民族藥用植物鬼吹簫地上部分化學(xué)成分及其鎮(zhèn)痛活性研究

胡 滿 王 迪 肖朝江 姜 北*

1.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)，云南 大理 671000；2.大理大學(xué)藥物研究所/大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000

鬼吹簫(LeycesteriaformosaWall.)為忍冬科鬼吹簫屬植物，該屬植物種類較少，全世界僅有8種，我國(guó)有6種，主要分布于西南部的溫帶和亞熱帶山區(qū)[1]；云南有4種，是該屬植物的主要分布地區(qū)，除滇南外，幾乎遍布于全省各地[2]。鬼吹簫又名風(fēng)吹簫、火炮筒、鬼炮仗、空心木等，在云南分布廣泛，生于海拔1400～3300 m的大部分地區(qū)，資源豐富，為多種民族常用藥用植物，白族稱作“需改”“厚雙柱”[3]，彝族稱作“乃替沒”，具有破血調(diào)經(jīng)、祛風(fēng)除濕、化痰平喘、利水消腫的功效[3]，主要用于治療膀胱炎、水腫、支氣管哮喘、食積、腹脹、風(fēng)濕痛、痔瘡等，外用可治療骨折，葉可作涼藥[2-3]。在筆者前期開展的滇西地區(qū)特色植物鎮(zhèn)痛活性篩查實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)鬼吹簫提取物具有顯著的鎮(zhèn)痛活性，文獻(xiàn)檢索[4-5]結(jié)果顯示該植物僅見化學(xué)成分與抗腫瘤活性研究報(bào)道，未見有鎮(zhèn)痛活性及其相關(guān)活性成分研究。為進(jìn)一步了解鬼吹簫提取物化學(xué)組成及鎮(zhèn)痛活性成分，近來筆者對(duì)采自云南大理的鬼吹簫地上部分進(jìn)行了初步的化學(xué)成分與單體成分鎮(zhèn)痛活性研究。結(jié)果從鬼吹簫地上部分乙醇提取物乙酸乙酯部位與正丁醇部位中共分離得到7個(gè)單體化合物，分別鑒定為木犀草素(1)、木犀草素-5-O-β-D-葡萄糖苷(2)、松柏醛(3)、烏索酸(4)、乙酰熊果酸(5)、β-谷甾醇(6)、胡蘿卜苷(7)，其中部分化合物顯示出一定的鎮(zhèn)痛活性。化合物結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 化合物1～7的結(jié)構(gòu)圖

1 材料與儀器

1.1 儀器與試劑 Bruker Avance III-400核磁共振波譜儀(德國(guó)布魯克公司)，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；柱層析硅膠、薄層層析GF254硅膠板(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(瑞典Amersham Biosciences公司)；反相硅膠RP-18(日本Fuji公司)；D-101型大孔吸附樹脂(天津波鴻樹脂科技有限公司)；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等有機(jī)試劑均為工業(yè)級(jí)溶劑，重蒸后使用。

1.2 植物樣品 植物樣品于2016年3月采自云南大理市南郊，由大理大學(xué)張德全博士鑒定為忍冬科鬼吹簫屬植物鬼吹簫(LeycesteriaformosaWall.)。植物標(biāo)本(編號(hào)：20140504-3)保存于云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半(湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)。動(dòng)物飼養(yǎng)于IVC中，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境：溫度(20±1)℃，相對(duì)濕度(60±5)%，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。

2 提取與分離

鬼吹簫植物地上部分(3.4 kg)粉碎后按1∶8(w：V)加入95%乙醇，回流提取3次，每次90 min，合并濾液減壓濃縮后懸浮于適量蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇1∶1(V∶V)進(jìn)行萃取，回收溶劑后得到鬼吹簫不同極性部位浸膏，其中乙酸乙酯部位35.4 g，正丁醇部位220.0 g。

取乙酸乙酯部位浸膏30.0 g進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿/甲醇體系進(jìn)行梯度洗脫(1∶0～0∶1)，合并相同餾分后得到14個(gè)組分(A～N)。C組分通過硅膠柱層析(氯仿/丙酮50∶1)、Sephadex LH-20(氯仿/甲醇1∶1)純化得到化合物3(9 mg)和化合物6(15 mg)；J組分經(jīng)硅膠柱層析(氯仿/甲醇40∶1)得到化合物4(2.3 g)；G組分先用硅膠柱層析(氯仿/甲醇100∶1)，之后經(jīng)Sephadex LH-20柱層析(氯仿/甲醇1∶1)得到化合物5(8 mg)；L組分經(jīng)過RP-18和Sephadex LH-20(氯仿/甲醇1∶1)柱層析，再結(jié)合重結(jié)晶方法得到化合物1(15 mg)和化合物7(16 mg)。

取正丁醇部位浸膏100.0 g以適量蒸餾水溶解后用D-101型大孔吸附樹脂進(jìn)行柱層析，以水/甲醇(1∶0-0∶1)進(jìn)行梯度洗脫，合并相同餾分得到5個(gè)組分I-VI，III餾分進(jìn)行RP-18反相柱層析(水/甲醇1∶1)，得化合物2(20 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：C15H10O6，黃色粉末。1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)δ:7.36-7.38 (2H, overlap, H-2′,6′), 6.89 (1H, d,J=9.0 Hz, H-5′), 6.52 (1H, s, H-3), 6.42 (1H, d,J=2.0 Hz, H-8), 6.19 (1H, d,J=2.0 Hz, H-6)；13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ:165.9 (C-2), 104.9 (C-3), 183.5 (C-4), 162.9 (C-5), 99.8 (C-6), 166.0 (C-7), 94.7 (C-8), 159.1 (C-9), 104.9 (C-10), 120.0 (C-1′), 113.8 (C-2′), 146.7 (C-3′), 150.7 (C-4′), 116.5 (C-5′), 123.3 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的基本一致，故化合物1被確定為木犀草素。

化合物2：C21H20O11，黃色粉末。1H-NMR (C5D5N, 400 MHz)δ:7.91 (1H, d,J=1.9 Hz, H-2′), 7.53 (1H, dd,J=8.4, 1.9 Hz, H-6′), 7.50 (1H, d,J=2.0 Hz, H-6), 7.31 (1H, d,J=8.4 Hz, H-5′), 6.99 (1H, d,J=2.0 Hz, H-8), 6.91 (1H, s, H-3), 5.40 (1H, d,J=7.5 Hz, H-1″), 4.46-4.37 (5H, overlap, H-2″,3″,4″,6″), 4.05 (1H, m, H-5″)；13C-NMR (C5D5N, 100 MHz)δ:162.5 (C-2), 106.9 (C-3), 178.3 (C-4), 160.2 (C-5), 105.5 (C-6), 164.3 (C-7), 99.5 (C-8), 159.6 (C-9), 109.6 (C-10), 122.9 (C-1′), 114.4 (C-2′), 147.7 (C-3′), 151.3 (C-4′), 116.8 (C-5′), 119.2 (C-6′), 106.7, (C-1″), 75.4 (C-2″), 77.5 (C-3″), 71.1 (C-4″), 79.3 (C-5″), 62.3 (C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的基本一致，故化合物2被確定為木犀草素-5-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物3：C10H10O3，淡黃色粉末。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δ:9.65 (1H, d,J=7.8 Hz, H-9), 7.40 (1H, d,J=15.8 Hz, H-7), 7.12 (1H, dd,J=8.2, 1.8 Hz, H-6), 7.06 (1H, d,J=1.8 Hz, H-2), 6.96 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5), 6.60 (1H, dd,J=15.8, 7.8 Hz, H-8), 3.96 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δ:126.8 (C-1), 109.5 (C-2), 147.0 (C-3), 149.0 (C-4), 115.0 (C-5), 124.2 (C-6), 153.2 (C-7), 126.6 (C-8), 193.7 (C-9), 56.1 (3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的基本一致，故化合物3被確定為松柏醛。

化合物4：C30H48O3，白色針狀結(jié)晶(氯仿/甲醇)。在TLC上多種溶劑系統(tǒng)(石油醚/乙酸乙酯、氯仿/丙酮、環(huán)己烷/異丙醇)分別展開時(shí)，化合物2與烏索酸對(duì)照品Rf值及斑點(diǎn)顏色均一致，故化合物4被確定為烏索酸。

化合物5：C32H50O4，白色粉末。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δ:5.24 (1H, brs, H-12), 4.49 (1H, m, H-3), 2.18 (1H, d,J=11.2 Hz, H-18), 2.04 (3H, s,-OAc), 1.07, 0.95, 0.94, 0.87, 0.86, 0.85, 0.77 (各3H，7×CH3)；13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δ:38.3 (C-1), 23.6 (C-2), 81.0 (C-3), 37.7 (C-4), 55.3 (C-5), 18.2 (C-6), 32.8 (C-7), 39.5 (C-8), 47.5 (C-9), 36.9 (C-10), 23.3 (C-11), 125.7 (C-12), 138.0 (C-13), 42.0 (C-14), 28.1 (C-15), 24.1 (C-16), 48.0 (C-17), 52.6 (C-18), 39.0 (C-19), 38.8 (C-20), 30.6 (C-21), 36.7 (C-22), 28.1 (C-23), 16.7 (C-24), 15.5 (C-25), 17.0 (C-26), 23.6 (C-27), 182.8 (C-28), 17.1 (C-29), 21.3 (C-30), 171.1 (-C=O), 21.2 (-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的基本一致，故化合物5被確定為乙酰熊果酸。

化合物6：C29H50O，白色晶體(丙酮)。在TLC上多種溶劑系統(tǒng)(石油醚/乙酸乙酯、氯仿/甲醇、環(huán)己烷/異丙醇)分別展開時(shí)，化合物3與β-谷甾醇對(duì)照品Rf值及斑點(diǎn)顏色均一致，故化合物6被確定為β-谷甾醇。

化合物7：C35H60O6，白色粉末。1H-NMR (C5D5N, 400 MHz)δ:5.37 (1H, brs, H-6), 4.59 (1H, d,J=10.6 Hz, H-1′), 0.91 (3H, s, CH3), 0.89 (3H, t,J=7.1 Hz, H-21), 0.86 (3H, s, CH3), 0.67 (3H, s, H-18), 3.98-4.46 (7H, overlap, H-3,2′,3′,4′,5′,6′)；13C-NMR (C5D5N, 100 MHz)δ:37.3 (C-1), 30.1 (C-2), 77.9 (C-3), 39.1 (C-4), 140.7 (C-5), 121.7 (C-6), 32.0 (C-7), 31.8 (C-8), 50.1 (C-9), 36.2 (C-10), 21.1 (C-11), 39.7 (C-12), 42.3 (C-13), 55.6 (C-14), 24.3 (C-15), 28.3 (C-16), 56.0 (C-17), 12.0 (C-18), 19.0 (C-19), 36.7 (C-20), 18.8 (C-21), 34.0 (C-22), 26.2 (C-23), 45.8 (C-24), 29.3 (C-25), 19.2 (C-26), 19.8 (C-27), 23.2 (C-28), 11.8 (C-29), 102.4 (C-1′), 75.1 (C-2′), 78.4 (C-3′), 71.5 (C-4′), 77.9 (C-5′), 62.6 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的基本一致。同時(shí)在TLC上以氯仿/甲醇、環(huán)己烷/異丙醇分別展開時(shí)，化合物6與胡蘿卜苷對(duì)照品Rf值及斑點(diǎn)顏色均一致，故化合物7被確定為胡蘿卜苷。

4 鎮(zhèn)痛活性測(cè)試

取昆明種小鼠36只，雌雄各半，隨機(jī)分為6組，每組6只。其中溶媒對(duì)照組灌胃給予含0.5% CMC-Na的生理鹽水、陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予吲哚美辛(20 mg/kg)，吲哚美辛和待測(cè)化合物均以含0.5% CMC-Na的生理鹽水混懸。給藥60 min后，各組小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸溶液，劑量為0.1 mL/10 g。隨后記錄小鼠在給藥后15 min內(nèi)的扭體次數(shù)，鎮(zhèn)痛率(%)=(溶媒對(duì)照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/溶媒對(duì)照組扭體次數(shù)×100%。

根據(jù)所分離得到的化合物的重量，對(duì)化合物1、4、6、7進(jìn)行了鎮(zhèn)痛活性測(cè)試?；钚栽囼?yàn)結(jié)果(表1)顯示，化合物1、4、6可明顯抑制醋酸誘發(fā)的小鼠扭體次數(shù)，表明化合物1、4、6具有一定的鎮(zhèn)痛活性。

表1 鬼吹簫中部分化合物鎮(zhèn)痛活性結(jié)果

5 討論

本實(shí)驗(yàn)從鬼吹簫地上部分分離得到了7個(gè)化合物，其中化合物木犀草素、木犀草素-5-O-β-D-葡萄糖苷、烏索酸、乙酰熊果酸、胡蘿卜苷是首次從該植物中分離得到。與之前有關(guān)該植物研究中主要分離得到三萜類與環(huán)烯醚萜類成分不同[5]，本研究得到幾個(gè)酚性成分(木犀草素、木犀草素-5-O-β-D-葡萄糖苷、松柏醛)，考慮到植物樣品采集地點(diǎn)與時(shí)間存在較大的差異，上述成分是否與這些差異有關(guān)需要進(jìn)一步研究。小鼠體內(nèi)鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物木犀草素、烏索酸、β-谷甾醇能明顯抑制醋酸誘發(fā)的小鼠扭體次數(shù)。文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，黃酮和三萜類化合物常具有抗炎鎮(zhèn)痛作用[11-13]，木犀草素、烏索酸、β-谷甾醇抗炎鎮(zhèn)痛作用亦有研究報(bào)道[13-15]。綜合上述實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果，說明黃酮和三萜類化合物可能均為鬼吹簫鎮(zhèn)痛效果的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究進(jìn)一步證實(shí)了白族醫(yī)、彝族醫(yī)等將鬼吹簫用于治療關(guān)節(jié)痹痛、跌打損傷、瘀血腫痛等病癥具有合理性。