RNAi介導(dǎo)的GdHsp60和GdHsp70基因沉默對(duì)沙蔥螢葉甲幼蟲(chóng)抗寒性的影響

張宏玲, 任 浩, 李凱旋, 田 宇, 張 恒, 李艷艷,李 玲, 龐保平, 譚 瑤,*

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原昆蟲(chóng)研究中心, 呼和浩特010019; 2. 鑲黃旗草原工作站, 內(nèi)蒙古鑲黃旗013250;3. 正鑲白旗草原工作站, 內(nèi)蒙古正鑲白旗 013800)

沙蔥螢葉甲Galerucadaurica屬鞘翅目(Coleoptera)葉甲科(Chrysomelidae)螢葉甲亞科(Galerucinae)。據(jù)報(bào)道該蟲(chóng)現(xiàn)主要分布于俄羅斯、蒙古國(guó)、朝鮮、韓國(guó)以及中國(guó)的內(nèi)蒙古、新疆、甘肅等地(楊星科等, 2010)，是一種主要以幼蟲(chóng)取食百合科(Liliaceae)蔥屬Allium植物的典型草地害蟲(chóng)(昊翔等, 2015)。近年來(lái)，沙蔥螢葉甲在內(nèi)蒙古草原大面積暴發(fā)，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)夭莓a(chǎn)業(yè)、畜牧業(yè)發(fā)展、降低了農(nóng)牧民收入，并加劇了草地退化的程度(陳龍等, 2018a)，對(duì)北方草原生態(tài)安全和地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重的威脅。內(nèi)蒙古地區(qū)屬于溫帶大陸性氣候帶，夏季涼爽，冬季嚴(yán)寒，抗寒性是保證昆蟲(chóng)越冬存活的前提條件(Kangetal., 2007)，而抗寒性的強(qiáng)弱決定了昆蟲(chóng)低溫下存活的概率(Chen and Kang, 2005)。沙蔥螢葉甲以卵在極寒條件下越冬，幼蟲(chóng)發(fā)育也伴隨著低溫變化，其在短時(shí)間內(nèi)對(duì)強(qiáng)烈變化的溫度的快速適應(yīng)保證了種群的迅速增加(馬崇勇等, 2012)，這種抗寒特性是使其維持種群數(shù)量的重要生態(tài)對(duì)策(Tanetal., 2018)。前期對(duì)沙蔥螢葉甲的抗寒性研究主要集中于低溫脅迫對(duì)沙蔥螢葉甲各蟲(chóng)態(tài)生長(zhǎng)發(fā)育的影響(李浩等, 2014, 2015; 高靖淳等, 2015; Zhouetal., 2016)、沙蔥螢葉甲響應(yīng)低溫脅迫的生理生化機(jī)制(周曉榕等, 2016)、低溫脅迫下抗寒相關(guān)基因的挖掘(路標(biāo)等, 2017; 陳龍等, 2018b)和克隆與表達(dá)(譚瑤等, 2017; 陳龍等, 2019; Huoetal., 2019)?？购虻墓δ苎芯坎⑽瓷钊腴_(kāi)展。

熱激蛋白(heat shock proteins, HSPs)是一類(lèi)受到外界刺激后在生物體內(nèi)迅速合成或表達(dá)量升高的蛋白(King and MacRae, 2015)。根據(jù)分子量及生物學(xué)功能不同，HSPs可分為HSP100家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族、HSP40家族和小分子HSPs(SHSPs)6個(gè)家族。熱激蛋白在進(jìn)化上具有高度保守性(Sietal., 2016)，涉及蛋白質(zhì)折疊、裝配、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞凋亡，充當(dāng)分子伴侶等功能(Hartl and Hayer-Hartl, 2009; Seddigh, 2019)。依據(jù)誘導(dǎo)表達(dá)特性，昆蟲(chóng)中的熱激蛋白可分為組成型熱激蛋白(cognate heat shock protein)和誘導(dǎo)型熱激蛋白(inducible heat shock protein)，主要負(fù)責(zé)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，促進(jìn)變性蛋白質(zhì)修復(fù)，在機(jī)體受逆境脅迫后保護(hù)蛋白、多肽(Nollen and Morimoto, 2002)。在許多研究中熱激蛋白基因常作為昆蟲(chóng)響應(yīng)高低溫變化的分子指示標(biāo)記被報(bào)道，Dahlgaard等(1998)用高溫處理果蠅，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Hsp70的表達(dá)與果蠅耐熱性呈正相關(guān)；Sonoda等(2006)研究表明：用低溫處理二化螟Chilosuppressalis非滯育幼蟲(chóng)誘導(dǎo)了Hsp90的高表達(dá)；Yu等(2018)采用qPCR方法分析了-11～27℃溫度處理下二化螟幼蟲(chóng)HSP60家族的Tcp-1基因mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)受到低溫脅迫后該基因的表達(dá)上調(diào)；Quan等(2020)通過(guò)研究云杉色卷蛾Choristoneurafumiferana中的8個(gè)ATP依賴(lài)的HSP轉(zhuǎn)錄本(CfHSPs)，發(fā)現(xiàn)1個(gè)HSP70基因在幼蟲(chóng)期受冷脅迫后表達(dá)上調(diào)。長(zhǎng)期以來(lái)，熱激蛋白被認(rèn)為在昆蟲(chóng)對(duì)外界環(huán)境溫度適應(yīng)性中發(fā)揮了重要作用，但在不同昆蟲(chóng)、不同蟲(chóng)態(tài)中不同熱激蛋白的具體作用種類(lèi)和機(jī)制仍不清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)：在越冬蟲(chóng)態(tài)及低溫馴化下的沙蔥螢葉甲中，編碼Hsp60蛋白(GdHsp60)和誘導(dǎo)型Hsp70蛋白(GdHsp70)的基因顯著高表達(dá)(譚瑤等, 2017; Tanetal., 2018)。這是否增強(qiáng)了沙蔥螢葉甲抗寒能力，介導(dǎo)了越冬時(shí)期的抗寒性，尚不清楚。

本研究為明確GdHsp60和GdHsp70基因在沙蔥螢葉甲抗寒性中的功能，采用飼喂法和顯微注射法進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同導(dǎo)入方法的沉默效果以及靶標(biāo)基因被沉默后對(duì)沙蔥螢葉甲幼蟲(chóng)抗寒能力的影響。為深入開(kāi)展沙蔥螢葉甲幼蟲(chóng)適應(yīng)高寒環(huán)境的生態(tài)對(duì)策與分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為沙蔥螢葉甲的監(jiān)測(cè)預(yù)警及科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

將2019年9月采自?xún)?nèi)蒙古錫林郭勒鑲黃旗草原的沙蔥螢葉甲越冬卵在4℃冷藏箱(YC-260L，安徽美菱生物醫(yī)療)中保存，于2020年4月初轉(zhuǎn)放入25±1℃、相對(duì)濕度70%±5%、光周期14L∶10D的人工氣候箱中培養(yǎng)(PRX-350C，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)，待幼蟲(chóng)孵化后以室內(nèi)種植的韭菜為食料進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑TaKaRa RNAiso Plus，Taq酶預(yù)混液Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 Plus Dye)，去gDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser，TA克隆載體pMD19-T Vector Cloning Kit，DNA分子量衡量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 DNA Marker，熒光定量試劑盒SYBR Green Real-time PCR Master Mix 均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；核酸瓊脂糖凝膠回收試劑、大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司；dsRNA合成試劑盒T7 Ribo MAXTMExpress RNAi System試劑盒購(gòu)自Promega公司；引物合成及序列測(cè)定由生工生物工程(北京) 股份有限公司完成。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭Ｆ胀≒CR儀(T100 Thermal Cycler，Bio-Rad，美國(guó))；熒光定量PCR儀(FTC-3000P，F(xiàn)unglyn Biotech，加拿大)；超微量分光光度計(jì)(Nano Photometer TM P-Class，德國(guó))；智能型人工氣候箱(PRX-350C，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)；低溫培養(yǎng)箱(LRH-100CB型，上海一恒儀器公司)；醫(yī)用冷藏箱(YC-260L,安徽美菱生物醫(yī)療)和多路溫度自動(dòng)記錄儀(TP9024U型，深圳市拓普瑞電子有限公司)。

1.3 dsRNA的合成

用TaKaRa RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)提取沙蔥螢葉甲幼蟲(chóng)總RNA，并通過(guò)超微量分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的濃度及質(zhì)量；使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)GdHsp60(GenBank登錄號(hào): KY460463)和GdHsp70(GenBank登錄號(hào): KY460462)的cDNA全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：cDNA 模板1 μL，上下游引物(10 pmol /L) 各1 μL，Premix TaqTM12.5 μL，RNase-Free ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序： 94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 60 s，72℃ 2 min，循環(huán)30次；72℃ 10 min。

將通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證的GdHsp60和GdHsp70基因序列輸入在線網(wǎng)站http:∥www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl，設(shè)計(jì)5′端含有T7啟動(dòng)子序列的dsRNA引物(表1)。按照T7 Ribo MAXTMExpress RNAi System 試劑盒說(shuō)明書(shū)合成dsRNA并測(cè)定其濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合成的dsRNA分子量大小是否與預(yù)期一致，-80℃保存。 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)dsRNA濃度為1 000 ng/μL時(shí)，對(duì)GdHsp60和GdHsp70基因表達(dá)RNAi效果良好。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 飼喂法RNAi

分別收集新孵化幼蟲(chóng)(1齡第1天)和2齡幼蟲(chóng)(蛻皮第1天)，置于干凈的培養(yǎng)皿中，每皿20頭，每個(gè)處理10皿。以長(zhǎng)度為15 mm在濃度為1 000 ng/μL的dsRNA(dsGdHsp60和dsGdHsp70)中浸泡30 s的韭菜葉片為飼料，分別用以喂飼供試幼蟲(chóng)。飼喂1 d后提供新鮮的韭菜葉片。每日記錄幼蟲(chóng)死亡率、觀察生長(zhǎng)發(fā)育情況，空白對(duì)照飼喂滅菌水處理的韭菜葉片，陰性對(duì)照飼喂浸泡過(guò)dsGFP的韭菜葉片(賈浩康等, 2019; Mishraetal., 2021)。為明確干擾效果最優(yōu)處理時(shí)間，分別在dsRNA處理幼蟲(chóng)0, 12, 24, 36, 48和72 h后每個(gè)處理收集蟲(chóng)體20頭，在液氮中快速冷凍，-80℃保存用于后續(xù)基因表達(dá)檢測(cè)。

1.5 顯微注射法RNAi

選取發(fā)育進(jìn)度一致的2齡幼蟲(chóng)(蛻皮第1天)，用毛筆小心刷去表皮的土壤和灰塵，用固體膠將其暫時(shí)粘在干凈的載玻片中，使用顯微注射器(SHTMADZU，日本)將0.4 μL(1 000 ng/μL)的dsRNA(dsGdHsp60和dsGdHsp70)注射入幼蟲(chóng)腹部第8節(jié)段，注射后放入帶氣孔的離心管中單獨(dú)飼養(yǎng)，并觀察其死亡率(Gurusamyetal., 2020; Youetal., 2020)。以注射滅菌水和注射dsGFP分別作為空白對(duì)照和陰性對(duì)照，于處理0, 12, 24, 36, 48和72 h時(shí)采樣。

1.6 qPCR測(cè)定RNAi后GdHsp60和GdHsp70的相對(duì)表達(dá)量

根據(jù)GdHsp60和GdHsp70的cDNA全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)特異性引物用于qPCR檢測(cè)(表1)。qPCR反應(yīng)體系(10 μL)：cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix反應(yīng)液 5 μL，滅菌水3.6 μL。選用沙蔥螢葉甲琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDHA)基因作為內(nèi)參基因(Tanetal., 2016)，引物見(jiàn)表1。1.4和1.5節(jié)各處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20頭個(gè)體。使用q-PCR儀(FTC-3000，F(xiàn)unglyn Biotech，加拿大)進(jìn)行測(cè)定，反應(yīng)程序： 95℃預(yù)變性10 min； 95℃變性15 s， 60℃退火1 min， 72℃延伸30 s， 40個(gè)循環(huán)。

1.7 熱電偶法測(cè)定GdHsp60和GdHsp70沉默后沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)的過(guò)冷卻點(diǎn)與結(jié)冰點(diǎn)

為檢測(cè)沉默GdHsp60和GdHsp70對(duì)沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)抗寒性的影響，采用熱電偶法測(cè)定過(guò)冷卻點(diǎn)(super-cooling point, SCP)與結(jié)冰點(diǎn)(freezing point, FP)。使用的儀器有低溫培養(yǎng)箱(LRH-100CB型，上海一恒儀器公司)和多路溫度自動(dòng)記錄儀(TP9024U型，深圳市拓普瑞電子有限公司)。將試蟲(chóng)置于塞有少量脫脂棉花的移液槍頭中，插入測(cè)溫計(jì)熱敏探頭，使熱敏探頭能固定在槍頭內(nèi)并恰好緊貼1.5節(jié)處理24 h后的蟲(chóng)體，隨后置于低溫培養(yǎng)箱中，設(shè)置程序使箱內(nèi)溫度從室溫以約1℃/min的速率下降至-40℃，記錄試蟲(chóng)體溫變化(李浩等, 2015; 史彩華等, 2016)。每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)20頭幼蟲(chóng)。

1.8 生物測(cè)定GdHsp60和GdHsp70被沉默后沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)的致死溫度和-5℃低溫處理的致死時(shí)間

為比較靶標(biāo)基因沉默對(duì)沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)抗寒能力的影響，在室內(nèi)測(cè)定半致死溫度(Ltemp50) 和90%致死溫度(Ltemp90)及-5℃處理下的半致死時(shí)間(Ltime50)和90%致死時(shí)間(Ltime90)。致死溫度測(cè)定方法：將1.5節(jié)處理24 h后的幼蟲(chóng)分別在25, -6, -8, -10, -12和-14±0.5℃的低溫培養(yǎng)箱中處理2 h后，統(tǒng)計(jì)死亡率，計(jì)算Ltemp50和Ltemp90。致死時(shí)間測(cè)定方法：1.5節(jié)處理24 h后的幼蟲(chóng)在溫度為-5℃低溫培養(yǎng)箱中分別處理0, 12, 24, 48, 96, 144及192 h(歐陽(yáng)芳和戈峰, 2014; 李浩等, 2015)，之后將試蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到25℃人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)，觀察存活情況，以能自主爬行作為存活標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)死亡率以計(jì)算Ltime50和Ltime90。每個(gè)處理5組重復(fù)，每組重復(fù)20頭幼蟲(chóng)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析(Livak and Schmittgen, 2001)。通過(guò)SPSS 26.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)沙蔥螢葉甲過(guò)冷卻點(diǎn)和結(jié)冰點(diǎn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。同一因素下，不同處理組相對(duì)表達(dá)量差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA，LSD 法)?；貧w分析(logistic regression)擬合出死亡率與時(shí)間、溫度的關(guān)系變化曲線，確定半致死時(shí)間(Ltime50)及半致死溫度(Ltemp50)(歐陽(yáng)芳和戈峰, 2014)。

2 結(jié)果

2.1 飼喂法RNAi后沙蔥螢葉甲幼蟲(chóng)中GdHsp60和GdHsp70的表達(dá)水平

與飼喂dsGFP的對(duì)照組相比，1齡幼蟲(chóng)飼喂dsGdHsp60 12 h后GdHsp60的表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)，48 h下降程度最高，表達(dá)水平降低了76.07%(P<0.05)(圖1: A)，72 h時(shí)表達(dá)量有所恢復(fù)(P=0.06)；飼喂dsGdHsp70 24 h后GdHsp70的表達(dá)水平降至最低，降低了59.54%(P<0.05)，72 h后恢復(fù)至正常水平(P=0.90)(圖1: B)。與飼喂dsGFP的對(duì)照組相比，2齡幼蟲(chóng)飼喂dsGdHsp60 24 h后GdHsp60的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，在36 h后表達(dá)量最低，降低了34.00%(P<0.05)，之后開(kāi)始恢復(fù)(圖1: C)；飼喂 dsGdHsp70 12 h后，GdHsp70的表達(dá)量降至最低，顯著降低了83.49%(P<0.05)，在72 h時(shí)完全恢復(fù)(圖1: D)。結(jié)果表明，飼喂dsGdHsp60和dsGdHsp70均能夠有效降低沙蔥螢葉甲1、2齡幼蟲(chóng)體內(nèi)靶標(biāo)基因的表達(dá)水平。

圖1 飼喂dsRNA后沙蔥螢葉甲1(A, B)和2齡(C, D)幼蟲(chóng)GdHsp60(A, C)和GdHsp70(B, D)的相對(duì)表達(dá)量Fig. 1 Relative expression levels of GdHsp60 (A, C) and GdHsp70 (B, D) in the 1 st (A, B)and 2nd (C, D) instar larvae of Galeruca daurica fed with dsRNA以滅菌水處理的空白對(duì)照組(CK)的基因表達(dá)量為基準(zhǔn)，以dsGFP處理組為陰性對(duì)照組。下同。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)，柱上星號(hào)和雙星號(hào)分別表示差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01, ANOVA, LSD)；圖2同。The expression levels of genes in the blank control group (CK)(treatment with sterile water) were used as the standard, and the dsGFP treatment group was used as the negative control group. The same below. Data in the figure are mean±SE (n=3). The asterisk and double asterisk above bars indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively, by ANOVA, LSD. The same for Fig. 2.

2.2 顯微注射法RNAi后沙蔥螢葉甲幼蟲(chóng)中GdHsp60和GdHsp70的表達(dá)水平

與顯微注射dsGFP的對(duì)照組相比，注射12 h后，沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)體內(nèi)GdHsp60和GdHsp70的表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)，在24 h表達(dá)水平均降至最低，分別降低了84.15%和92.38%(P<0.01)；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，兩個(gè)基因的表達(dá)量逐步上升，其中注射dsGdHsp60 36 h后GdHsp60的表達(dá)量雖有所上升，但與對(duì)照相比仍存在極顯著差異(P<0.01)；而GdHsp70的表達(dá)量在注射48 h后基本恢復(fù)到正常水平(P=0.78)(圖2)。結(jié)果表明，注射dsGdhsp60 和dsGdhsp70均能夠顯著降低沙蔥螢葉甲幼蟲(chóng)體內(nèi)相應(yīng)靶標(biāo)基因的表達(dá)水平。

圖2 顯微注射dsRNA后沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)中GdHsp60(A)和GdHsp70(B)的相對(duì)表達(dá)量Fig. 2 Relative expression levels of GdHsp60 (A) and GdHsp70 (B) in the 2nd instar larvaeof Galeruca daurica after microinjection with dsRNA

2.3 GdHsp60和GdHsp70沉默對(duì)沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)過(guò)冷卻點(diǎn)與結(jié)冰點(diǎn)的影響

沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)在注射dsGdHsp60和dsGdHsp70 24 h后，其過(guò)冷卻點(diǎn)與結(jié)冰點(diǎn)均顯著升高(P<0.05)(圖3: A, B)。 注射dsGFP后蟲(chóng)體過(guò)冷卻點(diǎn)與結(jié)冰點(diǎn)分別為-14.71±0.11℃和-13.94±0.90℃，與空白對(duì)照相比均無(wú)顯著性變化(P>0.05)。注射dsGdHsp60后蟲(chóng)體過(guò)冷卻點(diǎn)與結(jié)冰點(diǎn)分別為-10.56±0.42℃和-7.66±0.56℃，與對(duì)照相比顯著升高(P<0.001) (圖3: A, B)；注射dsGdHsp70后蟲(chóng)體過(guò)冷卻點(diǎn)與結(jié)冰點(diǎn)分別為-9.08±0.23℃和-6.09±0.28℃，與對(duì)照相比顯著升高(P<0.001)(圖3: A, B)；同時(shí)，注射dsGdHsp60和dsGdHsp70 24 h后過(guò)冷卻點(diǎn)和結(jié)冰點(diǎn)也存在顯著差異(P<0.05) (圖3: A, B)。

圖3 通過(guò)顯微注射法分別對(duì)GdHsp60和GdHsp70進(jìn)行RNAi 24 h后沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)的過(guò)冷卻點(diǎn)(A)和結(jié)冰點(diǎn)(B)Fig. 3 Super-cooling points (A) and freezing points (B) of the 2nd instar larvae of Galeruca dauricaafter RNAi of GdHsp60 and GdHsp70 by microinjection for 24 h圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=25)，柱上字母表示不同處理存在顯著性差異(P<0.05, ANOVA, LSD)。圖4同。Data in the figure are mean±SE (n=25). Letters above bars indicate significant differences among different treatments (P<0.05) by ANOVA, LSD. The same for Fig. 4.

2.4 GdHsp60和GdHsp70沉默對(duì)沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)Ltime50和Ltemp50的影響

為驗(yàn)證分別沉默GdHsp60和GdHsp70后是否降低了沙蔥螢葉甲幼蟲(chóng)的抗寒能力，室內(nèi)測(cè)定了沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)在注射dsRNA后在不同低溫處理下的存活率。結(jié)果表明(圖4: A)，低溫處理2 h后幼蟲(chóng)低溫存活率隨處理溫度的降低呈顯著下降趨勢(shì)(CK:F5.29=247.98,P<0.001; 注射dsGFP:F5.29=259.08,P<0.001; 注射dsGdHsp60:F5.29=192.02,P<0.001; 注射dsGdHsp70:F5.29=308.91,P<0.001)，除25℃常溫處理外，在各低溫處理下處理組存活率均顯著低于對(duì)照組CK和dsGFP(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組CK和dsGFP致死中溫度Ltemp50分別為：CK: -10.57(-10.98～-10.17)℃; dsGFP: -10.63(-11.03～-10.24)℃; dsGdHsp60: -8.33(-8.73～-7.91)℃和dsGdHsp70: -8.21(-8.62～-7.79)℃(表2)。各組幼蟲(chóng)在-5℃低溫處理不同時(shí)間，存活率存在極顯著差異(CK:F6.34=292.68,P<0.001; 注射dsGFP:F6.34=354.75,P<0.001; 注射dsGdHsp60:F6.34=474.07,P<0.001; 注射dsGdHsp70:F6.34=347.66,P<0.001)。與0 h低溫處理相比，dsGFP注射幼蟲(chóng)處理12 h后顯著下降(P<0.05)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各組存活率均逐漸降低；除低溫處理0 h外，-5℃處理不同時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，幼蟲(chóng)存活率均存在顯著差異(P<0.05)(圖4: B)。SPSS回歸分析(logistic regression)很好地描述了死亡率與處理時(shí)間的關(guān)系，經(jīng)計(jì)算在-5℃低溫處理下，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組CK和dsGFP半致死時(shí)間(Ltime50) 及95%置信區(qū)間分別為：CK: 87.92(79.18～96.87) h; dsGFP: 87.13(78.41～96.07) h; dsGdHsp60: 49.25(41.26～57.31) h; dsGdHsp70: 52.21(44.18～60.22) h(表3)，這說(shuō)明沉默GdHsp60和GdHsp70均會(huì)降低幼蟲(chóng)在短時(shí)間對(duì)極端低溫的耐受能力。

表2 通過(guò)顯微注射法分別對(duì)GdHsp60和GdHsp70進(jìn)行RNAi 24 h后沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)的致死溫度Table 2 Lethal temperature (Ltemp) for the 2nd instar larvae of Galeruca dauricaafter RNAi of GdHsp60 and GdHsp70 by microinjection for 24 h

圖4 通過(guò)顯微注射法分別對(duì)GdHsp60和GdHsp70進(jìn)行RNAi 24 h后沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)在不同低溫下處理2 h(A)和-5℃處理不同時(shí)間(B)的存活率Fig. 4 Survival rates of the 2nd instar larvae of Galerucadaurica exposed to different low temperatures for 2 h (A)and -5℃ for different time (B) after RNAi of GdHsp60and GdHsp70 by microinjection for 24 h

3 討論

RNAi常用的導(dǎo)入方法有注射法、浸泡法、飼喂法和轉(zhuǎn)基因法等，其對(duì)靶標(biāo)基因的沉默效率與dsRNA導(dǎo)入方法、靶基因 RNAi作用區(qū)域選擇、dsRNA長(zhǎng)度、濃度以及dsRNA溶劑的選擇都密切相關(guān)(Wangetal., 2016; Perkinetal., 2017)。根據(jù)沙蔥螢葉甲的生物學(xué)特性，我們選取保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物并采用飼喂法和顯微注射法進(jìn)行RNA干擾。飼喂dsGdHsp60和dsGdHsp70均能夠有效降低沙蔥螢葉甲1和2齡幼蟲(chóng)體內(nèi)靶標(biāo)基因的表達(dá)水平(圖1)， 由于不同個(gè)體取食能力的差異， 以及dsRNA通過(guò)昆蟲(chóng)腸道時(shí)可能會(huì)發(fā)生一定程度的降解等原因，飼喂法干擾效率較注射法低。通過(guò)顯微注射法導(dǎo)入dsRNA后，12～48 hGdHsp60和GdHsp70基因沉默現(xiàn)象持續(xù)出現(xiàn)，并呈現(xiàn)出了顯著的時(shí)間效應(yīng)(圖2)。這在其他昆蟲(chóng)研究中也有類(lèi)似的現(xiàn)象，史學(xué)凱等(2017)通過(guò)分析不同RNAi方法對(duì)飛蝗Locusta應(yīng)用SPSS回歸分析擬合出死亡率與時(shí)間、溫度的關(guān)系變化曲線。SPSS (logistic regression) was used to fit the curve of mortality with time and temperature, respectively. 表3同The same for Table 3.

表3 通過(guò)顯微注射方法分別對(duì)GdHsp60和GdHsp70進(jìn)行RNAi 24 h后-5℃低溫對(duì)沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)的致死時(shí)間Table 3 Lethal time (Ltime) of low temperature of -5℃ to the 2nd instar larvae of Galeruca dauricaafter RNAi of GdHsp60 and GdHsp70 by microinjection for 24 h

migratoria觸角高表達(dá)基因的沉默效率，發(fā)現(xiàn)飛蝗觸角浸泡法和涂抹法干擾LmCYP3117C1沒(méi)有顯著效果，腹部注射法對(duì)飛蝗觸角LmCYP3117Cl的沉默效率較低，觸角窩注射法可以高效沉默LmCYP3117C1。賈浩康等(2019)利用RNAi技術(shù)沉默白背飛虱Sogatellafurcifera3齡若蟲(chóng)的MCO4基因，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)顯微注射法可以成功沉默白背飛虱的MCO4基因，沉默效率遠(yuǎn)高于飼喂法。但在柳藍(lán)葉甲Plagioderaversicolora幼蟲(chóng)RNAi實(shí)驗(yàn)中，飼喂dsSrp54k的非無(wú)菌幼蟲(chóng)比注射dsSrp54k的幼蟲(chóng)有更高的死亡率和腸道細(xì)菌增量，認(rèn)為dsSrp54k分子被柳藍(lán)葉甲取食后可間接引起腸道菌群紊亂，提高了葉甲的死亡率(Xuetal., 2021)。盡管沙蔥螢葉幼蟲(chóng)取食dsGdHsp60和dsGdHsp70后體內(nèi)的分子機(jī)制尚未探明，但基于使用兩種RNAi方法后干擾效率及穩(wěn)定性的比較，對(duì)于沙蔥螢葉幼蟲(chóng)RNAi實(shí)驗(yàn)，注射法較優(yōu)。

熱激蛋白作為高度保守的分子伴侶，有助于提高生物對(duì)逆境的耐受性(Lietal., 2018)，增強(qiáng)其在惡劣環(huán)境條件下的生存和適應(yīng)能力，在生物對(duì)各種環(huán)境脅迫的應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用(Luetal., 2017)。前期發(fā)現(xiàn)GdHsp70基因在沙蔥螢葉甲的生長(zhǎng)發(fā)育和高低溫脅迫響應(yīng)中都有重要作用(譚瑤等, 2017)；而冷、熱脅迫均可誘導(dǎo)沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)GdHsp10和GdHsp60的mRNA表達(dá)(Tanetal., 2018)。盡管很多研究報(bào)道了昆蟲(chóng)熱激蛋白響應(yīng)低溫脅迫或冷馴化，但其介導(dǎo)昆蟲(chóng)抗寒性功能的深入研究卻鮮有報(bào)道。過(guò)冷卻是指植物或昆蟲(chóng)的組織液可以承受0℃以下的低溫而不結(jié)冰的現(xiàn)象(Andreadis and Athanassiou, 2017)，這是昆蟲(chóng)抵御低溫而存活的方式之一(岳雷等, 2013; Andreadis and Athanassiou, 2017; Niuetal., 2020)，過(guò)冷卻點(diǎn)則是衡量昆蟲(chóng)抗寒性的重要指標(biāo)。過(guò)冷卻現(xiàn)象及過(guò)冷卻點(diǎn)的測(cè)定在許多昆蟲(chóng)的諸多蟲(chóng)態(tài)中都有研究報(bào)道(黃聰?shù)? 2014; Fengetal., 2016; Mohammadzadeh and Izadi, 2018; 許向利等, 2020)，我們前期研究表明沙蔥螢葉甲不同發(fā)育階段的過(guò)冷卻點(diǎn)均存在顯著差異，過(guò)冷卻點(diǎn)由低到高的發(fā)育階段依次是卵、1齡幼蟲(chóng)、2齡幼蟲(chóng)、蛹、3齡幼蟲(chóng)及成蟲(chóng)(李浩等, 2014)。本研究通過(guò)對(duì)注射dsGdHsp60和dsGdHsp70后的沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)測(cè)定過(guò)冷卻點(diǎn)和結(jié)冰點(diǎn)，結(jié)果顯示均顯著高于對(duì)照(圖3)，說(shuō)明通過(guò)干擾GdHsp60和GdHsp70的表達(dá)確實(shí)可以降低沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)對(duì)寒冷的耐受性。對(duì)GdHsp60和GdHsp70基因干擾后的沙蔥螢葉甲2齡幼蟲(chóng)進(jìn)行低溫處理，通過(guò)計(jì)算Ltemp50和Ltime50可以系統(tǒng)量化和表征致死溫度、暴露時(shí)間和低溫存活率之間的關(guān)系。結(jié)果顯示RNAi分別干擾兩個(gè)基因后實(shí)驗(yàn)組Ltemp50顯著升高(表2)，而Ltime50均顯著低于對(duì)照組(表3)，進(jìn)一步表明分別干擾兩個(gè)熱激蛋白基因的表達(dá)均可降低沙蔥螢葉甲幼蟲(chóng)的抗寒性。同時(shí)，對(duì)比結(jié)果可以看出GdHsp70基因被干擾后可能對(duì)沙蔥螢葉甲幼蟲(chóng)的抗寒性影響更大，注射dsGdHsp60和dsGdHsp70 24 h后過(guò)冷卻點(diǎn)、結(jié)冰點(diǎn)存在顯著性差異，但是對(duì)2齡幼蟲(chóng)Ltime50和Ltemp50的影響不存在顯著差異，之后將進(jìn)一步驗(yàn)證兩個(gè)基因之間抗寒功能的相關(guān)性和差異。

本研究通過(guò)不同方法導(dǎo)入靶向dsRNA檢測(cè)基因表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)與飼喂法相比，采用顯微注射法將dsRNA導(dǎo)入沙蔥螢葉甲幼蟲(chóng)體內(nèi)，對(duì)GdHsp60和GdHsp70基因表達(dá)有更強(qiáng)的干擾效果，可作為開(kāi)展沙蔥螢葉甲幼蟲(chóng)RNAi的主要干擾方法。隨后對(duì)目標(biāo)基因沉默后的幼蟲(chóng)進(jìn)行了過(guò)冷卻點(diǎn)、結(jié)冰點(diǎn)、Ltemp50及Ltime50的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)分別干擾兩個(gè)熱激蛋白基因顯著降低了抗寒能力。本文首次通過(guò)RNAi實(shí)驗(yàn)研究沙蔥螢葉甲Hsp相關(guān)基因的抗寒性功能，這對(duì)深入探索昆蟲(chóng)抗寒性的分子機(jī)制有重要參考價(jià)值，也為采用RNAi進(jìn)行沙蔥螢葉甲的防控提供潛在的新靶標(biāo)。