痛舒膠囊臨床最大耐受劑量實(shí)驗(yàn)中4種成分藥物濃度測定方法建立

趙高瓊 劉紅斌 崔佳麗 梅 晶 周藝佳 王京昆*

1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111

痛舒膠囊是根據(jù)云南彝族經(jīng)驗(yàn)方開發(fā)的民族藥，其主要由七葉蓮、三七、梔子、燈盞細(xì)辛、玉葡萄根、珠子參等八味中藥組方而成，具有活血化瘀，舒筋活絡(luò)，化痞散結(jié)，消腫止痛的功效。臨床常用于治療關(guān)節(jié)炎[1]、肩周炎[2]、頸源性頭痛[3-4]、乳腺增生[5]等。由于制劑中三七具有活血作用，且在制劑中占比最大，含量最高，故選擇三七中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1為指標(biāo)性成分，同時(shí)再選擇具有消腫作用的梔子中的特征性成分梔子苷為指標(biāo)性成分，建立這4種成分在人體內(nèi)藥物濃度測定方法，開展痛舒膠囊在人體內(nèi)的特征性多指標(biāo)成分體內(nèi)藥代研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 美國Agilent-ABI三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫公司)、Allegra 64R高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)(Beckman公司)、SK8200LHC超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)、XW-80渦旋混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)、MD200氮?dú)獯祾邇x(杭州奧盛儀器有限公司)、DV215CD電子天平(OHAUS)。96孔板固相萃取裝置、96孔固相萃取板(Oasis HLB μElution Plate 30 μm)均購買自美國waters公司。

1.2 材料 對(duì)照品梔子苷(簡稱Gen，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110749-201316)、人參皂苷Rg1(簡稱Rg1，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110703-201529)、三七皂苷R1(簡稱R1，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110745-201318)、人參皂苷Rb1(簡稱Rb1，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110704-201424)均購于中國藥品生物制品檢定所。鹽酸普萘洛爾(簡稱Pro，Sigma公司，美國，批號(hào)：BCBJ2807V)。甲醇(Merck公司，美國，色譜純)、甲酸(上海阿拉丁生化科技有限公司，色譜純)。水為超純水(Millipore純水，超純水系統(tǒng)制備)。

1.3 藥品 痛舒膠囊(規(guī)格為 0.3 g/粒，批號(hào)：SMA1501，云南白藥集團(tuán)股份有限公司)。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液配制

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品溶液的配制 精密稱取Gen、Rg1、R1、Rb1對(duì)照品，配制成濃度分別為0.243、0.231、0.253、0.260 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品儲(chǔ)備液，2～8 ℃ 保存，備用。取Gen、Rg1、R1、Rb1標(biāo)準(zhǔn)曲線用對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配制得到濃度分別為81.0、8.57、10.5、3.60 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，并用甲醇逐級(jí)稀釋(每級(jí)稀釋倍數(shù)為2倍，共稀釋5次)得到6級(jí)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

2.1.2 質(zhì)控對(duì)照品溶液的配制 精密稱取Gen、Rg1、R1、Rb1對(duì)照品，配制成濃度分別為0.217、0.194、0.207、0.205 mg/mL 的質(zhì)控用對(duì)照品儲(chǔ)備液，2～8 ℃ 保存，備用。取Gen、Rg1、R1、Rb1質(zhì)控用對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配制得到濃度分別為72.3、7.20、8.40、2.85 μg/mL 的高濃度混合質(zhì)控工作液，并用甲醇逐級(jí)稀釋得到濃度分別為18.1、1.80、2.10、0.712 μg/mL 的中濃度混合質(zhì)控工作液及濃度分別為4.52、0.450、0.525、0.178 μg/mL 的低濃度混合質(zhì)控工作液。

2.1.3 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取Pro對(duì)照品 6.59 mg，置于適量容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度 0.659 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)對(duì)照品儲(chǔ)備液，2～8 ℃ 保存，備用。取適量Pro內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，加入適量甲醇，稀釋得到濃度為 110 ng/mL 的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.2 血漿樣品處理方法 固相萃取板分別以 300 μL 甲醇、300 μL 超純水活化，備用。取不同濃度的混合對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)工作液各 10 μL 于離心管中，氮?dú)獯蹈?。加?100 μL 空白人血漿，渦旋混勻，加入 100 μL 20%的甲酸，漩渦混勻 2 min 后轉(zhuǎn)移至固相萃取板中，分別以 200 μL 超純水淋洗，200 μL 甲醇洗脫，甲醇洗脫液 10 μL 進(jìn)樣。

2.3 LC-MS/MS檢測方法

2.3.1 液相色譜條件 Waters SunFire C18色譜柱(5 μm，150 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：0.01%甲酸水A-甲醇B，梯度洗脫，0～1 min，90% A；1～8 min，90%～10% A；8～10 min，10% A；10～10.5 min，10%～90% A；10.5～15 min，90% A，流速：1 mL/min。柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化(ESI)，正離子模式。多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)定量：Gen，[M+Na]+，m/z：411.10/217.00；Rg1，[M+Na]+，m/z：823.40/203.20；R1，[M+Na]+，m/z：955.60/775.50；Rb1，[M+Na]+，m/z：1131.50 /365.10；Pro，[M+H]+，m/z：260.20/183.10。質(zhì)譜參數(shù)CUR：20.00；IS：5500.00；TEM:500.0 ℃；GS1：50.00；GS2：50.00；CAD：Mediμm；Interface Heater(ihe)：on。

3 結(jié)果

3.1 專屬性 按照“2.2”項(xiàng)下方法處理，分別得到空白離子色譜圖、含標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)的離子色譜圖及未知濃度血漿樣品離子色譜圖。結(jié)果表明，Gen、Rg1、R1、Rb1及Pro提取離子色譜圖與血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)互不干擾。結(jié)果如圖1所示。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍 按照“2.2”項(xiàng)下方法處理，得到不同濃度系列的進(jìn)樣溶液，測定得到待測成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積。以各待測成分的濃度為橫坐標(biāo)，待測成分與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，所有待測成分的線性關(guān)系良好(r>0.95)，定量范圍較寬，定量限低，所有定量下限均滿足S/N≥10。其中，Gen、Rg1、R1、Rb1 3個(gè)批次所測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r)平均值分別為為 0.995 4、0.997 8、0.996 5、0.992 8，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.12%、0.05%、0.48%、0.48%；斜率的平均值分別為4.40×10-2、5.72×10-3、2.06×10-3、13.1×10-3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為17.38%、12.77%、14.43%、4.64%；標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點(diǎn)的準(zhǔn)確度均符合要求；線性范圍分別為252～8 100 ng/mL、26.8～857 ng/mL、32.8～1 050 ng/mL、11.2 ～360 ng/mL。

3.3 殘留率 按照“2.2”項(xiàng)下方法處理，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)的進(jìn)樣溶液及空白血漿溶液，平行處理6份，按“最高濃度點(diǎn)樣品-空白血漿樣品”次序交叉測定所有制備的樣品，各空白血漿中待測成分Gen、Rg1、R1、Rb1及內(nèi)標(biāo)Pro的峰面積與定量下限樣品測定峰面積的比值，其中待測成分殘留率均小于20%，內(nèi)標(biāo)殘留率小于5%，滿足試驗(yàn)要求。

3.4 精密度、準(zhǔn)確度 取定量下限、低、中、高4個(gè)濃度的的加標(biāo)血漿，按照“2.2”項(xiàng)下方法分別處理得到4個(gè)濃度的進(jìn)樣溶液，每個(gè)濃度處理3批次，每批次每個(gè)濃度平行處理6份，計(jì)算日內(nèi)精密度、日間精密度及準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，痛舒膠囊中4種入血成分的日內(nèi)精密度、日間精密度RSD≤15%，定量下限準(zhǔn)確度均在80%～120%之間，質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度均在85%～115%之間，符合試驗(yàn)要求。見表1。

表1 4種成分精密度、準(zhǔn)確度考察 (%，n=6)

3.5 回收率 按照“2.2”項(xiàng)下方法平行處理6份低、中、高3個(gè)濃度的加標(biāo)血漿，得提取后的進(jìn)樣溶液。再取相同濃度的混標(biāo)溶液，平行6份，得未提取的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣溶液。分別測定12個(gè)進(jìn)樣溶液。計(jì)算提取后進(jìn)樣溶液與未提取進(jìn)樣溶液測定濃度的比值，得到提取回收率。結(jié)果痛舒膠囊中4個(gè)入血成分Gen、Rg1、R1、Rb1不同濃度間的平均回收率分別為91.65%、64.39%、84.72%、86.11%，回收率在61.05%～96.54%之間，各入血成分各濃度間回收率RSD均≤15%，符合試驗(yàn)要求。

3.6 基質(zhì)效應(yīng) 按照“2.2”項(xiàng)下方法，平行6個(gè)不同個(gè)體的人空白血漿，每個(gè)個(gè)體平行處理3份，得到18份空白基質(zhì)樣品。離心管中分別加入低、中、高濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液，氮?dú)獯蹈?，加入空白基質(zhì)復(fù)溶，得到含基質(zhì)的進(jìn)樣溶液，每個(gè)濃度平行處理6份。再取相同濃度的混標(biāo)溶液，平行6份，得不含基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣溶液。計(jì)算歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子。結(jié)果顯示人血漿對(duì)Gen、Rg1、R1、Rb1各濃度間的基質(zhì)影響均較小，且影響程度均基本一致，基質(zhì)效應(yīng)RSD均≤15%，滿足試驗(yàn)要求。

表2 4種成分基質(zhì)效應(yīng) (n=6)

3.7 血漿樣品及進(jìn)樣溶液穩(wěn)定性 按照“2.2”項(xiàng)下方法，處理低、高兩個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行6份，室溫放置 5 d 后進(jìn)樣。制備低、高兩個(gè)濃度的加標(biāo)血漿樣品，分別于室溫放置 6 h、-80 ℃ 放置 164 d、-80 ℃ 放置 164 d 且反復(fù)凍融3次后按照“2.3”項(xiàng)下方法處理進(jìn)樣，每個(gè)濃度平行6份。結(jié)果表明含藥血漿可在室溫穩(wěn)定放置 6 h、-80 ℃ 放置 164 d、可反復(fù)凍融3次，進(jìn)樣溶液可室溫穩(wěn)定放置 5 d，穩(wěn)定性考察條件滿足試驗(yàn)需求。見表3。

表3 血漿樣品及進(jìn)樣溶液穩(wěn)定性 (%，n=6)

綜上，本試驗(yàn)條件下，所建立的HPLC-MS/MS法能用于對(duì)來自于臨床MTD的所有人血漿樣本中梔子苷、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1的檢測，該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高。

4 討論

由于人血漿中基質(zhì)比較復(fù)雜，基質(zhì)可隨目標(biāo)成分共提出或共流出，對(duì)前期摸索階段建立的分析方法造成干擾，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)不同濃度間目標(biāo)成分影響差異較大。為排除基質(zhì)對(duì)分析檢測的影響，首先優(yōu)化含藥血漿樣品處理方法。通過對(duì)不同提取方法的考察后篩選出對(duì)不同濃度間目標(biāo)成分影響較小的固相萃取法為樣品前處理方法。然后又對(duì)固相萃取法洗脫溶劑、溶劑洗脫比例、溶劑洗脫體積等因素進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有基質(zhì)能隨洗脫溶劑甲醇共流出，無法通過樣品前處理方法完全排除基質(zhì)對(duì)分析檢測的干擾。因此，為徹底排除基質(zhì)對(duì)分析檢測的影響，本實(shí)驗(yàn)同步優(yōu)化分析檢測方法，選擇柱長為 150 mm 的色譜柱對(duì)隨目標(biāo)成分共流出的基質(zhì)進(jìn)行分離，通過調(diào)整流動(dòng)相比例、流動(dòng)相梯度、流動(dòng)相種類等方式實(shí)現(xiàn)對(duì)基質(zhì)的分離，從而保證基質(zhì)效應(yīng)對(duì)樣品分析檢測影響的一致性。

在試驗(yàn)過程中，血漿樣品及進(jìn)樣溶液穩(wěn)定性僅對(duì)低濃度及高濃度質(zhì)控進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證濃度能覆蓋痛舒膠囊臨床MTD血漿樣本中的濃度。根據(jù)樣品存放條件及時(shí)間，設(shè)置血漿樣品長期穩(wěn)定性考察，考察周期為 164 d，考察周期可覆蓋血漿樣品的存放周期。

本次實(shí)驗(yàn)所選擇的檢測目標(biāo)物，均為原型化合物，由于中藥復(fù)方的復(fù)雜性，這一階段并未對(duì)其可能的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測，這些化合物有可能在進(jìn)入人體后發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致原型化合物難以被跟蹤到[6-8]，后續(xù)試驗(yàn)將提高儀器靈敏度，或?qū)υ突衔锛按x產(chǎn)物進(jìn)行研究分析，以揭示痛舒膠囊的體內(nèi)吸收過程。