壯藥羊開口的化學(xué)成分研究

劉立輝 鄒 準(zhǔn) 周艷林 鐘小清 呂高榮 周志宏 鄒節(jié)明*

1.桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西 桂林 541004；2. 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500

壯藥羊開口為野牡丹科(Melastomaceae)野牡丹屬(MelastomaL.)植物展毛野牡丹MelastomanormaleD.Don的干燥根，為廣西壯醫(yī)藥習(xí)用藥材，收載于《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(第一卷)》，壯藥名為棵芒難，味甘、酸、澀，微溫，具有收斂、止血、解毒的功效，用于泄痢、崩漏帶下、內(nèi)外傷出血[1]。現(xiàn)代藥理研究[2]表明，羊開口提取物對艾滋病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA多聚酶活性具有抑制作用。羊開口是中成藥三金片系列產(chǎn)品的重要原料之一，目前關(guān)于羊開口化學(xué)成分的研究報道并不多，報道的化學(xué)成分主要包括β-谷甾醇、鞣花酸、沒食子酸及其衍生物等少數(shù)化合物[3]。文獻[4]報道從展毛野牡丹分離得到一些酚類化學(xué)成分，但該化學(xué)成分的種類依然還是沒食子酸衍生物和少量的酚苷類化合物。因此，為進一步認(rèn)識羊開口的化學(xué)成分，明確相關(guān)活性與藥用物質(zhì)基礎(chǔ)，本實驗對羊開口的化學(xué)成分進行了研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV2401PC型紫外可見分光光度計(日本Shimadzu公司)；Finnigan MAT-90型質(zhì)譜儀(美國Finnigan公司)；Bruker AM-400和DRX-500核磁共振儀(德國Bruker公司，TMS為內(nèi)標(biāo))； XP 205電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；MILLI-Q密理博超純水儀(德國Merck公司)；LC-20A型島津半制備高效液相色譜儀(日本島津公司)；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；CCA-1112A冷卻水循環(huán)裝置(上海愛郎儀器有限公司)；WFH-201B暗箱式紫外透射反射儀(上海精科實業(yè)有限公司)。

1.2 材料 柱色譜硅膠(200～300目)和薄層層析硅膠板G(青島海洋化工廠)；反相C18填料(40～60 μm)(日本Fuji公司)；MCI CHP-20(75～150 μm)(日本Mitsubishi Chemical公司)；Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences公司)；提取用乙醇為市售食品級，其余化學(xué)試劑均為市售色譜純或分析純。羊開口采自廣西桂林市永福縣，其原植物經(jīng)中國科學(xué)院廣西植物研究所蔣水元研究員鑒定為展毛野牡丹MelastomanormaleD.Don。植物標(biāo)本存放于桂林三金藥業(yè)股份有限公司企業(yè)技術(shù)中心。

2 提取和分離

羊開口干燥根10 kg，粉碎后加75%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，濾過，濾液合并濃縮成浸膏加水混懸，靜置，出現(xiàn)大量沉淀，濾過，得沉淀(87 g)，濾液用等體積三氯甲烷萃取3 次，三氯甲烷萃取液合并濃縮得到三氯甲烷萃取部位浸膏(11 g)。將三氯甲烷萃取部位浸膏與前所得沉淀分別取樣加適量溶劑溶解，通過在TLC上用相同溶劑系統(tǒng)展開對比，三氯甲烷萃取部位浸膏色譜中，在與前所得沉淀色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。將三氯甲烷萃取部位浸膏與前所得沉淀合并，經(jīng)硅膠柱色譜(石油醚-丙酮梯度、三氯甲烷-甲醇梯度)洗脫，合并得到5 個組分(Fr.1～Fr.5)。Fr.2(40 g)經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇梯度)洗脫，合并得到2 個組分(Fr.2.1～Fr.2.2)。Fr.2.1(2g)經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇梯度)反復(fù)洗脫、MCI 柱色譜(甲醇-水梯度)洗脫，最后經(jīng)重結(jié)晶，得化合物Ⅱ(63 mg)和Ⅵ(66 mg)；Fr.2.2(3g)經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇梯度)反復(fù)洗脫，再經(jīng)重結(jié)晶，得到化合物Ⅰ(220 mg)。Fr.4(20 g)經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇梯度)洗脫，合并得到3 個組分(Fr.4.1～Fr.4.3)。Fr.4.3(1g)經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇梯度)反復(fù)洗脫、反相C18柱色譜(甲醇-水梯度)洗脫，最后經(jīng)重結(jié)晶，得到化合物Ⅲ(10 mg)和Ⅴ(77 mg)。三氯甲烷萃取剩余水層經(jīng)MCI 柱色譜(甲醇-水梯度)、硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇梯度)、Sephadex LH - 20 柱色譜(甲醇-水梯度)洗脫，最后經(jīng)重結(jié)晶，得到化合物Ⅳ(45 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ：白色粉末(甲醇)，UVλmax nm (MeOH):198，246。ESI-MS m/z：599 [M+Na]+，分子式為C35H60O6。1H-NMR (DMSO) δ:5.32(1H,s,H-6)，4.90(1H,d,J=8.0 Hz,H-1)，4.42(1H,t,H-3)，0.93(3H,s,H-19)，0.65(3H,s,H-18);13C-NMR (DMSO) δ:140.9(C-5)，121.7(C-6)，101.3(C-1′)，77.4(C-5′)，77.4(C-3)，77.2(C-3′)，73.9(C-2′)，70.6(C-4′)，61.6(C-6′)，56.6(C-14)，55.9(C-17)，50.1(C-9)，45.6(C-24)，42．3(C-13)，40.6(C-4)，39.4(C-16)，37.3(C-1)，36.7(C-10)，36.7(C-20)，33.8(C-22)，31.9(C-7)，31.8(C-8)，29.7(C-2)，29.2(C-12)，28.3(C-25)，25.9(C-28)，24.3(C-15)，23.1(C-23)，21.1(C-26)，20.2(C-27)，19.6(C-11)，19.4(C-21)，19.1(C-19)，12.2(C-29)，12.2(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]報道的胡蘿卜苷數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為胡蘿卜苷。

化合物Ⅱ：白色針晶(甲醇)，UVλmax nm (MeOH):246。 EI-MS m/z：455 [M-H]-，分子式為C30H48O3。1H-NMR (C5D5N) δ:4.95, 4.76(each 1H, m, CH2-29 ), 3.45(1H, m, H-3 ), 1.77, 1.21, 1.07, 1.06, 1.01, 0.83(each 3H,s,CH3×6);13C-NMR (C5D5N) δ:178.6 (C-28), 151.1(C-20), 109.7(C-29), 77.9 (C-3), 56.4 (C-17), 55.7(C-5), 50.7(C-9), 49.5(C-19), 47.5(C-18), 42.6(C-14), 40.9(C-8), 39.3(C-4), 39.0(C-1), 38.4(C-13), 37.3(C-10), 37.3(C-22), 34.6(C-7), 32.6(C-16), 31.0(C-15), 30.0(C-21), 28.4(C-23), 28.1(C-2), 25.9(C-12), 21.0(C-11), 19.2(C-30), 18.5(C-6), 16.1(C-24), 16.2(C-25), 16.2(C-26), 14.7(C-27)，以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道的白樺脂酸數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為白樺脂酸。

化合物Ⅲ：柱狀晶片(甲醇)，UVλmax nm (MeOH):246，364。EI-MS m/z：491 [M-H]-，分子式為C22H20O13。1H-NMR (DMSO) δ:7.78(1H, s,H-5′), 7.49(1H, s,H-5), 5.12(1H, d,J=9.0 Hz,H-1″), 4.04(3H, s,OCH3-3′), 4.00(3H, s,OCH3-3);13C-NMR (DMSO) δ:158.3(C-7 and 7′), 152.8(C-4′), 151.5(C-4), 141.8(C-3′), 141.6(C-3), 140.9(C-2′), 140.2(C-2), 114.1(C-1), 112.7(C-6), 111.9(C-5), 111.8(C-5′), 111.6(C-6′), 111.1(C-1′), 101.4(C-1″), 77.2(C-5″), 76.5(C-3″), 73.3(C-2″), 69.5(C-4″), 60.5(C-6″), 61.6(3-OCH3), 60.9(3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道的3,3′-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為3,3′-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物Ⅳ：白色粉末(甲醇)，UVλmax nm (MeOH):246, 364。ESI-MS m/z:529 [M+Na]+，分子式為C23H22O13。1H-NMR (C5D5N) δ:8.47(1H, s, H-5′), 7.82(1H, s, H-5), 5.93(1H, d,J=7.8 Hz, H-1″), 4.25, 4.15(6H, s, 3,3′-2 × OCH3), 3.87(3H, s, 4′-OCH3);13C-NMR (C5D5N) δ:158.8(C-7), 158.6(C-7′), 154.8(C-4′), 152.8(C-4), 142.6(C-3), 141.8(C-2), 141.8(C-2′,3′), 113.9(C-1), 113.3(C-6), 113.1(C-1′), 113.1(C-5), 112.6(C-6′), 108.0(C-5′), 102.7(C-1″), 78.9(C-2″), 78.31(C-3″), 74.6(C-4″), 70.86(C-5″), 62.10(C-6″)，61.7(3-OCH3), 61.3(3′-OCH3), 56.4(4′-OCH3)，以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道的3,3′,4′-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為3,3′,4′-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物Ⅴ：淺黃色晶體(甲醇)，UVλmax nm (MeOH):274。分子式為C8H8O5。1H-NMR (MeOD) δ:7.06(2H,s), 3.83(3H, s);13C-NMR (MeOD) δ:169.1(C-7), 146.4(C-3,5), 139.8(C-4), 121.4(C-1), 110.1(C-2,6)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道的沒食子酸甲酯數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為沒食子酸甲酯。

化合物Ⅵ：針狀晶體(甲醇)，通過在TLC上用3種溶劑系統(tǒng)展開對比，與沒食子酸對照品斑點顏色及Rf值均一致，故鑒定為沒食子酸。

4 討論

研究從羊開口的乙醇提取物中分離鑒定了6個化合物，包括1個甾體類化合物，1個三萜類化合物，2個鞣酸類化合物，2個酚酸類化合物，進一步證實了可水解鞣酸類成分為本屬植物的特征性成分之一[10]。

文獻[11]報道，胡蘿卜苷具有良好的抗腫瘤、抗氧化以及保護神經(jīng)等藥理作用。白樺脂酸具有一定的抗腫瘤、抗病毒、抗氧化應(yīng)激、抗炎等藥理活性，尤其是在抗腫瘤、抗HIV、抗黑色素瘤方面，展現(xiàn)出良好的開發(fā)前景。白樺脂酸通過抑制COX-2介導(dǎo)的NF-κB和ERK1/2通路抑制丙肝病毒復(fù)制，可作為一種治療HCV感染患者潛在的藥物開發(fā)先導(dǎo)化合物[12]。鞣花酸苷類物質(zhì)3,3′-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在1～500 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對人胃癌MGC細(xì)胞、人肝癌HepG-2細(xì)胞、人盲腸癌Hce-8693細(xì)胞增殖均有一定的抑制作用，隨著劑量的增大和作用時間的延長，呈較好的劑量-時間-效應(yīng)關(guān)系[13]。沒食子酸甲酯具有一定的抗氧化活性，其IC50值為8.99 μmol·L-1[14]。沒食子酸甲酯還可以通過抑制Akt和ERK1/2磷酸化，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和遷移，顯示出一定的抗腫瘤作用[15]。沒食子酸具有一定的生物活性，包括抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎作用等。沒食子酸可以抑制促細(xì)胞炎性因子腫瘤壞死因子、白介素-6和白介素-1的分泌，間接抑制革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的脂多糖誘發(fā)炎性反應(yīng)[16]。

根據(jù)研究分離得到的化學(xué)成分及相關(guān)活性報道，初步證實了羊開口具有一定的抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗炎的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，同時也初步證實了羊開口的收斂、止血、解毒的中醫(yī)功效以及泄痢、崩漏帶下、內(nèi)外傷出血的臨床應(yīng)用具有一定的合理性，為完善羊開口的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及進一步的研究開發(fā)提供了理論依據(jù)。關(guān)于該植物更多的化學(xué)成分和深入的藥理作用機制仍有待更進一步的研究。