兩種瑤藥酊劑微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)及結(jié)果分析

劉康連 龐云娟* 龍文洲 顏金蘭 龐蘭英 莫海濤

1.玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心,廣西 玉林 537000;2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004;3.廣西子持醫(yī)藥科技有限公司，廣西 南寧 530299

抗風(fēng)濕止痛酊和抗骨質(zhì)增生酊均為玉林市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，為瑤方外用液體制劑，療效確切，可廣泛應(yīng)用于臨床。目前中藥外用酊劑療效顯著，前景廣闊[1], 對(duì)其進(jìn)行微生物限度的檢查是控制藥品質(zhì)量的重要檢查項(xiàng)目之一，控制其質(zhì)量是保證臨床安全用藥的前提[1-4]。本研究根據(jù)其給藥途徑和處方，按照《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020年版四部通則1107的有關(guān)規(guī)定[4]，對(duì)其進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)方法的適用性試驗(yàn)以及控制菌——金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的檢查的適用性試驗(yàn)，建立抗風(fēng)濕止痛酊和抗骨質(zhì)增生酊的微生物限度檢查法并加以驗(yàn)證，保證微生物限度檢查方法的科學(xué)性、可靠性和準(zhǔn)確性，為確保其微生物限度檢查指標(biāo)符合要求，更好地控制其質(zhì)量提供標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]，金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]，白色念珠菌[CMCC(F)98001]，黑曲霉[CMCC(F)98003]，大腸埃希菌[CMCC(B)44102]，從廣東環(huán)凱微生物科技有限公司購買西林瓶凍干粉菌種，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)活傳代并制備成甘油凍存管保存。其中銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、黑曲霉使用的是第二代，枯草芽孢桿菌、白色念珠菌使用的是第三代，金黃色葡萄球菌使用的是第四代。

1.2 培養(yǎng)基與試劑 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基TSA、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基TSB、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基SDA，沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基SDB、pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司所產(chǎn))；0.9%無菌氯化鈉溶液(廣東光華科技股份有限公司)、吐溫80(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

1.3 儀器 霉菌培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠，型號(hào)LRH-150-M)，SPX-150F-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱(上海龍躍儀器有限公司)，生物安全柜(蘇州安春游空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)BHC-1300HA2)，立式壓力蒸汽滅菌器(雅馬拓科技貿(mào)易有限公司，型號(hào)SQ810C)，真空泵兩頭套裝(密理博Milliflexplus)S25型圓周振蕩器(德國IKA)，電動(dòng)助吸器Eppendorf Easypet 3(德國Eppendorf)、艾本德移液器(100～1000 μL，德國Eppendorf)等。

1.4 試驗(yàn)樣品 抗風(fēng)濕骨痛酊(批號(hào)：200403、200410、200417)，抗骨質(zhì)增生酊(批號(hào)：200424、200508、200515)，均由廣西玉林市中醫(yī)醫(yī)院提供。

2 方法

2.1 菌懸液的制備 按照《中國藥典》2020年版四部關(guān)于菌種的培養(yǎng)制備要求，并參考菌懸液制備方法進(jìn)行制備，制備成每1 mL含菌數(shù)不大于100 cfu的菌懸液，備用。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法[5-6]

2.2.1 方法1 1∶10供試液10 mL(即原液1 mL)/膜。取本品10 mL加至90 mL含1%聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液中，制成1∶10的供試液，1∶10供試液10 mL薄膜過濾，沖洗量從100 mL開始，以2倍遞增的沖洗量至800 mL。

2.2.2 方法2 1∶10供試液10 mL(即原液1 mL)/膜。取1∶10供試液10 mL加至90 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，薄膜過濾，用0.9%氯化鈉溶液沖洗，每次沖洗100 mL，以2倍遞增的沖洗量至800 mL。

2.2.3 方法3 1∶10供試液1 mL/膜。取1∶10供試液1 mL加至 100 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，薄膜過濾，沖洗量從100 mL開始。

2.3 回收率試驗(yàn)[6-8]試驗(yàn)組：取已滅菌的薄膜過濾器，每個(gè)濾器先加入約20 mL稀釋液潤濕濾膜，再分別按“2.2”中方法操作加入供試液后，分別取不大于100 cfu的菌液1 mL，并緩慢地把菌液分散打進(jìn)薄膜過濾器中與稀釋液、供試液相混，抽濾。再分別按照上述沖洗量進(jìn)行沖洗，濾干后，取膜貼種于提前準(zhǔn)備好的瓊脂培養(yǎng)基平板。

菌液組：不含聚山梨酯80的稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作，將相應(yīng)菌液按照薄膜過濾法過濾，每一種培養(yǎng)基的菌液組平行制備2張膜，將膜貼種于相應(yīng)培養(yǎng)基。

中和劑對(duì)照組：用稀釋液替代供試液，同試驗(yàn)組操作，將相應(yīng)菌液按照薄膜過濾法過濾，每一種培養(yǎng)基的菌液組平行制備2張膜，將膜貼種于相應(yīng)培養(yǎng)基。

供試品對(duì)照組：除不加菌液外，其余操作同試驗(yàn)組，按照一定的沖洗量沖洗，每一種培養(yǎng)基的供試品對(duì)照組平行制備2張膜，將膜貼種于相應(yīng)培養(yǎng)基。

需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)相應(yīng)的培養(yǎng)基為胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，試驗(yàn)菌預(yù)實(shí)驗(yàn)選金黃色葡萄球菌作為敏感菌株，驗(yàn)證試驗(yàn)為金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉。霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)傾注的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，試驗(yàn)菌株預(yù)實(shí)驗(yàn)為白色念珠菌，驗(yàn)證試驗(yàn)為白色念珠菌、黑曲霉。待培養(yǎng)基凝固后，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板于33 ℃培養(yǎng)，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板于23 ℃培養(yǎng)，其中試驗(yàn)菌為枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)不超過 3 d，試驗(yàn)菌為白色念珠菌和黑曲霉的培養(yǎng)基平板培養(yǎng)不超過5 d。

結(jié)果判斷：中和劑對(duì)照組和試驗(yàn)組的加菌回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)則照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測定供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的回收比值，若任一次試驗(yàn)中比值低于0.5，應(yīng)采用適宜的方法重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。

中和劑對(duì)照組加菌回收比值=中和劑對(duì)照組的菌落數(shù)-菌液對(duì)照組的菌落數(shù)/菌液對(duì)照組菌落數(shù)。試驗(yàn)組加菌回收比值=試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品組菌落數(shù))/菌液對(duì)照組菌落數(shù)。

3 微生物計(jì)數(shù)法適用性試驗(yàn)結(jié)果[7-10]

3.1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 取每個(gè)品種的1個(gè)批號(hào)按“2.1”至“2.3”的順序進(jìn)行加菌預(yù)試驗(yàn),預(yù)試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 預(yù)試驗(yàn)金黃色葡萄球菌回收比值結(jié)果

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)金黃色葡萄球菌回收比值結(jié)果， 1∶10 供試液10 mL 直接薄膜過濾和1∶10供試液10 mL加至90 mL稀釋液中薄膜過膜，沖洗量800 mL/膜時(shí)，抗風(fēng)濕骨痛酊和抗骨質(zhì)增生酊的金黃色葡萄球菌回收比值均小于0.5，說明抗風(fēng)骨痛酊和抗骨質(zhì)增生酊對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌作用，此兩法仍未能消除供試品溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用。而采用 1∶10供試液1 mL加至100 mL稀釋液中，過膜、沖洗量100 mL/膜的方法，抗風(fēng)濕止痛酊和抗骨質(zhì)增生酊試驗(yàn)組中金黃色葡萄球菌回收比值分別為0.86和0.77，而且中和劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)比值為0.98，在0.5～2范圍內(nèi)，表明兩種瑤藥酊劑采用該方法進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)應(yīng)該可行。

3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 選白色念珠菌作為霉菌和酵母總數(shù)計(jì)數(shù)方法的預(yù)試驗(yàn)菌，取每個(gè)品種的1個(gè)批號(hào)按照“2.2.1”進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 預(yù)試驗(yàn)白色念珠菌回收比值結(jié)果

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)白色念珠菌回收比值結(jié)果，抗風(fēng)濕骨痛酊1∶10供試液10 mL，薄膜過濾，沖洗量100 mL/膜的試驗(yàn)組白色念珠菌回收比值為0.91，在0.5～2范圍內(nèi)，采用該方法進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)應(yīng)該可行?？构琴|(zhì)增生酊1∶10供試液10 mL，薄膜過濾，沖洗量200 mL/膜的試驗(yàn)組白色念珠菌回收比值為0.58，而且中和劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)比值為1.02，在0.5～2范圍內(nèi)，采用該方法進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)應(yīng)該可行。

3.3 微生物計(jì)數(shù)法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)：抗風(fēng)濕骨痛酊和抗骨質(zhì)增生酊按照薄膜過濾法(1∶10供試液1 mL加至100 mL稀釋液中，沖洗量100 mL/膜)進(jìn)行3個(gè)批號(hào)5種試驗(yàn)菌的加菌回收試驗(yàn)；霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)：抗風(fēng)濕骨痛酊按照薄膜過濾法(1∶10供試液10 mL，沖洗量100 mL/膜)、抗骨質(zhì)增生酊按照薄膜過濾法(1∶10供試液10 mL，沖洗量200 mL/膜)進(jìn)行3個(gè)批號(hào)2種試驗(yàn)菌的加菌回收試驗(yàn)。結(jié)果見表3。

表3 兩種酊劑微生物計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證試驗(yàn)的回收比值結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，采用薄膜過濾法(1∶10供試液1 mL加至100 mL稀釋液中，沖洗量100 mL/膜)對(duì)抗風(fēng)濕骨痛酊和抗骨質(zhì)增生酊需氧菌總數(shù)的測定進(jìn)行加菌回收，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)規(guī)定的5種試驗(yàn)菌回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)；抗風(fēng)濕骨痛酊采用采用薄膜過濾法(1∶10供試液10 mL，沖洗量100 mL/膜)進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)的測定進(jìn)行加菌回收，抗骨質(zhì)增生酊采用薄膜過濾法(1∶10供試液10 mL，沖洗量200 mL/膜)進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)的測定進(jìn)行加菌回收，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)規(guī)定的兩種試驗(yàn)菌的回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)。符合《中國藥典》2020年版四部通則1105(非無菌產(chǎn)品微生物：微生物計(jì)數(shù)法)的有關(guān)規(guī)定，方法可行。

3.4 樣品需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查結(jié)果 分別取抗風(fēng)濕止痛酊和抗骨質(zhì)增生酊各3批，按上述確定的方法進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查，結(jié)果樣品中需氧菌總數(shù)菌均小于10 cfu/mL，霉菌和酵母菌總數(shù)均小于1 cfu/mL，符合相關(guān)規(guī)定。

4 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)及結(jié)果

4.1 金黃色葡萄球菌

4.1.1 直接接種法[9-12]試驗(yàn)組：分別取1∶10供試液10 mL接種至100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)中，同時(shí)加入金黃色葡萄球菌不大于100 cfu，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h。取培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板，30～35 ℃培養(yǎng)18～72 h，觀察其菌落形態(tài)。陰性菌對(duì)照組：取大腸埃希菌作為陰性對(duì)照試驗(yàn)菌，方法同試驗(yàn)組。

4.1.2 薄膜過濾法[13-15]試驗(yàn)組：分別取1∶10供試液10 mL過膜，分別沖洗100 mL/膜、200 mL/膜、300 mL/膜，在最后一次沖洗液中加入不大于100 cfu金黃色葡萄球菌，濾膜接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)中， 余下操作同直接接種法。

4.2 銅綠假單胞菌 試驗(yàn)組：分別取1∶10供試液10 mL接種至100 mL、200 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)中，同時(shí)加入金黃色葡萄球菌不大于100 cfu，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，按藥典規(guī)定檢查。陰性菌對(duì)照組：取大腸埃希菌作為陰性對(duì)照試驗(yàn)菌，方法同試驗(yàn)組。

4.3 控制菌適用性試驗(yàn)結(jié)果 兩種酊劑分別先取其中1個(gè)批號(hào)按上述方法進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果為陰性對(duì)照組菌無菌落生長。兩種酊劑試驗(yàn)組結(jié)果見表4。再根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果各取3個(gè)批號(hào)的樣品，進(jìn)行加菌驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果見表5。

表4 控制菌預(yù)實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果

表5 控制菌驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3批樣品的控制菌適用性試驗(yàn)結(jié)果表明，采用薄膜過濾法(1∶10供試液10 mL過膜，沖洗量300 mL/膜，濾膜接種至100 mL TSB)對(duì)抗風(fēng)濕骨痛酊、抗骨質(zhì)增生酊的金黃色葡萄球菌的測定進(jìn)行加菌驗(yàn)證試驗(yàn)，采用直接接種法(1∶10供試液10 mL接種至200 mL TSB)對(duì)抗風(fēng)濕骨痛酊、抗骨質(zhì)增生酊的銅綠假單胞菌的測定進(jìn)行加菌驗(yàn)證試驗(yàn)，符合《中國藥典》2020年版四部通則1106(非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法)的有關(guān)規(guī)定，方法可行。

4.4 樣品控制菌檢查結(jié)果 分別取抗風(fēng)濕止痛酊和抗骨質(zhì)增生酊各3批，按上述確定的方法進(jìn)行控制菌金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的檢查，結(jié)果樣品中均未檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌(1 mL)。

5 結(jié)果分析和討論[16-17]

5.1 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)方法的選擇 抗風(fēng)濕止痛酊和抗骨質(zhì)增生酊均為液體外用制劑，其微生物限度標(biāo)準(zhǔn)如下：需氧菌總數(shù)不超過102 cfu/mL；霉菌和酵母菌總數(shù)不超過101 cfu/mL；不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌(1 mL)。兩種酊劑的溶劑均為55%乙醇，有一定的抑菌作用，用1%聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液作為稀釋液樣品容易過濾，所以在確定需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的測定方法時(shí)，在供試液容易過膜的情況下，優(yōu)先采用薄膜過濾法。

5.2 稀釋劑的選擇 抗風(fēng)濕骨痛酊、抗骨質(zhì)增生酊處方及工藝中并未加入油性物質(zhì)，但是用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液作為稀釋液時(shí)，所制備供試液難以過膜，且后續(xù)沖洗液也是很難過濾沖洗，而用1%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液作為稀釋液時(shí)，則供試液很容易過膜且后續(xù)沖洗液過濾是順暢快速的。筆者查閱了按照2015年《中國藥典》進(jìn)行研究的相關(guān)文獻(xiàn)以及工作中收到藥品生產(chǎn)企業(yè)的微生物限度方法學(xué)研究資料結(jié)合筆者在酊劑微生物限度檢查適用性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用薄膜過濾法對(duì)酊劑進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，用含1%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液作為稀釋液時(shí)，可解決酊劑供試液堵膜、過濾不暢這一難題。

5.3 沖洗量的選擇以及加菌環(huán)節(jié)的選擇 抗風(fēng)濕骨痛酊、抗骨質(zhì)增生酊計(jì)數(shù)方法預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：方法1、方法2沖洗量至800 mL時(shí)，回收比值均小于0.5，表明兩種酊劑均對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用，而方法3沖洗量為100 mL時(shí)，回收比值均能到達(dá)要求。所以對(duì)于抑菌作用較強(qiáng)的酊劑驗(yàn)證方案可采用1∶10供試液10 mL直接過濾、1∶10供試液10 mL加至90 mL稀釋液中混勻過濾、1∶10供試液1 mL加至100 mL稀釋液中混勻過濾的順序進(jìn)行。采用薄膜過濾法進(jìn)行藥品微生物限度檢查適用性試驗(yàn)時(shí)，沖洗量可以選擇每次100 mL，最大沖洗量為500 mL為宜。這樣可以更快速試驗(yàn)出酊劑科學(xué)、快捷、有效的微生物限度檢查計(jì)數(shù)方法。

目前藥典并未明確薄膜過濾法在計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)的加菌環(huán)節(jié)，抗風(fēng)濕骨痛酊、抗骨質(zhì)增生酊兩種瑤藥酊劑的計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)均采用前加菌，即在供試液或稀釋后的供試液中加菌后過濾，再進(jìn)行沖洗。前加菌更能反映藥品本身抑菌作用的強(qiáng)弱，在樣品的特性允許以及沖洗量不大于500 mL的情況下可盡量選擇前加菌試驗(yàn)。