聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料水解酶結構、功能及改造

李志帥，高 健，陳純琪，郭瑞庭，劉衛(wèi)東,3，韓 旭

(1.中國科學院 天津工業(yè)生物技術研究所 工業(yè)酶國家工程實驗室，天津 300308；2.中國科學院大學，北京 100049；3.國家合成生物技術創(chuàng)新中心，天津 300308；4.湖北大學 生命科學學院 省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室，湖北 武漢 430062)

聚酯類塑料聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)由對苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)通過酯鍵連接而成。它是一種半結晶熱塑性塑料，由均勻堆積的結晶區(qū)和隨機排列的非晶區(qū)組成[1]。PET的合成技術在1941年首次被申請專利，并于20世紀50年代初開始商業(yè)化[2]，作為紡織工業(yè)的合成聚酯織物以及食品和飲料的包裝材料，PET已成為最重要的大規(guī)模生產的石化塑料之一[3]，大多數(shù)PET制品有較高的結晶度，具有抵抗力學和化學應力的耐久性[4]。石油基塑料制品的大規(guī)模生產、大規(guī)模消費和廢棄物管理不當所造成的氣候變化和環(huán)境污染讓人類社會面臨前所未有的挑戰(zhàn)[5-8]。近年來，利用生物技術進行塑料廢棄物的回收利用已成為一個蓬勃發(fā)展的研究領域，許多研究人員對PET塑料降解酶進行結構解析、功能以及酶工程改造研究，獲得了一些有潛在應用價值的高效降解酶[9-10]，并利用相關酶進行了催化反應研究嘗試[11-13]，為將塑料廢棄物進入低碳再循環(huán)利用鋪平了道路。

1 PET塑料生物降解研究

早在20世紀70年代初，科學家開始研究塑料垃圾的生物降解[7,14-15]，人們曾認為熔點超過260 ℃的PET無法使用酶促解聚，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)某些來自真菌的酶可以在高結晶度的PET材料上誘導表面改性[16]，如，來自絲狀放線菌(Thermobifidafusca)的角質酶TfH(Thermobifidafuscahydrolase)，孵育3周后能讓PET瓶(10%結晶度)的質量損失大于50%[17]。隨著近幾年對降解酶的進一步研究，TfH水解PET的活性已經被提高了一個數(shù)量級以上[18]。利用宏基因組方法鑒定出來的葉枝堆肥角質酶LCC[19]也是近期研究的熱點，目前獲得的最好突變體可在10 h內以工業(yè)規(guī)模快速解聚非晶化PET廢物，回收的單體可用于合成相關聚合物，從而將廢棄物進入低碳再循環(huán)利用。近期，受關注較多的是PET降解菌Ideonellasakaiensis201-F6[20]，它能以PET為主要能量和唯一碳源，在30 ℃能將PET分解成小片段——單(2-羥乙基)對苯二甲酸(MHET)，再將分解后的產物運入體內進一步經過IsMHETase(MHET降解酶)水解，最終轉化為TPA和EG，它們的催化反應見圖1。IsPETase和其他具有PET降解活性的酯酶或脂肪酶序列同源性較高，但它在30 ℃下水解PET的活性比其他酯酶或脂肪酶高5.5～120倍[21]。目前已知的催化PET水解酶大多屬于α/β-水解酶家族[22]，α/β-水解酶根據(jù)形成氧陰離子孔的氨基酸不同，可以分為GX型和GGGX型以及Y型[23]，現(xiàn)有的IsPETase等PET降解酶都屬于GX型[24]。

圖1 Ideonella sakaiensis 201-F6 中關鍵PET降解酶的反應

2 PET塑料降解酶的結構

由于酯鍵在天然生物分子(如角質和亞角質)中普遍存在，所以角質酶是尋找能解聚合成聚酯酶的起點，目前獲得的能降解PET塑料的酶也主要來源于能水解酯鍵的脂肪酶、角質酶以及水解酶三大類，已有超過60個PET塑料降解酶的晶體結構被發(fā)現(xiàn)，詳見表1。

表1 現(xiàn)有PET塑料降解酶結構

將這些不同來源的PET塑料降解酶的序列通過MEGA 11.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2(a)，大部分PET塑料降解酶同源性較為接近。圖2(b)展示了不同來源的PET塑料降解酶單體結構重疊比對，可以發(fā)現(xiàn)它們的整體結構折疊基本相同。將這些PET塑料降解酶和來自Streptemycesefoliatus的脂肪酶(PDB：1JFR)進行主鏈均方根(RMSD[55])比較，可以發(fā)現(xiàn)所有比值均低于0.07 nm(表2)，表明它們的主鏈結構一致性很高。這些PET水解酶表現(xiàn)出保守的結構特性，并且可以分類為單個亞類，第一個獲得晶體結構的是鏈霉菌來源的脂肪酶(PDB：1JFR)，該酶比聚酯水解真菌角質酶(EC 3.1.1.74)有更短的肽鏈和更緊湊的結構[56]。

表2 不同PET降解酶主鏈結構比對

1JFR—灰色；7EC8—黃橙色；3VIS—綠色；4CG2—青色；6THT—洋紅；4WFI—黃色；5LUI—橙色；7DS7—深藍色；5XH3—淺色；6SBN—熱粉色；7DZT—紫羅蘭紫色；7NEI—藍白色

3 PET塑料降解酶的催化機制

自從2017年首個IsPETase的晶體結構報道以來[39]，有許多不同研究組都報道了IsPETase的晶體結構[40-51]，對IsPETase結構研究也是PET水解酶里面研究得最多的[57]。IsPETase由261個氨基酸組成(圖3(a))，屬于典型的α/β-水解酶折疊類結構域，結構中有9個β-折疊，外圍有7個α-螺旋，具有保守的催化三聯(lián)體S131-H208-D177和氧陰離子洞穴(Y58、M132)，S131作為親核試劑和H208、D177形成電荷中繼網絡(圖3(b))，PET塑料降解酶可能的催化機制見圖3(c)。

IsPETase具有不同于其他PET水解酶的獨特結構。它有2個分子內二硫鍵：DS1(C174-C210)和DS2(C244-C260)。序列比對后發(fā)現(xiàn)，DS2是這類水解酶共有的，它連接C末端和最后一段loop區(qū)，遠離催化活性中心，所以DS2不直接參與水解，主要與酶結構的完整性相關。DS1是IsPETase特有的二硫鍵結構，臨近催化中心，對催化活性和催化位點的完整性至關重要，分子動力學模擬證明DS1與活性位點的柔韌性相關，將其突變后會使催化三聯(lián)體不穩(wěn)定，從而導致酶活性幾乎完全喪失[41](圖3(a))。IsPETase底物結合區(qū)的1個氨基酸W156側鏈具有A、B和C這3種構型(圖3(b))，底物結合之后，W156側鏈被固定為B構型，并為底物的結合提供重要的作用力，W156位點的色氨酸在所有類似酶中是保守的，在其他類似酶中W156側鏈一般為C構型，但這種C構型并不利于底物PET結合，所以其他類似酶對PET的降解活力較低。進一步分析發(fā)現(xiàn)，IsPETase中的W156側鏈能夠擺動是因為其鄰近的第185位絲氨酸(S185)，而在其他活力較低的類似酶中都是組氨酸，組氨酸與W156之間的堆疊作用力將W156的側鏈固定在了C構型，所以將IsPETase的S185突變成為組氨酸后，酶對PET的水解效率顯著降低[39]。IsPETase特有的結構可以維持它對PET較高活性和結構穩(wěn)定性，一旦將催化三聯(lián)體中的絲氨酸突變成丙氨酸后，活性完全喪失[40,42,58]；如果破壞其二硫鍵DS1會導致活性降低，Tm值下降10 ℃，表明IsPETase特有的二硫鍵結構對活性和穩(wěn)定性都至關重要。若將氧陰離子洞穴中的氨基酸Y58突變后再結合不同底物(PET膜、PET瓶子和BHET單體)發(fā)現(xiàn)，酶活性降低[47]；氧陰離子洞穴的另一個氨基酸M132突變成其他氨基酸后同樣會引起酶活性的降低；擺動的W156替換成丙氨酸后也會引起活性的顯著降低[42,45]。

圖3 IsPETase的晶體結構及催化機制

4 PET塑料降解酶的分子改造

一般認為，PET水解酶的催化中心在與芳香族底物結合后會發(fā)生局部動態(tài)變化，所以在獲得酶的結構后，許多研究工作都集中在活性區(qū)域。IsPETase中擺動的W156，在許多其他已知的PET水解酶中也是保守的，該殘基的取代通常導致對PET的水解活性顯著降低，Chen等[50]發(fā)現(xiàn)S185和I189獨特地存在于IsPETase中，可以減少W156的空間位阻(圖4)，因此使吲哚側鏈具有更高的柔韌性，以提高聚合物的水解速率。在同源的聚酯水解酶中引入相應的雙殘基取代可提高PET水解活性。底物結合區(qū)附近的氨基酸也會影響酶活性，將IsPETase的I179、W130和T59分別突變?yōu)楸彼岷蟀l(fā)現(xiàn)，酶活性顯著降低，說明這些氨基酸對催化很重要[39-40]。他們對底物結合位點Ⅱ區(qū)的氨基酸也進行了突變(圖4)后發(fā)現(xiàn)，S209A和N212A突變的酶活性顯著降低。Son等[44]研究發(fā)現(xiàn)，P152A突變導致酶在30和40 ℃下活性降低，但Tm比野生型IsPETase的高0.5 ℃，解析IsPETaseP152A的結構(PDB：6IJ5)發(fā)現(xiàn)催化位點D177從H208殘基轉移開，證實突變導致催化位點塌陷[44]。將IsPETase結合位點變?yōu)楦窠琴|酶的活性位點(S209F/W130H)，突變體的活性提高了1～2倍，F(xiàn)209可能是通過芳香族相互作用來穩(wěn)定底物和活性部位[42]。

由于PET降解酶降解的是高聚長鏈化合物，所以PET降解酶中離活性中心略遠的氨基酸殘基也可能影響催化作用，或與蛋白表面其他的氨基酸殘基有相互作用，但這需要通過了解長鏈PET特定的結合構象才能確定。靠近目標酯鍵的長鏈聚合物需要足夠的空間，才能通過催化位點絲氨酸的初始親核攻擊形成四面體的催化中間體[59]。迄今為止，并沒有長鏈底物的復合物結構被解析，僅僅有很少的PET水解酶和產物單體類似物復合體結構被研究，所以Joo等[40]利用分子對接以及分子動力學模擬等方法來研究結合口袋中底物和催化三聯(lián)體的作用。他們通過對較長底物2-HE(MHET)與IsPETase的對接實驗，推測了長鏈底物在酶表面可能的結合位置，較長的分子在酶表面通過疏水作用形成一個約4 nm的長且淺的L形裂縫，結合位點分為2個亞位點，亞位點I結合1個MHET，結合位點Ⅱ結合3個MHET。結構分析發(fā)現(xiàn)，距離催化中心約2.3 nm的R251在底物結合位點Ⅱ區(qū)(圖4)，呈現(xiàn)突出狀，影響底物PET的結合。如果將R251突變成丙氨酸后，突變酶18和36 h對PET膜的活性比野生型對PET膜的活性分別提高了22.4%和32.4%；由所得到的蛋白結構(PDB：5YNS)發(fā)現(xiàn)丙氨酸提供了一個疏水且不突出的裂縫，由此可見，遠離活性部位的關鍵結構變化可能會影響酶的活性[24,44]。IsPETase比同源的角質酶和酯酶具有更開放的活性位點裂縫，通過改造還可以降解另一種新興的生物衍生PET替代品，聚乙烯-2,5-呋喃二甲酸酯(PEF)[58]。IsPETase突變體S64M、W130F和N212F可以提高萘酯降解性能，對它們的結構分析發(fā)現(xiàn)，這些突變改變了疏水性，降低了酶特異性的空間效應[43]。已報道的基于IsPETase結構的關鍵改造位點如圖4所示，大部分改造都集中于底物結合的Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)，許多有益突變位于帶正電荷的Ⅱ區(qū)[27]，說明Ⅱ區(qū)與底物的結合有關。

圖4 IsPETase中已知的關鍵改造位點

PET材料自身較高的玻璃化轉變溫度要求水解酶具有較高的熱穩(wěn)定性[43]，因此在解聚中使用嗜熱且熱穩(wěn)定性良好的酶有明顯的優(yōu)勢[10]。野生型IsPETase的熔融溫度(Tm)為48.81 ℃[47]，但其在環(huán)境溫度下具有較高的PET水解活性，這可能是由于其更靈活和開放的底物結合裂縫所致[58]。所以許多研究者通過酶工程對IsPETase進行改造來提高其熱穩(wěn)定性[43]，在二價離子(如Ca2+或Mg2+)存在下，許多細菌來源的PET水解酶的整體熱穩(wěn)定性得到改善，Tm增加10～16 ℃，或最適溫度提高10 ℃?；诠步Y晶結構和分子動力學模擬，Baker等[60]發(fā)現(xiàn)Ca2+結合位點可能接近催化三聯(lián)體，并且通過與Ca2+的相互作用來控制底物結合過程，活性位點會存在打開和關閉的狀態(tài)，由于反應過程中Ca2+會和苯二甲酸酯產生不溶性副產物[60]，所以不能完全依賴鈣鹽來實現(xiàn)工業(yè)級高降解效率，但可通過定制生物催化劑使Ca2+結合位點最小化，如通過鹽橋或二硫鍵取代一個主要的Ca2+結合位點，如來自Thermobifidafusca的TfCut2，按此方法獲得的突變體Tm提高了25 ℃，并通過蛋白質晶體學驗證了二硫鍵的形成[61-62]。在另外一個PET塑料降解酶PET2中，也用同樣策略引入并確證了二硫鍵的存在，但Tm僅僅提高了3.1 ℃[27]。通過與熱穩(wěn)定性較高的TfCut2等酶結構的比較發(fā)現(xiàn)，改造獲得IsPETaseS92D/D157H雙突變體的Tm比野生型提高了8 ℃[47]，這些氨基酸可能形成額外的氫鍵來提高β6～β7連接環(huán)的穩(wěn)定性，在40 ℃下，24和72 h的催化活性分別提高4.7和6.0倍。研究者將這些發(fā)現(xiàn)相結合，設計了2個三重突變體S92D/D157H/R251A和S92E/D157H/R251A，2個突變體的Tm值分別為56.41和57.62 ℃，比野生型IsPETase的提高了7.60和8.81 ℃，2個突變體的活性也比野生型的有所提高，在30 ℃下24和72 h的酶活性分別提高了4.3和5.2倍，在40 ℃下24和72 h的酶活性分別增加了9.1和13.9倍。但四突變體S92E/D157H/N217D/251A的酶活性和熱穩(wěn)定性都降低。另一個四突變體S92E/D157H/S213T/N217D(PDB：6KUS)的酶活性和Tm都高于IsPETase的，37 ℃下酶活性是野生型的58倍[47]?；贗sPETase結構改造獲得的突變體ThermoPETase(92E/D157H/R251A)，40 ℃下活性也提高了14倍，Tm比野生型的提高8.8 ℃[44]。

除了上述基于酶結構的改造外，近期比較受關注的其他技術，如人工智能和機器學習等技術，也被用于PET塑料降解酶的改造?；谪澙贩e累策略方法獲得的DuraPETase是具有10個氨基酸突變的IsPETase突變體(A185H/I139R/W130H/S159Q/R251A/A151I/G136A/Q80Y/L88F/T111D)，比野生型IsPETase的Tm大幅度增加(達31 ℃)，對高結晶度PET粉末水解活性也超過了300倍[48]。通過基于機器學習并應用卷積神經網絡訓練穩(wěn)定性優(yōu)化，獲得DuraPETase+N204K突變體，Tm進一步提高至83.5 ℃，是目前Tm最高的IsPETase突變體[63]。

定向進化也被用于塑料降解酶性能的提升，通過篩選基于易錯PCR的隨機IsPETase文庫，對超過13 000個IsPETase的突變體進行評估，將高溫下的催化活性作為主要選擇指標，與野生型IsPETase相比，獲得了21個突變的HotPETase變體(ThermoPETase+N204C/S253C/P152V/S178R/S185Y/Q90K/S184E/R61T/Q153M/N183K/R195L/S29A/S32V/K66N/M125G/N212C/K223M/T241Q)，Tm則提高至82.5 ℃[64]?；贛eng等[65]開發(fā)的自然序列進化的突變設計工具Premuse，篩選到了穩(wěn)定性較高的IsPETase突變體W130H/F200Y，雙突變體在40 ℃下24 h降解無定形PET膜片的效率比野生型的提高了近40倍。

不同表達系統(tǒng)表達出的酶，因為后續(xù)翻譯修飾系統(tǒng)不同，對酶的性能也可能會產生影響，當PET水解酶在除大腸桿菌以外的宿主(例如枯草芽孢桿菌或巴斯德畢赤酵母)中表達時，熱穩(wěn)定性也有可能增強，如LCC分別在枯草芽孢桿菌和巴斯德畢赤酵母中表達，糖基化程度增加，Tm比在大腸桿菌中表達分別增加了4和12 ℃[66]。在畢赤酵母中表達的IsPETase活性可以提高36倍[67]。除了Pseudomonasputida、Escherichiacoli和Pichiapastoris等底盤之外，Ideonellasakaiensis也成為新興的可用作基因工程底盤的菌株[68]。光合微藻(Phaeodactylumtricornutum)也被設計用于功能性表達IsPETase，并能夠在21～30 ℃的咸水環(huán)境中降解選定的PET相關材料，是受PET微塑料污染海水的潛在生物修復載體[69]?？偨Y已報道的IsPETase的性能見表3。

表3 IsPETase突變體性能比較

5 PET塑料降解酶的催化過程強化

與天然聚合物降解酶(如纖維素酶)類似，酶促聚酯水解優(yōu)先發(fā)生在無定形部分，而不是良好有序的結晶區(qū)域[70]，特定的酶可以降低聚合物的結晶度，如在天然纖維素酶系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的使纖維素去結晶的酶[71]，特異性的聚合物結合模塊添加到反應混合物中或與適當?shù)慕到饷溉诤?，均有機會提升降解酶的活性。來自Cellulomonasfimi的纖維素結合結構域(CenA)和來自里氏木霉的纖維二糖水解酶I的纖維素結合結構域(CBM)[72]、來自糞產堿桿菌的PHA解聚酶的聚羥基鏈烷酸酯(PHA)結合模塊[73]、來自ChitinolyticbactermeiyuanensisSYBCH194的幾丁質酶CmChi1的幾丁質結合模塊和PET降解酶融合表達都能提高降解性能[74-75]。將來自白腐真菌Pycnoporuscoccineus(PcAA14A)的裂解多糖單加氧酶(LPMO)[76]和兩性離子聚合物(Ekylation，帶正電荷的賴氨酸和帶負電荷的谷氨酸)[77]加入IsPETase中，都可以提高酶對PET的降解性能，它們可能是通過與疏水蛋白或其他結合模塊不同的機制促進酶促降解。生物催化水解不能從根本上破壞有序的結晶PET[70]，但氧化酶可能具有與木質素、纖維素降解系統(tǒng)中已知的LPMO相同的功能，可以為聚酯去結晶度的開發(fā)提供進一步的選擇，具有酶促紡織品回收方面的應用潛力。

強化PET塑料降解酶的催化過程，還可以從解除反應底物抑制方面著手。對苯二甲酸單(2-羥乙基)酯(MHET)和對苯二甲酸雙(2-羥乙基)酯(BHET)是PET降解的中間體，會抑制許多PET水解酶解聚催化的效率[78-81]。MHET具有強抑制作用，幾乎不能被野生型IsPETase水解酶水解，而Ideonellasakaiensis產生獨特的IsMHETase水解MHET，產生TPA和EG[20]，這2種不同酶類(IsPETase和IsMHETase)可以串聯(lián)起來進行聚合物降解，有助于它們在PET廢棄物有效生物循環(huán)中的應用。Knott等[82]建立了一種嵌合雙酶系統(tǒng)，將IsPETase和IsMHETase連接，使得PET降解效率提高至少2.8倍；并鑒定了來自Comamonasthiooxydans和Hydrogenophagasp.PML113116的具有MHETase酶類似的結構[82]，但它們對MHET的底物親和力顯著低于IsMHETase。目前對這些技術瓶頸，提出了其他技術解決方案，例如使用不易受產物抑制的酶突變體[83]或用能滲透去除抑制劑的膜反應器。這種催化特性可以和其他解聚酶的特性進行組合，用于基于全細胞的多種酶系統(tǒng)[84]，以達到PET生物降解的目的。

6 結論與展望

在過去二十年中，PET的生物催化降解已從數(shù)周培養(yǎng)后有微量釋放的單體發(fā)展到數(shù)小時內完成高效的塑料解聚，科學家們已經成功地鑒定和制造了符合工業(yè)和商業(yè)規(guī)模的PET廢棄物解聚需求的生物催化劑[85]。未來可以利用生物催化劑降解塑料PET生成單體TPA和EG，然后利用產物TPA重新合成PET塑料，實現(xiàn)PET塑料的綠色循環(huán)利用。但如何高效回收TPA單體，將其循環(huán)利用生成高價值的PET再生塑料，仍是PET生物降解回收的瓶頸問題。由于大規(guī)模測序數(shù)據(jù)的持續(xù)增長，可從基因組和宏基因組數(shù)據(jù)庫中探索其他新型PET水解酶[86]，更多的PET水解酶序列數(shù)據(jù)被挖掘。通過機器學習和祖先序列重建，探索的序列空間也可用于預測具有改進特性的酶。強大的基于序列的方法和全自動計算工作流程設計軟件如FireProtASR等[87]，可以幫助研究人員通過數(shù)據(jù)庫搜索確定更多的PET水解酶。未來的研究主要在于拓展對PET生物降解的理解，以應對與其他塑料(如聚烯烴)或更類似的塑料(如聚酰胺(PA)和聚氨酯(PUR))與可水解骨架的生物技術降解相關的挑戰(zhàn)。這些廢棄物不能通過工業(yè)規(guī)模的其他處理方法有效回收，而新型生物催化劑的組合可以為未分類的混合塑料廢棄物的可循環(huán)利用鋪平道路。