響應(yīng)面法優(yōu)化紅豆酶解工藝的研究

余 飛

南昌泰康食品科技有限公司 (南昌 330100)

紅豆呈圓柱狀，種皮為暗棕紅色，微有光澤，中間凹陷成一縱溝，偏向一端，顆粒物明顯棱脊，較為光滑。紅豆的質(zhì)地偏軟，對(duì)半切開(kāi)，兩瓣乳白色的仁亦能清晰可見(jiàn)。紅豆的功效與作用：降脂減肥，它含有大量的天然皂角苷，人體吸入后能加快人體內(nèi)過(guò)氧化脂質(zhì)代謝，并抑制人體對(duì)脂肪的吸收，能起到降脂減肥的重要作用；預(yù)防癌癥，紅小豆中含有的皂苷和植物蛋白以及維生素E等營(yíng)養(yǎng)成分都是天然的抗癌物質(zhì)，他們不單能阻止人體細(xì)胞癌變，還能抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)散，它對(duì)現(xiàn)在人類高發(fā)的胃癌和腸癌都有明顯預(yù)防作用；通乳生乳，它能補(bǔ)益氣血，也能促進(jìn)乳汁分泌，還能加快女性產(chǎn)后身體恢復(fù)；預(yù)防高血壓和高血脂，其含有的微量元素和維生素被人體吸收以后，能直接作用于人類的心血管，它既能增加毛細(xì)血管通透性，又能提高血管壁的韌性和彈性，能促進(jìn)血液循環(huán)，穩(wěn)定血壓和血脂，并能降低血栓和動(dòng)脈硬化以及冠心病的發(fā)病率[1-3]。

紅豆含有21%的蛋白質(zhì)，以及64%的碳水化合物，主要為淀粉，在制作紅豆飲料過(guò)程中，紅豆中淀粉糊化，淀粉在冷水中使水膨脹，遇熱后水分子從淀粉粒內(nèi)部，使淀粉粒繼續(xù)膨脹，其體積可增大至幾倍至幾十倍，最后破裂變?yōu)檎吵淼哪z體溶液，此現(xiàn)象稱為糊化。紅豆糊化后，狀態(tài)均勻，口感細(xì)膩光滑。但是，隨著飲料儲(chǔ)存時(shí)間的加長(zhǎng)，糊化后的淀粉已經(jīng)展開(kāi)的散亂的膠束分子會(huì)收縮靠攏，于是淀粉制品由軟變硬，返生老化。淀粉老化后，淀粉與水失去親和力，難以復(fù)水，食品會(huì)失去口感，飲料會(huì)慢慢形成凝膠狀，像豆腐塊一樣，同時(shí)口感變得粗疏[4-5]。

生物酶解技術(shù)，就是利用生物酶催化的酶促反應(yīng)所具有高度專一性的特點(diǎn)，選擇相應(yīng)的酶(通常是水解酶)，將聚合物形式的生物大分子分解為其組成成分單體的技術(shù)。生物酶解技術(shù)具有反應(yīng)單一、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)效率高、不存在或極少存在逆反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。在飲料制備工藝中，我們最常用的酶制劑主要是α-淀粉酶、β-淀粉酶。淀粉被淀粉酶水解后的產(chǎn)物是麥芽糖、葡萄糖。其中a淀粉酶作用的結(jié)果，可以將長(zhǎng)的糖鏈切割成短鏈，即形成相對(duì)分子質(zhì)量較小的糊精。β-淀粉酶作用的結(jié)果是切下兩個(gè)葡萄糖單位，即麥芽糖，a-1，6糖苷酶作用結(jié)果就是切下側(cè)鏈，形成直鏈糖。淀粉水解后，形成的麥芽糖、葡萄糖等小分子化合物，能快速的被人體所吸收，同時(shí)也降低了產(chǎn)品分層、析水、淀粉老化現(xiàn)象。

本試驗(yàn)采用α-淀粉酶酶解紅豆原料，并應(yīng)用響應(yīng)面分析法(RSM)[6]來(lái)優(yōu)化酶解工藝，以最終產(chǎn)品DE值為基準(zhǔn)，最后通過(guò)噴霧干燥技術(shù)制備得到紅豆粉。

1 材料和方法

1.1 材料及設(shè)備

1.1.1材料與試劑

紅小豆，安徽燕之坊食品有限公司；α-中溫淀粉酶，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；3,5-二硝基水楊酸，分析純，啟東市名成化工有限公司；氫氧化鈉，分析純，廣州豪霸化工科技有限公司；丙三醇，分析純，鄭州福佑德化工產(chǎn)品有限公司；葡萄糖，分析純，大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要儀器

恒溫水浴鍋，江蘇金壇市中大儀器廠；60-6S型均質(zhì)機(jī)，上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；JM30型膠體磨，溫州市鹿城精益膠體磨廠；LPG-5型噴霧干燥器，常州品正干燥設(shè)備有限公司；721型分光光度計(jì)，山東高密彩虹分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1紅豆酶解工藝流程

紅豆→蒸煮→膠磨→酶解→過(guò)篩→均質(zhì)→滅酶→噴霧干燥→包裝→質(zhì)檢→成品

(1)原料的選擇

選擇的紅小豆顆粒都飽滿，色澤紅潤(rùn)。

(2)膠磨

紅小豆粒清洗干凈后，加水煮沸至開(kāi)裂，然后加入小蘇打，加蓋悶30 min，最后打漿后過(guò)二遍膠體磨。

(3) 酶解

膠磨后的紅豆?jié)鉂{溫度下降到60 ℃后，加入a-中溫淀粉酶(底物干基的百分比)，攪拌均勻，恒溫保持60～100 min。

(4)均質(zhì)

紅豆酶解后，35 MPa均質(zhì)，均質(zhì)后料液呈稀湖狀，具有流動(dòng)性為佳，然后再煮沸滅酶10 min，殺滅紅豆料液中的酶活性。

(5)噴霧干燥

以進(jìn)風(fēng)溫度160 ℃，出風(fēng)溫度75 ℃，進(jìn)行噴霧干燥，粉末過(guò)100目，制得成品。

(6)檢驗(yàn)

對(duì)成品的理化指標(biāo)(蛋白質(zhì))和衛(wèi)生指標(biāo)(細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群數(shù))進(jìn)行檢測(cè)，兩者均合格后方能入庫(kù)。

1.2.2測(cè)定方法

采用DNS法測(cè)定DE值[7-8]。

還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3影響紅豆酶解工藝的單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 不同酶添加量對(duì)紅豆酶解工藝的影響

在紅豆含量12%、酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間80 min、小蘇打添加量0.05%(底物干基的百分比)條件下，酶添加量(底物干基的百分比)分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，以DE值為指標(biāo)，研究不同酶添加量對(duì)紅豆酶解工藝的影響。

1.2.3.2 不同酶解時(shí)間對(duì)紅豆酶解工藝的影響

在紅豆含量12%，酶解溫度60 ℃，酶添加量0.3%(底物干基的百分比)，小蘇打添加量0.05%(底物干基的百分比)條件下，酶解時(shí)間分別為20 min、40 min、60 min、100 min、120 min，以DE值為指標(biāo)，研究不同酶解時(shí)間對(duì)紅豆酶解工藝的影響。

1.2.3.3 不同小蘇打添加量對(duì)紅豆酶解工藝的影響

在紅豆含量12%，酶解溫度60 ℃，酶添加量0.3%(底物干基的百分比)，酶解時(shí)間80 min條件下，小蘇打添加量(底物干基的百分比)分別為0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%，以DE值為指標(biāo)，研究不同小蘇打添加量對(duì)紅豆酶解工藝的影響。。

1.2.4響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box -Benhnken 模型的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理選取酶添加量、酶解時(shí)間、小蘇打添加量為自變量, 以料液DE值為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1不同酶添加量對(duì)紅豆酶解工藝的影響

由圖2可知，加入中溫淀粉酶為0.1%的時(shí)候，紅豆淀粉含量較高，使得酶制劑能快速與淀粉相結(jié)合，產(chǎn)生酶解反應(yīng)，但由于酶制劑添加量不多，同時(shí)底物淀粉含量偏多，兩者之間的量比不同，所以反應(yīng)程度很有限，DE值偏低。當(dāng)酶制劑添加到0.3%的時(shí)候，紅豆中淀粉全部被酶解，產(chǎn)生大量的麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等。后期即使酶添加量達(dá)到0.4%～0.5%，由于其反應(yīng)底物不夠，因此酶解的程度不會(huì)發(fā)生太大的變化?？紤]到酶制劑成本，添加0.3%的淀粉酶，酶解工藝最合理。

2.1.2不同酶解時(shí)間對(duì)紅豆酶解工藝的影響

由圖3可知，反應(yīng)時(shí)間在20 min時(shí)，由于紅豆中淀粉與酶制劑接觸反應(yīng)的時(shí)間不夠，只有部分淀粉被分解成麥芽糖、葡萄糖等，因此DE值整體偏低。當(dāng)?shù)矸叟c酶制劑充分反應(yīng)的時(shí)候，即反應(yīng)時(shí)間80 min的情況下，不管是直接淀粉或者支鏈淀粉被水解的程度都比較徹底。隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的加長(zhǎng)，由于反應(yīng)底物基本上都已經(jīng)被酶解，繼續(xù)酶解不會(huì)產(chǎn)生多余的還原糖，因此DE值變化幅度不是很大?？紤]到工藝成本，反應(yīng)時(shí)間80 min最為合理。

圖2 不同酶添加量對(duì)DE值的影響

圖3 不同酶解時(shí)間對(duì)DE值的影響

2.1.3不同小蘇打添加量對(duì)紅豆酶解工藝的影響

由圖4可知，在紅豆蒸煮過(guò)程中，加入小蘇打，一方面可以保護(hù)紅豆中的蛋白，另一方面，有助于紅豆中淀粉能釋放出來(lái)，方便于后期的酶解反應(yīng)。當(dāng)小蘇打添加量為0.05%的時(shí)候，淀粉被釋放的差不多，此時(shí)的程度最有利于酶解反應(yīng)。如果繼續(xù)添加小蘇打，一方面會(huì)加大物料的成本投入，另外會(huì)影響到最終產(chǎn)品的酸堿度，進(jìn)而會(huì)產(chǎn)生不愉悅的口感。

圖4 小蘇打添加量對(duì)DE值的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box -Benhnken 模型的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理選取酶添加量、酶解時(shí)間、小蘇打添加量為自變量, 分別以X1、X2、X3來(lái)表示, 并以+1、0、- 1 分別代表自變量的高、中、低水平。按方程xi=(Xi-X0)/ΔX對(duì)自變量進(jìn)行編碼，料液DE值為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面法分析因素及水平

表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)號(hào)X1 X2X3DE值/%610-133.57-10132.6810135.590-1-136.81001-136.5110-1137.91201137.61300045.21400043.51500041.81600041.51700043.9

應(yīng)用Design Expert 軟件，對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合， 選擇對(duì)響應(yīng)值顯著的各項(xiàng), 可得酶添加量(X1)、酶解時(shí)間(X2) 和小蘇打添加量(X3)與DE值(R1)之間的二次多項(xiàng)回歸方程:

R1=43.18-0.9X1-0.89X2-0.66X3+2.88X1X3-3.19X12-1.92X22-4.06X32

方差分析如表3所示，由此可以看出紅豆酶解工藝實(shí)驗(yàn)所選用模型合理，而且擬合優(yōu)度好，通過(guò)了顯著性檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)R=0.999 6,僅有約1%的變異不能由該模型解釋。

表3 回歸模型的方差分析

由表4可以看出，本試驗(yàn)所建立的模型中，X1對(duì)DE值的影響顯著；X12、X32極為顯著。

表4 回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)

2.3 紅豆酶解工藝的響應(yīng)面分析

由回歸方程所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖如圖5～圖7所示。影響DE值最顯著因素是酶添加量(X1)，表現(xiàn)為等高曲線陡峭；影響較小的是小蘇打添加量(X3), 表現(xiàn)為等高曲線較為平滑。

由圖5～圖7可以看出, DE值隨酶添加量的上升而增加, 到達(dá)一定比例時(shí)，DE值幾乎不變。通過(guò)響應(yīng)面和等高線圖可以看出，任何兩個(gè)因素之間的協(xié)同性對(duì)DE值得影響。對(duì)模型方程求導(dǎo)數(shù)，并令其等于零，可以得到相應(yīng)曲面的最大點(diǎn)，即3個(gè)主要因素的最佳取值，分別為:X1=0.04、X2=0.152、X3=-0.068, 轉(zhuǎn)換后得到DE值的最佳條件為: 酶添加量0.304%，酶解時(shí)間83 min，小蘇打添加量0.051%。

圖5 酶添加量與酶解時(shí)間的響應(yīng)面和等高線圖

圖6 酶添加量與小蘇打添加量的響應(yīng)面和等高線圖

圖7 酶解時(shí)間與小蘇打添加量的響應(yīng)面和等高線圖

2.4 最佳條件的論證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證最優(yōu)紅豆酶解工藝條件，取響應(yīng)面中得分較高的實(shí)驗(yàn)與最優(yōu)條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，以最終產(chǎn)品DE值數(shù)為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，得到表5所示。

表5 最優(yōu)條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

從表5可知，試驗(yàn)1、試驗(yàn)2和試驗(yàn)4的DE值最高。根據(jù)成本考慮，選擇紅豆酶解工藝的最佳條件為：酶添加量為0.3%，酶解時(shí)間80 min，小蘇打添加量0.05%。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的紅豆酶解工藝最優(yōu)條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)中以DE值為酶解程度指標(biāo),對(duì)紅豆酶解的條件進(jìn)行了初步研究, 結(jié)果表明:酶添加量對(duì)DE值有顯著影響, 而小蘇打添加量對(duì)其影響較小。將響應(yīng)面分析法應(yīng)用于紅豆酶解工藝工藝中, 通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較, 確定了最佳固定化條件為: 酶添加量0.3%，酶解時(shí)間80 min，小蘇打添加量0.05%，并在該條件下DE值達(dá)到45.4%。