桉樹枝癭姬小蜂胚胎發(fā)育及胚后發(fā)育

關(guān)月姍, 朱方麗,2, 楊儀韓, 曹惠怡, 嚴玉寧, 王興民,*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院昆蟲系, 生物防治教育部工程研究中心, 廣州 510642; 2. 常州市房屋安全和白蟻防治指導(dǎo)中心,江蘇常州 213000; 3. 青海高等職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)與資源環(huán)境系, 青海海東 810700)

桉樹枝癭姬小蜂Leptocybeinvasa隸屬膜翅目(Hymenoptera)小蜂總科(Chalcidoidea)姬小蜂科 (Eulophidae)，于2004年確定為新屬新種(Mendel, 2004)，該蜂最早發(fā)現(xiàn)于中東、地中海一帶，2012年前后，已在亞、歐、美三大洲超過26個國家都有分布(Arzone and Alma, 2000; Viggianietal., 2002; Aytar, 2003, 2006; Ramadan, 2004; Brancoetal., 2006; Nyekoetal., 2007; Udagedara and Karunaratne, 2014; Vanegas-Ricoetal., 2015)。2007年首次在我國廣西東興縣發(fā)現(xiàn)該蜂，當時普查結(jié)果顯示廣西的發(fā)生面積已達2 000 hm2，在之后幾年里，該蜂擴散到廣東、福建、海南，并向內(nèi)陸省份擴散(唐超等, 2008; 伍荔霞, 2008; 吳耀軍等, 2009; 魏初獎等, 2017)。桉樹枝癭姬小蜂在我國華南地區(qū)一年發(fā)生4～5代，世代重疊(吳耀軍等, 2010; 羅基同等, 2011; 邱煥秀等, 2011; 朱方麗等, 2013)。危害桉屬樹木的嫩枝，在嫩莖、葉柄、葉脈處產(chǎn)生蟲癭。嚴重侵染可導(dǎo)致葉、枝變形，樹木生長遲緩，在新植桉林和苗圃地危害嚴重(姚賢宇等, 2016; 肖銀波等, 2018)。在我國，其主要危害的桉樹種類有赤桉Eucalyptusldulensis、巨桉E.grandis、尾赤桉E.urophylla、鄧恩桉E.dunnii、窿緣桉E.exserta和多利桉E.dorrigoensis等(武海衛(wèi)等, 2009; 常潤磊等, 2010; 韋建林等, 2013; 張開存等, 2017)。黃夢伊等(2020)基于MaxEnt對桉樹枝癭姬小蜂在中國發(fā)生趨勢進行預(yù)測：高、中度適生區(qū)面積分別為141.12萬和82.56萬km2，分別占我國內(nèi)陸國土的14.7%和8.6%。該蜂對廣泛應(yīng)用于造紙、園林綠化、生態(tài)防護林(鄭嘉琪和陳少雄, 2017)的桉樹林造成嚴重危害，導(dǎo)致較大的經(jīng)濟損失。

近年來，我國學(xué)者對該蜂的生物學(xué)及生態(tài)學(xué)特性、監(jiān)測防控等多方面進行了深入研究，以求為有效防控該蜂提供更多的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)(谷平等, 2012)。但關(guān)于該蜂的胚胎發(fā)育及胚后發(fā)育方面，國內(nèi)外研究報道較少。Marzo(2008)研究表明，桉樹枝癭姬小蜂的卵具有卵柄，且在生殖系統(tǒng)內(nèi)具有兩個生殖粘腺，但關(guān)于該蜂的卵在孵化過程中的變化(胚胎發(fā)育過程)尚未報道。在該蜂的胚后發(fā)育方面，Mendel等(2004)根據(jù)蟲癭發(fā)育過程中的主要特征劃分為5個發(fā)育階段，分別為蟲癭呈圓球形綠色且相互獨立、蟲癭呈典型的腫塊型、蟲癭表面顏色逐漸變?yōu)榉奂t色、進一步呈現(xiàn)淺紅色或暗紅色和蟲癭表面出現(xiàn)羽化孔，但尚未對各發(fā)育階段的蟲癭、蟲室、蟲體的體型大小變化進行深入研究。本研究觀察了桉樹枝癭姬小蜂的胚胎發(fā)育以及蟲癭、蟲室、蟲體三者間相對應(yīng)的發(fā)育過程，以期更深入地了解桉樹枝癭姬小蜂及蟲癭的生物學(xué)特性，為其發(fā)生為害規(guī)律方面提供一定信息。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲及寄主植物

桉樹枝癭姬小蜂種群飼養(yǎng)于寄主植物尾赤桉Eucalyptusurophylla×Eucalyptuscamaldulensis。尾赤桉苗高約為50 cm，生長在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院網(wǎng)室內(nèi)。

1.2 桉樹枝癭姬小蜂雌性生殖系統(tǒng)解剖

將桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲放入Ringer氏生理鹽水(氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉以及磷酸二氫鈉)，在體式鏡(Leica M10)下解剖，取雌性生殖系統(tǒng)，移至顯微鏡(Olympus-BX51，配置聯(lián)機數(shù)碼相機CoolSNAP-Pro Version 4.1配套圖像攝取和分析軟件，日本奧林巴斯公司)下進行拍攝。

1.3 桉樹枝癭姬小蜂胚胎發(fā)育觀察

選取生長良好的尾赤桉樹苗枝條嫩尖進行套袋，每枝頭接種桉樹枝癭姬小蜂雌成蜂3～5頭，3 h后將成蜂趕離，將樹苗置于26℃恒溫箱中培養(yǎng)。每隔6 h隨機選取部分枝條嫩尖在體式鏡(Leica M10)下進行解剖，取出卵并在顯微鏡(Olympus-BX51，配置聯(lián)機數(shù)碼相機CoolSNAP-Pro Version 4.1配套圖像攝取和分析軟件，日本奧林巴斯公司)下放大拍攝(400×)。

1.4 桉樹枝癭姬小蜂胚后發(fā)育指標測定

待1.3節(jié)中的尾赤桉苗接種培養(yǎng)10 d，選取30個蟲癭或30頭幼蟲在體式鏡(Leica M10)下進行解剖觀察，并在帶有數(shù)碼照相機(Axiocan HRc)的體視鏡(SteREO Discovery V20， Zeiss)下拍攝記錄蟲癭、蟲室及桉樹枝癭姬小蜂幼體的發(fā)育狀況，此后每隔5 d進行一次同樣操作。其中蟲癭需要記錄表面特征和蟲癭直徑變化；蟲室需要記錄薄壁層的出現(xiàn)時間、厚度變化及蟲室直徑變化；桉樹枝癭姬小蜂幼體則需要記錄幼蟲特征及直徑變化，直至發(fā)育到蛹。蟲癭、幼體、蟲室的體積計算采用橢球體積計算方法。橢球體積計算公式如下：

式中，a,b,c分別代表供測物(蟲癭、幼體、蟲室)的中心點沿x,y,z軸上的半徑，圖1示供測物(蟲室)的體積測量方法，蟲癭及幼體的測量方法相同。

圖1 供測物(蟲室)的體積測量Fig. 1 Measurements of the volume of object (chamber)

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0分析處理，用Duncan氏復(fù)極差法檢驗(DMRT)對數(shù)據(jù)差異進行多重比較分析，并用軟件Excel制作圖表。

2 結(jié)果

2.1 桉樹枝癭姬小蜂胚胎發(fā)育

2.1.1桉樹枝癭姬小蜂雌性生殖系統(tǒng)：桉樹枝癭姬小蜂雌性生殖系統(tǒng)由生殖器、受精囊、卵巢和一對輸卵管粘腺組成(圖2: A)。初產(chǎn)的卵具有較長的卵柄，且前端呈乳頭狀(圖2: B)。

圖2 桉樹枝癭姬小蜂雌性生殖系統(tǒng)及卵Fig. 2 Female reproductive system and eggof Leptocybe invasaA: 雌性生殖系統(tǒng)Female reproductive system; B: 卵Egg.

2.1.2桉樹枝癭姬小蜂胚胎發(fā)育：桉樹枝癭姬小蜂胚胎發(fā)育如圖3所示。結(jié)果表明，雌成蟲在植物組織內(nèi)產(chǎn)卵12 h后，卵并沒有出現(xiàn)明顯變化(圖3: A)；24 h，卵柄內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)開始向卵聚集，卵柄末端開始出現(xiàn)空白(圖3: B)；36 h，卵開始逐漸分為兩層，胚胎層出現(xiàn)(圖3: C)；48-64 h，可見營養(yǎng)物質(zhì)繼續(xù)向卵頭部位聚集且具明顯的細胞分裂(圖3: D)；72-84 h，卵完整地分為兩層，外層為卵殼，內(nèi)層為胚胎，且內(nèi)部細胞明顯(圖3: E, F)；96-108 h，卵內(nèi)細胞逐漸淡化(圖3: G, H)；直至114 h，幼蟲逐漸成形，且第一次明顯觀察到幼蟲在卵內(nèi)活動，此時卵柄部位已被完全吸收(圖3: I)；132 h，卵內(nèi)幼蟲仍有活動，且在卵頭的頂部出現(xiàn)一孵化孔(圖3: J)；138 h，部分卵開始孵化，幼蟲出現(xiàn)(圖3: K)。當剛孵化的幼蟲靜止時，其呈白色球形，而當其活動時，可觀察到幼蟲的頭和尾，但兩者間相距很近。

圖3 桉樹枝癭姬小蜂胚胎發(fā)育Fig. 3 Embryonic development of Leptocybe invasaA: 產(chǎn)卵后12 h (12 h after egg laying); B: 產(chǎn)卵后24 h (24 h after egg laying); C: 產(chǎn)卵后36 h (36 h after egg laying); D: 產(chǎn)卵后48-64 h (48-64 h after egg laying); E: 產(chǎn)卵后72 h (72 h after egg laying); F: 產(chǎn)卵后84 h (84 h after egg laying); G: 產(chǎn)卵后96 h (96 h after egg laying); H: 產(chǎn)卵后108 h (108 h after egg laying); I-J: 產(chǎn)卵后114-132 h (114-132 h after egg laying); K: 產(chǎn)卵后138 h (138 h after egg laying).

2.2 桉樹枝癭姬小蜂胚后發(fā)育

桉樹枝癭姬小蜂胚后發(fā)育過程如圖4所示。桉樹枝癭姬小蜂幼蟲呈乳白色，隨著發(fā)育時間的延長，蟲體直徑不斷增大(圖4: A-F)；桉樹枝癭姬小蜂的蛹，初期呈乳白色，后逐漸呈成蟲體型，背部有黃色物質(zhì)出現(xiàn)，復(fù)眼突出(圖4: G)；當發(fā)育到50 d，蛹的體色變暗，且兩只復(fù)眼和3只單眼呈紅色(圖4: H)；直至發(fā)育到55 d，蛹發(fā)育到后期，呈黑色且蟲體各個部位特征明顯(圖4: I)。桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體長約1.1～1.4 mm，腹部末端鈍圓，觸角無刺毛；雄成蟲體長約0.8～1.1 mm，腹部末端稍尖，生殖器外露，觸角具有刺毛(圖4: J-K)。桉樹枝癭姬小蜂幼蟲體積隨著發(fā)育時間的延長逐漸增大，且幼蟲體積間存在顯著性差異(F=52.72,df1=6,df2=173,P<0.0001)(表1)。桉樹枝癭姬小蜂幼蟲體積在不同發(fā)育階段，其增長速度間存在顯著性差異(F=16.86,df1=5,df2=12,P<0.0001)(圖5)。桉樹枝癭姬小蜂幼蟲體積增長速率隨發(fā)育時間的延長逐漸增大；至30 d，幼蟲體積增長速率最大，后逐漸放緩，至40 d,增長速率降低為0，幼蟲發(fā)育到蛹。

圖4 桉樹枝癭姬小蜂胚后發(fā)育Fig. 4 Postembryonic development of Leptocybe invasaA: 10 d; B: 15 d; C: 20 d; D: 25 d; E: 30 d; F: 35-40 d; G: 45 d; H: 50 d; I-J: 55 d; K: 雌成蟲Female adult; L: 雄成蟲Male adult.

表1 桉樹枝癭姬小蜂蟲癭、蟲室和幼體的體積Table 1 Volume of galls, chambers and larvaeof Leptocybe invasa

圖5 桉樹枝癭姬小蜂幼蟲體積的增長速率Fig. 5 Increase rate of larval volumeof Leptocybe invasa折線圖上不同字母(平均值±標準誤)表示差異顯著(P<0.05, Duncan氏復(fù)極差法檢驗)。圖8同。Data (mean±SE) followed by different letters in the line chart are significantly different (P<0.05, Duncan’s multiple range test). The same for Fig. 8.

桉樹枝癭姬小蜂幼蟲以寄主植物為食，其取食部位為蟲癭內(nèi)的薄壁組織。當幼蟲剛孵化時，其被包裹在柔嫩的植物組織內(nèi)(圖7: A)；接種20 d，蟲室開始逐步分化成兩層，外層逐步栓化變硬，而靠近幼蟲的內(nèi)層則變成肉質(zhì)的薄壁細胞層，為幼蟲提供食物(圖7: B-F)；幼蟲發(fā)育到末齡時，薄壁細胞層消失，僅剩下內(nèi)壁光滑且栓化的蟲室外層(圖7: G-H)。薄壁層作為桉樹枝癭姬小蜂幼蟲的食物來源，其厚度隨蟲癭日齡的變化而變化(F=13.56,df1=5,df2=185,P<0.0001)(圖8)，接種25 d后厚度趨于最大，45 d時基本消失。

圖7 桉樹枝癭姬小蜂蟲室發(fā)育過程Fig. 7 Developmental process of chambersof Leptocybe invasaA: 10 d; B: 15 d; C: 20 d; D: 25 d; E: 30 d; F: 35 d; G: 40 d; H: 45 d.

圖8 桉樹枝癭姬小蜂蟲癭內(nèi)的薄壁細胞層厚度隨蟲癭日齡的變化Fig. 8 Changes of the thickness of parenchyma celllayer in Leptocybe invasa galls with the age of gall

2.3 寄主植物組織受害癥狀的變化過程

桉樹枝癭姬小蜂蟲癭的發(fā)育歷程如圖6所示。桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲產(chǎn)卵后，其產(chǎn)卵部位出現(xiàn)植物的滲出液，1 h，呈現(xiàn)黑色疤痕(圖6: A)；前10 d，蟲癭形態(tài)無明顯變化(圖6: B)；至15 d，蟲癭開始膨大，且疤痕開始逐漸脫落，此時的蟲癭呈綠色或淡紅色(圖6: C, D)；25 d，疤痕已完全脫落，此時的蟲癭呈現(xiàn)紅色且具有光澤(圖6: E)；30-50 d，蟲癭體積逐步增大，且顏色由紅色逐漸變?yōu)樯罴t色，而蟲癭表面的光澤亦逐漸褪去(圖6: F-I)；55 d，桉樹枝癭姬小蜂成蟲羽化，蟲癭表面出現(xiàn)羽化孔(圖6: J)。桉樹枝癭姬小蜂的蟲癭體積隨生長發(fā)育時間的延長而增大，在不同發(fā)育階段間蟲癭體積存在顯著性差異(F=37.25,df1=8,df2=289,P<0.0001)(表1)，50 d時蟲癭體積約是第10天的16倍。

圖6 桉樹枝癭姬小蜂蟲癭發(fā)育過程Fig. 6 Developmental process of Leptocybe invasa gallsA: 1-5 d; B: 10 d; C: 15 d; D: 20 d; E: 25 d; F: 30 d; G: 35 d; H: 40 d; I: 45-50 d; J: 55 d.

3 結(jié)論及討論

26℃恒溫條件下，桉樹枝癭姬小蜂完成胚胎發(fā)育約需138 h，整個過程可分3個階段：產(chǎn)卵后24 h為營養(yǎng)物質(zhì)聚集期，36-84 h為胚胎期，96-138 h為孵化期(圖3)。桉樹枝癭姬小蜂在蟲癭內(nèi)完成發(fā)育，其發(fā)育過程與蟲癭發(fā)育過程保持一致。當桉樹枝癭姬小蜂若蟲發(fā)育到末期或蛹期時，內(nèi)部蟲室和外部蟲癭均不再膨大。桉樹枝癭姬小蜂幼蟲體積增長速率隨發(fā)育時間呈現(xiàn)單峰型，即在30 d時，其增長速率達到最大(圖5)。刺桐姬小蜂蟲癭發(fā)育情況與桉樹枝癭姬小蜂蟲癭基本相似(鄧曉韶等, 2009; 汪少妃等, 2015)。

桉樹枝癭姬小蜂以蟲癭內(nèi)的髓(薄壁細胞)為食物，因此其發(fā)育進程與薄壁層厚度存在一定關(guān)系。蟲癭內(nèi)薄壁層厚度隨時間變化呈現(xiàn)拋物線狀，其前期增長較快，后期下降變緩。25 d時，薄壁層厚度達到最大，此時桉樹枝癭姬小蜂幼蟲處于低齡階段，其取食量較??；之后隨著幼蟲取食量的增大，薄壁層厚度不再增大，而呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，直至幼蟲化蛹前，髓部被完全取食(圖8)。刺桐姬小蜂幼蟲也是以髓為食料，其蟲癭中的薄壁層第Ⅲ階段顯著加厚(鄧曉韶, 2009; 汪少妃等, 2015)。

研究刺桐姬小蜂蟲癭的學(xué)者將其分為癭室(活動層)、薄壁層(營養(yǎng)層)、內(nèi)核(保護層)和周圍組織(表皮層)(鄧曉韶, 2009; 汪少妃等, 2015)。本研究通過解剖將桉樹枝癭姬小蜂蟲癭分為3個基本層，最外層為膨大的表皮層，該層包括植物原有的維管束層、皮層和表皮等結(jié)構(gòu)；中間層為栓化層，該層主要其支撐作用，后期呈現(xiàn)白色栓化；內(nèi)層為薄壁細胞層，也稱髓，是桉樹枝癭姬小蜂幼蟲取食的部位；而內(nèi)部的空腔就是幼蟲棲身的地方。這與吳耀軍等(2012)的描述基本一致。

本研究觀察了桉樹枝癭姬小蜂的胚胎發(fā)育以及蟲癭、蟲室、蟲體三者間相對應(yīng)的發(fā)育(胚后發(fā)育)過程，為深入了解該害蟲的生物學(xué)特征和發(fā)生為害規(guī)律提供一定的基礎(chǔ)信息。