富含蘋果皮根皮素殼聚糖-聚乙烯醇抗氧化保鮮膜的研制

陶海燕， 趙麗鳳， 陳 剛， 夏 娜， 賈淑平， 李盛彪

(1.喀什大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 新疆 喀什 844000;2.喀什大學(xué)新疆特色藥食用植物資源化學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 喀什 844000; 3.華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院， 武漢 430079；4.喀什地區(qū)纖維檢驗(yàn)所， 新疆 喀什 844099; 5.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院， 新疆 喀什 844000)

人口增長導(dǎo)致塑料包裝的消費(fèi)增加，不可降解材料的處理引起了一系列的環(huán)境問題.目前，人類已開始選擇使用環(huán)保的可再生包裝材料[1].生物基活性包裝材料由于安全可降解日益受到人們的青睞，這些材料通常由生物高聚物組成，包括蛋白質(zhì)、多糖、脂類或它們的混合物，它們可以替代塑料等合成聚合物[2].殼聚糖(CS)是由β-(1,4)-糖苷鍵連接的N-乙酰氨基葡萄糖和N-氨基葡萄糖的共聚物，具有良好的生物相容性、生物降解性、黏附性和低毒性，其LD50劑量與糖或食鹽相同[3-4].聚乙稀醇(PVA)是一種無色無毒、可生物降解、無刺激性的多羥基高分子化合物，常溫下，其性質(zhì)穩(wěn)定，具有良好的力學(xué)性能.將CS與PVA混合制膜用于食品包裝領(lǐng)域具有較大的潛力.

近年來，研究人員關(guān)注于將a-生育酚、酚類化合物和精油等天然生物活性化合物摻入包裝材料中，以生產(chǎn)活性保鮮薄膜，在不使用合成防腐劑的情況下提高食品的保質(zhì)期同時(shí)保持食品的安全性和質(zhì)量[5].果皮是生物活性化合物和天然抗氧化劑的豐富來源，被廣泛應(yīng)用于基于生物聚合物的薄膜的制備，以提高其生物功能.蘋果[6]、香蕉[7]、柚子[8]、石榴[9]、木瓜和菠蘿蜜[10]、血橙[11]、土豆[12]果皮被用于提高生物聚合物薄膜的抗氧化和抗菌活性.根皮素(phloretin)作為6 000種黃酮類化合物中的一種，具有抗癌、抗破骨細(xì)胞生成、抗真菌、抗病毒、抗炎和抗菌特性而受到廣泛的關(guān)注[13-14].蘋果皮是根皮素的主要來源，由于其常被當(dāng)廢物丟棄而忽視其利用價(jià)值，因此，根皮素作為極具價(jià)值的副產(chǎn)物可以作為酚類化合物的重要來源，用于豐富殼聚糖復(fù)合保鮮膜，并提高其抗氧化性能.目前尚無將根皮素加入殼聚糖復(fù)合物制備活性和抗氧化膜的研究.本實(shí)驗(yàn)使用CS、PVA和不同濃度的根皮素作為原料生產(chǎn)生物可降解和生物活性的包裝膜，進(jìn)一步研究其作為一種新型活性包裝體系的物理、機(jī)械、結(jié)構(gòu)、抗氧化和抗菌特性.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果皮(紅富士品種，購自超市)，曬干粉碎；聚乙稀醇(PVA)食品級，購自上海麥克林生化科技有限公司；殼聚糖(CS，脫乙酰度98%)，食品級，購自上海麥克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)，分析純；購自國藥集團(tuán)有限公司； 甘油，分析純級，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠.

1.2 儀器與設(shè)備

D/Max-2500型全自動(dòng)X射線衍射儀(日本理學(xué))；Hitachi SU3500型掃描電子顯微鏡(SEM日本日立公司)；Nicoletis50傅立葉紅外光譜儀(美國賽默飛世爾科技公司)；Mitutoyo7327型厚度儀(日本三豐)；CMT-6104萬能拉力機(jī)(深圳新三思測試儀器有限公司)；SDT2960 DTA-TGA熱重分析儀(TG，德國耐磁公司)，TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；FLC-3超凈工作臺(哈爾濱市東聯(lián)公司).

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘋果皮根皮素提取及純化 提取方法參照文獻(xiàn)[15]的方法, 準(zhǔn)確稱取10.00 g的蘋果皮干粉，采用表面活性劑膠束輔助酶法和超聲—微波協(xié)同提取法提取蘋果皮根皮素，將提取液在60 ℃以轉(zhuǎn)速8 000 r·min-1條件下離心10 min、抽濾，濾液脫色處理，大孔樹脂純化后，在40 ℃條件下蒸發(fā)去溶劑，得到固體物質(zhì)，即得純品，含量大于98%.按照不同質(zhì)量濃度要求配制蘋果皮根皮素提取液.

1.3.2 復(fù)合膜的制備 準(zhǔn)確稱取16.00 g的殼聚糖粉末于體積分?jǐn)?shù)1%的醋酸溶液800 mL中，60 ℃條件下用磁力攪拌器攪拌1 h使其完全溶解制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%殼聚糖溶液.同時(shí)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的PVA攪拌均勻形成殼聚糖與PVA共混溶液.隨后在殼聚糖與PVA共混溶液加入0%、1%、2%和3%蘋果皮根皮素乙醇液(相對于殼聚糖干基質(zhì)量分?jǐn)?shù))，再加入2 mL的甘油作為增塑劑，攪拌2 h，待混合液充分混勻，靜置24 h脫泡.然后將混合膜液傾倒在聚四氟乙烯皿內(nèi)，室溫下干燥48 h，將干燥的薄膜從培養(yǎng)皿表面剝離，儲存于裝有飽和硝酸鎂的溶液恒溫恒濕箱中(相對濕度50%，溫度25 ℃).

1.3.3 復(fù)合膜的表征

1) 機(jī)械性質(zhì)的測定

選取平整、光滑待測膜，使用測厚儀隨機(jī)取的4個(gè)頂點(diǎn)和一個(gè)中心點(diǎn)進(jìn)行厚度測定，取平均值為厚度，單位為mm.

參照 GB/T 1040.3—2006《塑料拉伸性能的測定第3部分》方法[16]，利用萬能拉力機(jī)，測定膜樣品的抗張強(qiáng)度和斷裂伸長率.將膜裁成2 cm×15 cm的長方形樣品，初始夾距為10 cm，拉伸速率0.8 mm·s-1，每組膜測定3次取平均值.

式中，σ為拉伸強(qiáng)度(N)；p為最大負(fù)荷(N)；b為膜的寬度(mm)；d為膜厚度(mm)；

式中，ε為斷裂伸長率(%)；L為膜在斷裂時(shí)的長度(mm)；L0為膜的初始長度(mm).

2)含水率(MC)和水蒸氣透過率(WVP)測定

含水率：在105 ℃的烘箱中將待測膜烘干24 h，以干基含水量表示，每組膜重復(fù)測定3次：

式中，MC為含水率(%)；m為待測膜質(zhì)量(g)；m0為待測膜干質(zhì)量(g).

根據(jù)GB/T 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸汽性試驗(yàn)方法》測定水蒸汽透過系數(shù)的測定[17]，相對濕度60%，溫度23 ℃，每個(gè)待測膜重復(fù)測3次，取平均值，計(jì)算水蒸氣透過系數(shù)(WVP)：

式中，WVP為水蒸氣透過系數(shù)(g·mm·h-1·m-2·kPa-1)；m為透過膜的水分的質(zhì)量(g)；L為膜的厚度(mm)；A為膜的有效面積(m2)；t為水分透過時(shí)間(h)；ΔP為膜兩側(cè)水分蒸汽壓差(kPa).

3) 傅里葉變換紅外光譜分析(FTIR)

將膜樣品充分干燥2周后，剪成 30×30 mm 大小的方形膜片，用傅里葉變換紅外光譜儀將分辨率設(shè)為2 cm-1，在500～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，進(jìn)行紅外掃描，掃描15次，觀察膜樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)和基團(tuán)變化，記錄各樣品的紅外光譜圖.

4) 復(fù)合膜X-射線衍射光譜(XRD)測定

室溫條件下，以Cu-Kα射線源(λ=0.154 06 nm)，電功率為2 000 W(40 kV×50 mA)，掃描角度(2θ)是5～40 °，掃描速度為 4°·min-1，步長0.01 °.使用X-射線衍射儀記錄各種膜的X-射線衍射圖譜.

5) 復(fù)合膜熱重分析(TG)

稱取根皮素、CS、PVA、CS-PVA及CS-PVA-PP復(fù)合膜各5 mg，檢測溫度為0 ℃到800 ℃，升溫速率為10 ℃·min-1，及時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象并處理數(shù)據(jù)，對各樣品的熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析.

6) 復(fù)合膜掃描電鏡分析(SEM)

將充分干燥并脫水后的膜樣品，在液氮中截裂，在真空下，分別對固定在樣品臺的待測膜的水平面與橫斷面進(jìn)行噴金處理，厚度約為 10 μm.在加速電壓為10 kV，通過放大不同倍數(shù)，觀察待測膜的截面和表面的微觀結(jié)構(gòu)形貌，拍攝圖片記錄.

7) 抗氧化特性

準(zhǔn)確稱取50 mg的薄膜樣品浸提在10 mL蒸餾水中,攪拌2 h后以4 000 r·min-1速率離心5 min，上層清液評估其抗氧化性能.

膜提取物的ABTS+自由基清除活性根據(jù)于志龍等[18]方法改進(jìn)，制備ABTS溶液(7.4 mmol·L-1)和過硫酸鉀(2.6 mmol·L-1)，并將兩者混合后置于黑暗處，室溫保存16 h，形成ABTS自由基溶液.用蒸餾水稀釋原液，在734 nm處調(diào)整吸光度至0.700 ± 0.001.100 μL膜提取液或100 μL蒸餾水與1.0 mL的ABTS溶液混合10 min后保存在一個(gè)黑暗的地方.讀取樣品在734 nm處的吸光度，按式(1)測定其清除活性.

(1)

式中，As為樣品吸光值，Ac空白吸光值.

膜提取物清除DPPH自由基的活性根據(jù)Parveen等[19]的方法，并進(jìn)行調(diào)整.用乙醇配制DPPH溶液(0.1 mmol·L-1).然后取不同濃度提取液0.5 mL和對照樣品(0.5 mL蒸餾水)加入到1.5 mL的DPPH溶液中，避光靜置 30 min，讀取樣品在517 nm處的吸光度，按式(2)測定其清除活性.

(2)

式中,As為樣品吸光值，Ac空白吸光值.

膜提取物對鐵離子的還原能力的測試.將0.5 mL的膜提取物混合與1.25 mL鐵氰化鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%和1.25 mL的磷酸鹽緩沖劑(0.2 mol·L-1，pH值6.6)后在50 ℃下靜置20 min.得到的溶液與1.25 mL的檸檬酸(10%)溶液混合后在4 000 r·min-1下離心10 min.將1.25 mL上清液中加入1.25 mL蒸餾水(含有250 μL的0.1% FeCl3)中，讀取樣品在517 nm處的吸光度[20].

8) 抗菌特性

根據(jù)Zhang等[21]的方法，測定了保鮮薄膜對大腸桿菌O157:H7的抑菌圈直徑來定性抑菌活性.將濾紙切成直徑為10 mm的圓形完全浸沒于復(fù)合膜提取液中24 h后取出，用紫外線燈殺菌約20 min，然后置于已接種上述病原體的固體培養(yǎng)基表面.37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)期結(jié)束后，測量濾紙周圍透明區(qū)域的直徑.

2 結(jié)果與討論

2.1 拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率

抗拉強(qiáng)度(TS)是膜機(jī)械性能參數(shù)，代表在外力拉扯下膜斷裂的難易程度，高TS膜更有利于保持其在實(shí)際應(yīng)用過程中的完整性[22].利用萬能拉力機(jī)對富含根皮素CS-PVA復(fù)合膜、純CS膜、CS-PVA復(fù)合膜和純PVA膜進(jìn)行機(jī)械性能測試，結(jié)果見表1.

表1 CS、PVA、CS-PVA及CS-PVA-PP復(fù)合膜膜厚和機(jī)械性能

由表1可看出，純PVA膜的拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長率均高于純CS膜，表明純PVA膜機(jī)械性能優(yōu)于CS膜.由于根皮素具有疏水性，隨著兩者復(fù)合膜中加入蘋果皮根皮素，復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長率逐漸增加，同時(shí)又改變了—NH2和—OH基團(tuán)的分子間作用力，增加了分子之間的交聯(lián)，使膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，復(fù)合膜的機(jī)械性能提高[22].隨著根皮素加入，復(fù)合膜機(jī)械性能增加，斷裂伸長率呈下降的趨勢.其拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率分別為134.7 MPa和9.5%遠(yuǎn)高于純CS膜.

2.2 含水率和水蒸氣透過率

含水率大小反映保鮮膜維持水分能力的強(qiáng)弱，含水率較低，保鮮效果較好.水蒸氣過率(WVP)是衡量保鮮膜阻水性的一個(gè)重要指標(biāo).在相同的條件下，其數(shù)值越小，說明水蒸氣越不易透過，復(fù)合膜阻隔水的性能、防潮防腐效果越好，有利于延長食品的貨架期[23].

由表2可知，純CS膜含水率和WVP值最高，分別達(dá)到28.25%和54.7 g·cm-2·s-1，說明其含水率較高，對水蒸氣的阻隔能力較差.膜中含水率隨著根皮素的增加而逐漸下降，主要是根皮素與CS-PVA復(fù)合膜之間相互作用，從而限制了復(fù)合膜與水分子的相互作用，所以水蒸汽通過率也降低.可能形成靜電復(fù)合物，使膜分子間緊密排列，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密，改善了薄膜對水蒸氣的阻隔性[23]，推測原因可能也是由于根皮素本身含有大量非親水基團(tuán)，也改善了薄膜對水蒸氣的阻隔性.

表2 CS、PVA、CS-PVA及CS-PVA-PP復(fù)合膜膜厚、含水率和水蒸氣透過系數(shù)值

2.3 TG分析

如圖1所示，純PVA膜和純CS膜的熱分解可分為三個(gè)階段，首先主要是膜水分和乙酸殘留蒸發(fā)[24]：在0～130 ℃純PVA膜和純CS膜質(zhì)量損失約為2.62%和6.18%；再次主要是聚合物主鏈的熱分解：純PVA膜聚合物主鏈的熱分解在200～317 ℃，質(zhì)量損失為50.16%，最大失重速率溫度為285 ℃，純CS膜聚合物主鏈的熱分解在130～520 ℃，質(zhì)量損失為64.19%，最大失重速率為340 ℃；最后800 ℃時(shí)，PVA的總失重率達(dá)到96.33%，CS的總失重率為67.92%.根皮素在0～100 ℃之間沒有熱解反應(yīng)發(fā)生，表明沒有自由水的存在.主要在212～460 ℃階段發(fā)生降解，800 ℃時(shí)，根皮素最終質(zhì)量損失為65.97%.從圖1熱分解曲線可以發(fā)現(xiàn)，PVA熱穩(wěn)定性比CS的差，兩者復(fù)合膜的熱穩(wěn)定性僅有較少的提高.由于根皮素有著較高的穩(wěn)定性，添加根皮素后的CS-PVA復(fù)合膜的穩(wěn)定性顯著高于CS-PVA復(fù)合膜.三元復(fù)合膜的失重溫度和平臺，都不同于單純的CS、PVA及根皮素，CS-PVA-PP三元復(fù)合物的第一個(gè)失重溫度略高于其他單組分，也說明了三者之間通過氫鍵作用將水鎖在復(fù)合膜內(nèi)，從而提高了膜的保水能力和穩(wěn)定性.

圖1 CS、PVA、根皮素、CS-PVA及CS-PVA-PP復(fù)合膜的熱重分析譜圖

2.4 FT-IR

圖2為所制備樣品的紅外光譜圖.從圖中可知，單純蘋果皮根皮素的吸收峰位于3 204 cm-1、1 654 cm-1和1 501 cm-1處，分別對應(yīng)根皮素的—OH、C=O和苯環(huán)C=C伸縮振動(dòng)吸收峰.純CS膜在3 700～3 200 cm-1區(qū)域的寬峰由—OH和—NH2的伸縮振動(dòng)引起，1 532 cm-1處對應(yīng)乙酰氨基的特征峰，屬于C-H彎曲振動(dòng)和N—N伸縮振動(dòng)峰[25].1 374 cm-1處較弱的吸收峰為—CH3和乙酰氨基的變形振動(dòng)，1 053 cm- 1處的峰對應(yīng)CS的C—O—C伸縮振動(dòng)峰[26].純PVA膜的FTIR光譜圖中，在2 918 cm-1處的吸收峰對應(yīng)碳?xì)滏I的伸縮振動(dòng)，3 258 cm- 1和1 422 cm-1對應(yīng)—OH的伸縮振動(dòng)及C=C的彎曲振動(dòng)，在1 095 cm-1處的吸收峰對應(yīng)由C—O—C伸縮振動(dòng)特征峰.CS-PVA復(fù)合膜與添加根皮素后的CS-PVA-PP膜較PVA膜FTIR光譜處的吸收峰由低波數(shù)向高波數(shù)方向移動(dòng)，—OH由3 258 cm-1移動(dòng)到3 269 cm-1處，C—H伸縮振動(dòng)吸收峰2 918 cm-1移動(dòng)至2 920 cm-1處.從FTIR光譜圖可以看出：添加根皮素后的CS-PVA復(fù)合膜沒有發(fā)生有化學(xué)鍵斷裂和生成的化學(xué)反應(yīng)，所以在圖譜上沒有觀察到新的特征峰出現(xiàn)和消失.

圖2 CS、PVA、根皮素、CS-PVA及CS-PVA-PP復(fù)合膜的紅外譜圖

2.5 XRD

圖3為所制備樣品的XRD圖譜.CS膜的兩個(gè)主要衍射峰為2θ=9.3 °和 20.6 °，PVA膜有 1個(gè)主要衍射峰，2θ值在19.7 °，而 20.6 °的衍射峰不太明顯；蘋果皮根皮素主要有4個(gè)衍射峰，2θ值分別在8.08 °、10.74 °、20.04 °、28.26 °處，有較好的晶體形態(tài).PVA膜與CS膜基本上不存在晶型結(jié)構(gòu).添加根皮素的殼聚糖PVA復(fù)合膜較未添加根皮素的CS-PVA復(fù)合膜的2θ在19.56 °出現(xiàn)了較寬的衍射峰，保留了根皮素在2θ值為20 °左右的衍射峰，從而說明CS、PVA分子與蘋果皮根皮素分子之間發(fā)生相互作用，即混合基質(zhì)膜中CS、PVA與根皮素的復(fù)合物堆積的有序性.

圖3 CS、PVA、根皮素、CS-PVA及CS-PVA-PP復(fù)合膜的XRD譜圖

2.6 SEM

復(fù)合膜的微觀結(jié)構(gòu)，通過SEM分別對其表面和斷裂截面進(jìn)行觀測，其結(jié)果如圖4所示.由復(fù)合膜表面SEM觀測結(jié)果可以看出：純CS膜表面呈不規(guī)則絮狀，純PVA膜、CS-PVA膜、CS-PVA-PP膜表面均無裂紋，細(xì)膩光滑，無氣孔，無明顯的顆粒物存在.對斷裂截面分析，發(fā)現(xiàn)除純CS膜斷裂截面較為粗糙，其余三種膜斷紋較清晰整齊.由此，可以斷定殼聚糖、聚乙烯醇、蘋果皮根皮素三者間相容性極高，三者通過分子間的氫鍵，按照一定的規(guī)則有序排列，其流平均一，成膜形態(tài)較好.

注：復(fù)合膜中添加3%根皮素

2.7 抗氧化活性及抗菌性能

通過測定復(fù)合膜對DPPH和ABTS自由基的清除能力及還原能力來研究根皮素對殼聚糖復(fù)合膜抗氧化性能的影響.由表3可以看出，隨根皮素添加量增加殼聚糖復(fù)合膜抗自由基活性和還原能力也隨之增加，這可能與根皮素原本的抗氧化活性有關(guān).研究結(jié)果表明，添加根皮素后制備的殼聚糖復(fù)合膜的抗氧化活性大大提高，這可能有利于商業(yè)用途，如食品包裝的高氧化易感性.Kumar等[27]也研究了類似的結(jié)果，殼聚糖-普魯蘭薄膜的抗氧化性可以通過添加生物活性酚類化合物來提高.

表3 不同濃度根皮素(PP)CS-PVA復(fù)合膜的清除自由基(ABTS和DPPH)活性、還原能力和抗菌活性

通過測定抑菌圈直徑，研究了薄膜對革蘭氏陰性(E.coli)菌株的抑菌性能如圖5所示.對照殼聚糖復(fù)合膜對供試菌株有較弱的抑菌活性，但含有根皮素的薄膜樣品對單核細(xì)胞大腸桿菌有較好的抑制作用且根皮素濃度越高的膜具有的抗菌活性越高.根皮素含量為3%的殼聚糖復(fù)合膜抑制效果最好.此結(jié)果與Ali等研究結(jié)果一致，他們研究了淀粉基膜對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抗菌活性是通過添加酚類活性物質(zhì)而提高的[28].因此，以CS-PVA復(fù)合膜和根皮素為原料制成的薄膜是開發(fā)抗菌包裝系統(tǒng)的理想材料之一.

圖5 不同濃度根皮素(PP)CS-PVA復(fù)合膜的抑菌效果

3 結(jié)論

本研究以不同濃度的蘋果皮提取物根皮素作為活性物質(zhì)來源，成功的與CS、PVA復(fù)合形成薄膜，開發(fā)出一種具有抗氧化抗菌包裝膜.根皮素的加入增加了CS-PVA復(fù)合膜的熱穩(wěn)定性、拉伸強(qiáng)度和水蒸氣透過率，降低了其斷裂伸長率.從FTIR，XRD、SEM測試結(jié)構(gòu)來看，CS-PVA-PP復(fù)合膜通過氫鍵作用，相容性良好.形成了按照一定規(guī)則有序組裝的，均一、穩(wěn)定的復(fù)合膜，該復(fù)合膜具有更強(qiáng)的保水能力，并且很好的保留了CS、PVA和根皮素的功能性.根皮素的加入顯著提高了CS-PVA復(fù)合膜還原力、抗自由基活性和抗菌性能.根皮素作為食品工業(yè)的一種低成本副產(chǎn)品，在生物聚合物膜中應(yīng)用以及改善其生物功能特性方面具有很大的潛力.