20μL；優(yōu)化后的反應(yīng)條件為：95℃ 5min，95℃ 10s，58℃ 30s，45 個(gè)循環(huán)，于58℃時(shí)收集熒光信號(hào)。

圖1 NALSV引物探針濃度優(yōu)化Figure 1 Primer probe concentration optimization for NALSV

圖2 NALSV模板濃度優(yōu)化Figure 2 Template concentration optimization for NALSV

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取8個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（1.0×10～1.0×10copies·μL）為實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)模板，采用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選取5個(gè)連續(xù)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品（1.0×10～1.0×10copies·μL），以實(shí)驗(yàn)所得C值為Y軸、對(duì)應(yīng)的各陽性質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)為X 軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），得出NALSV 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.4436，反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)

R

為0.9999，其標(biāo)準(zhǔn)方程為

y

=-3.4436

x

+33.063，表明所建立的方法相關(guān)性良好（圖4）。

圖3 梯度濃度為1.0×109 ～1.0×102copies·μL-1的NALSV實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增圖Figure 3 Real-time qPCR amplification image of NALSV with gradient concentration of 1.0×109-1.0×102copies·μL-1

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NALSV標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 4 The standard curve of the NALSV real-time qPCR assay

2.4 NALSV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

2.4.1 特異性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖5），僅有陽性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他反應(yīng)及陰性對(duì)照均無擴(kuò)增，表明所建立的方法特異性良好。

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NALSV特異性實(shí)驗(yàn)Figure 5 Specific experiment for NALSV by Real-time qPCR

2.4.2 敏感性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖6），NALSV 陽性標(biāo)準(zhǔn)品可檢出的最低拷貝數(shù)為2.5×10 copies·μL，表明所建立的方法敏感性良好。

圖6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NALSV敏感性實(shí)驗(yàn)Figure 6 Sensitivity test for NALSV by Real-time qPCR

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NALSV變異系數(shù)低于0.5%，表明所建立的方法重復(fù)性良好（表1）。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NALSV重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
Table 1 Reproducibility experiment for detecting NALSV by Real-time qPCR

注：SD.標(biāo)準(zhǔn)差；CV.變異系數(shù)。
Note：SD.standard deviation;CV.coefficients of variation

拷貝數(shù)/（copies·μL-1）Number of copies 1.0×108 1.0×107 1.0×106 1.0×105 1.0×104 CT 值CT value 12.471 15.737 19.322 22.598 26.214 12.491 15.906 19.188 22.812 26.319 12.395 15.816 19.387 22.654 26.125 CT平均值Mean CT 12.452 15.820 19.299 22.688 26.219標(biāo)準(zhǔn)差SD 0.041 0.069 0.083 0.091 0.079變異系數(shù)CV/（%）0.33 0.43 0.43 0.40 0.30

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（表2），5組不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒在不同時(shí)間段進(jìn)行反應(yīng)，其C值無顯著變化，表明所建立的方法穩(wěn)定性良好。

表2 冷凍保存的質(zhì)粒于不同時(shí)間段進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)所得C值
Table 2 C value of standard detected by Real -time PCR at different time

時(shí)間Time第1周First week第2周Second week第3周Third week第4周Fourth week CT值（CT value）1.0×108copies·μL-1 12.682±0.06 12.991±0.09 13.225±0.12 13.741±0.14 1.0×107copies·μL-1 15.992±0.08 16.384±0.09 16.714±0.11 17.386±0.14 1.0×106copies·μL-1 19.591±0.08 19.921±0.09 20.387±0.14 20.914±0.16 1.0×105copies·μL-1 22.942±0.07 23.316±0.10 23.681±0.09 24.498±0.13 1.0×104copies·μL-1 26.578±0.11 26.824±0.09 27.119±0.15 27.883±0.18

2.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR與普通PCR敏感性比較 對(duì)比實(shí)時(shí)熒光定量PCR 與普通PCR 的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，普通PCR 對(duì)NALSV 陽性標(biāo)準(zhǔn)品可檢出的最低拷貝數(shù)為1.0×10copies·μL，遠(yuǎn)高于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)NALSV陽性標(biāo)準(zhǔn)品可檢出的最低拷貝數(shù)2.5×10copies·μL。

2.5 蜱樣本檢測(cè)

取2020 及2021 年采集于遼寧省及內(nèi)蒙古自治區(qū)共計(jì)18 個(gè)地區(qū)環(huán)境中的540 頭游離蜱，其中森林革蜱92頭，長(zhǎng)角血蜱281 頭，草原革蜱167 頭。用NALSV 的Real-time qPCR 方法進(jìn)行樣本檢測(cè)。結(jié)果顯示，陽性對(duì)照及234頭蜱樣本出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他蜱樣本及陰性對(duì)照均為無擴(kuò)增曲線，陽性率為43.3%，其中森林革蜱陽性率29.3%，長(zhǎng)角血蜱陽性率63.7%，草原革蜱陽性率34.7%。檢測(cè)結(jié)果表明所建立的方法可初步用于NALSV的檢測(cè)。

3 討論與結(jié)論

蜱、蚊等節(jié)肢動(dòng)物是黃病毒科成員的主要載體和傳播媒介。近年來，隨著全球氣候變暖與生態(tài)環(huán)境的不斷改變、城市化進(jìn)程的加快、旅游和貿(mào)易的快速發(fā)展，導(dǎo)致包括蜱在內(nèi)的病媒生物的分布有持續(xù)擴(kuò)大的趨勢(shì)。此外，動(dòng)物的運(yùn)輸和候鳥等野生動(dòng)物的遷徙可為蜱及其攜帶病原實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離傳播提供了可能性。黃病毒科成員種類眾多且不斷有新的成員被發(fā)現(xiàn)，其中許多種病毒是重要的人獸共患病病原體，已經(jīng)成為了全球性的公共衛(wèi)生問題。它們主要通過蚊或蜱等媒介生物傳播，可導(dǎo)致人的病毒性出血熱，表現(xiàn)為昏迷、發(fā)燒、抽搐、嘔吐、頭疼、嗜睡、關(guān)節(jié)及肌肉疼痛、皮疹等癥狀，甚至導(dǎo)致死亡，對(duì)人類健康構(gòu)成重大的威脅。部分黃病毒成員目前被認(rèn)為是潛在的病原，尚未證實(shí)其可導(dǎo)致人體發(fā)病，但隨著病毒基因組的不斷進(jìn)化、重組，其感染性和致病性可能隨之發(fā)生改變，未來存在感染人和動(dòng)物的風(fēng)險(xiǎn)。

ALSV 是一種新發(fā)現(xiàn)的蜱傳黃病毒，由于其對(duì)人的嚴(yán)重危害而引起了世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。但與SLSV親緣關(guān)系較近的NALSV 為本實(shí)驗(yàn)室首次識(shí)別，其對(duì)人和動(dòng)物的致病性、在自然界的分布與傳播等工作尚未系統(tǒng)開展。這些工作有賴于靈敏、快速、準(zhǔn)確的診斷技術(shù)的研發(fā)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、快速高效、具有很高的敏感性和特異性，且封閉性好，不需要后續(xù)處理，造成核酸污染的可能性較低，顯著的優(yōu)越性使得該方法在生物技術(shù)方面應(yīng)用廣泛。

本實(shí)驗(yàn)選取NALSV病原的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，通過對(duì)反應(yīng)條件及反應(yīng)體系的優(yōu)化，最終建立了基于TaqMan 探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，表明所建立的方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、線性關(guān)系良好、重復(fù)性良好、穩(wěn)定性良好。為進(jìn)一步驗(yàn)證所建立方法的臨床適用性，對(duì)采集自遼寧省及內(nèi)蒙古自治區(qū)環(huán)境中的540份蜱樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NALSV 的陽性檢出率為43.3%，表明本方法適用于樣本的檢測(cè)，同時(shí)說明該病毒在各地的蜱中均有廣泛分布。東北地區(qū)東部的長(zhǎng)白山區(qū)、西部的努魯爾虎山區(qū)均是蜱傳病的高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)，每年都有大量的農(nóng)民、牧民等人群被蜱攻擊，且近年來蜱蟲的分布范圍有明顯的擴(kuò)大趨勢(shì)，具備病毒傳播、擴(kuò)散的條件。雖尚無NALSV導(dǎo)致人感染發(fā)病的報(bào)道，但其作為潛在人獸共患傳染病的風(fēng)險(xiǎn)隨時(shí)存在，也可能作為伴發(fā)感染而導(dǎo)致其它蜱傳病的病情復(fù)雜化，不利于精準(zhǔn)診斷和治療。因此，經(jīng)常出入林區(qū)、在野外工作的人員以及相關(guān)疾控部門需引起足夠重視。個(gè)人要加強(qiáng)自身防護(hù)，管理部門要具有憂患意識(shí)，未雨綢繆，建立起完善的病毒監(jiān)測(cè)體系及流行病學(xué)資料庫，做到早發(fā)現(xiàn)、早報(bào)告、早治療。相關(guān)科研人員也應(yīng)加大對(duì)NALSV的病原生態(tài)、感染機(jī)制等方面的研究，以期對(duì)該病毒有更深入的認(rèn)識(shí)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所建立的NALSV 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、線性關(guān)系良好、重復(fù)性良好、穩(wěn)定性良好等特點(diǎn)，為NALSV 的病原檢測(cè)提供了新的技術(shù)方法，為NALSV 的分布監(jiān)測(cè)、臨床診斷及相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義及應(yīng)用價(jià)值。