不可降解塑料的全細(xì)胞催化降解及升級再造

顏 飛，董維亮，崔 球，劉亞君

(1.中國科學(xué)院 青島生物能源與過程研究所，中國 青島 266101；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

塑料是一種以高分子聚合物為主要成分的材料，具有化學(xué)穩(wěn)定性好、絕緣性強(qiáng)、生物安全性高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于包裝材料和紡織制造等多個領(lǐng)域[1]。自1950年以來，人類生產(chǎn)的塑料總和已經(jīng)超過了83億t，其中90%的塑料為石油基不可降解塑料。塑料的長期大規(guī)模使用也帶來了塑料垃圾污染問題，即使是回收率相對較高的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)類塑料，其收集、分類、回收以及轉(zhuǎn)化等各個環(huán)節(jié)還存在明顯的技術(shù)障礙[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前有79%的塑料垃圾未得到有效處理而進(jìn)入環(huán)境中[3]。塑料物理化學(xué)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性成了“雙刃劍”，使其在自然環(huán)境下難以分解，造成了長期的生態(tài)問題[4]。

2021年2月9日，國家機(jī)關(guān)事務(wù)管理局辦公室、住房和城鄉(xiāng)建設(shè)部辦公廳、國家發(fā)展和改革委員會辦公廳三部門發(fā)布《關(guān)于做好公共機(jī)構(gòu)生活垃圾分類近期重點(diǎn)工作的通知》，明確提出，到2021年底前，公共機(jī)構(gòu)全面停止使用不可降解一次性塑料制品，對不可降解材料明確定義為聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、乙烯-醋酸乙烯以及PET等非生物降解高分子材料(表1)，且這些材料與聚乳酸、聚對苯二甲酸-己二酸丁二醇酯等可降解塑料混合制成的塑料產(chǎn)品也納入“不可降解”的范圍?？梢姡瑢?shí)現(xiàn)不可降解塑料的高效、綠色降解及回收利用，進(jìn)而形成塑料垃圾的處理方案已成為亟待解決的問題。不可降解塑料的有效降解和再造不僅可以解決日益嚴(yán)峻的塑料污染問題，而且更可以有效減少對石油資源的依賴和消耗，符合我國“雙碳戰(zhàn)略”目標(biāo)的發(fā)展要求。

表1 廣泛應(yīng)用的不可降解塑料

塑料廢棄物傳統(tǒng)的處理方法包括物理法(填埋法)和化學(xué)法(焚燒法)。填埋法存在占用土地、破壞土壤結(jié)構(gòu)、影響植物生長和污染地下水等問題[5]。焚燒法會造成CH4、CO、SOx、總懸浮顆粒物(TSP)、NH3和揮發(fā)性有機(jī)物(VOCs)等污染物的大量排放，焚燒后產(chǎn)生的殘?jiān)€會造成重金屬二次污染[6]。與傳統(tǒng)的物理和化學(xué)法相比，生物法可以在較溫和的條件下處理塑料廢棄物，且不產(chǎn)生額外的污染物。

目前，研究最為廣泛的塑料生物降解體系是以聚酯塑料PET為底物、以水解酶為催化劑的酶解模式，主要采用將廢棄塑料降解為單體，然后循環(huán)利用單體再造新的塑料制品的閉環(huán)策略[7]。隨著越來越多塑料降解微生物和酶資源被挖掘，特別是自2016年Yoshida等[8]篩選到1株能夠天然降解并利用PET的大阪伊德氏桿菌(Ideonellasakaiensis)以來，采用全細(xì)胞催化的開環(huán)方法實(shí)現(xiàn)塑料降解和利用具有實(shí)際的可行性，已經(jīng)被廣泛研究并證實(shí)。這一策略是指通過降解底盤實(shí)現(xiàn)PET解聚到單體，集合高溫及多酶級聯(lián)降解優(yōu)勢，提高解聚效率、減少中間產(chǎn)物積累，再利用下游化學(xué)品生產(chǎn)底盤——微生物，以塑料單體為底物來生產(chǎn)不同的化學(xué)品，實(shí)現(xiàn)塑料廢棄物的高值化。這一路線將塑料作為有機(jī)碳源，通過生物法轉(zhuǎn)化為高值化學(xué)品，如聚羥基脂肪酸酯(PHA)，其產(chǎn)品包括但不限于塑料本身的重新合成和生產(chǎn)(圖1)。本文主要總結(jié)了目前針對不可降解塑料的全細(xì)胞催化降解體系的開發(fā)和研究進(jìn)展，總結(jié)和比較了塑料廢棄物的天然與人工全細(xì)胞降解方法，并討論“降塑再造一體化”的開環(huán)升級再造策略，以期為塑料廢棄物的研究與再利用提供參考。

BHET—對苯二甲酸雙(2-羥乙基)酯；MHET—對苯二甲酸單(2-羥乙基)酯

1 聚酯類與聚烯烴類塑料及其降解潛力

不可降解塑料可大體分為聚酯類塑料和聚烯烴類塑料兩大類。聚酯類塑料主要包括PET和聚氨酯(PUR)。PET由對苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)通過酯鍵連接而成,具有較好的穩(wěn)定性、溶劑耐受性、透明性等優(yōu)良性能，被廣泛應(yīng)用于電子電器、汽車工業(yè)、紡織制造和食品包裝等領(lǐng)域[9]。PUR全稱為聚氨基甲酸酯，是由各種異氰酸酯與多羥基化合物加聚而成的高分子化合物，主要包括聚酯型和聚醚型兩類。PUR的熱穩(wěn)定性和力學(xué)性能良好，被廣泛應(yīng)用于涂料、包裝材料和醫(yī)用材料等領(lǐng)域。

聚烯烴類塑料是碳-碳骨架塑料，包括PE、PP、PVC和PS等，沒有易被氧化和水解的基團(tuán)，其中，PE和PP是生產(chǎn)和應(yīng)用最廣泛的塑料種類。PE是乙烯的長鏈聚合物，它以高密度聚乙烯(HDPE)或低密度聚乙烯(LDPE)的形式存在，主要用于制造食品和日用品包裝等產(chǎn)品[6]。PP塑料耐沖擊、有彈性、耐腐蝕并且耐熱性和拉伸性能都較好，主要用于制造編織袋和電器的阻燃性零件。PVC是氯乙烯在引發(fā)劑作用下聚合而成的熱塑性樹脂，具有較好的電絕緣性，主要用于制造電纜和電線等產(chǎn)品的絕緣材料[7]。PS由苯乙烯單體組成，具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，可用于電子產(chǎn)品、汽車配件和玩具等產(chǎn)品的制造。

由于PET內(nèi)部是由酯鍵連接而成的，而自然界中存在著角質(zhì)、軟木脂、半纖維素和木質(zhì)素等含有酯鍵的天然聚合物及其相應(yīng)的降解體系，所以PET的生物降解與其他塑料相比更具可行性。Alisch等[10]最初使用天然的酯酶和脂肪酶來降解PET，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酯酶只能用來改善PET膜的表面親水性，這是因?yàn)橹久傅拇呋钚灾行母浇嬖凇吧w子”結(jié)構(gòu)，阻礙了聚酯鏈與酶的結(jié)合，所以PET水解效率較低[11]。隨后，研究人員從微生物中分離出具有PET降解活性的角質(zhì)酶[12]。因?yàn)榻琴|(zhì)酶的催化活性中心不存在“蓋子”結(jié)構(gòu)，有利于酶識別PET底物，所以角質(zhì)酶比其他酶表現(xiàn)出較高的PET降解能力。近年來，PET的生物降解研究在微生物和水解酶機(jī)制方面取得了顯著進(jìn)展，與其他塑料相比，PET的生物降解處于更高的技術(shù)就緒水平(technology readiness level，TRL)。2020年，法國CARBIOS公司宣布建立具有萬噸級處理能力的從PET酶法解聚到再生rPET的生產(chǎn)示范線，盡管其成本仍較高，但該技術(shù)的落地說明了生物法是未來循環(huán)經(jīng)濟(jì)模式下塑料降解和回收的綠色途徑。隨著更多的PET降解酶、PET天然降解菌被發(fā)現(xiàn)，以及水解酶的催化機(jī)制得到更詳細(xì)的闡明，PET降解工程酶和人工底盤也逐漸被報(bào)道[8,13-15]。

由于PUR材料的組成和結(jié)構(gòu)多樣，特別是含有的脲基、酯基、醚基以及丁二烯基等基團(tuán)差異較大，PUR塑料的降解比PET更有挑戰(zhàn)性。到目前為止，已經(jīng)篩選到能夠降解PUR的菌株，但總體來說，微生物資源依舊匱乏。不同于聚酯類塑料是由單體通過酯鍵或脲鍵聚合而成，PE和PP等聚烯烴類塑料主要由更為惰性的碳碳鍵(C—C)連接而成，因此其生物降解更為困難。盡管如此，國內(nèi)外科學(xué)家仍在昆蟲幼蟲的腸道[16]、土壤[17]及海洋垃圾中發(fā)現(xiàn)并分離了可以降解PE、PS等聚烯烴類塑料的微生物，這為聚烯烴的全細(xì)胞降解提供了可行的方案。

2 天然全細(xì)胞催化降解塑料的體系

2.1 PET塑料天然全細(xì)胞催化體系

PET是一種人工合成的芳香族聚酯，但其分子內(nèi)部由酯鍵連接而成，這就為PET的生物降解提供了可能。研究人員從堆肥、沉積物、土壤、廢水和活性污泥等環(huán)境樣品中篩選到多種PET降解微生物，主要包括腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)[18]、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、嗜熱子囊菌(Thermobifidafusca)[19-20]和綠色糖單孢菌(Saccharomonsporaviridis)[21]等。

Yoshida等[8]利用低結(jié)晶度(1.9%)的PET薄膜在含有PET廢棄物的廢水、土壤等環(huán)境中篩選PET降解微生物，最終發(fā)現(xiàn)1株細(xì)菌I.sakaiensis201-F6，該菌可以附著在PET表面形成生物膜，在30 ℃下反應(yīng)6周，幾乎完全降解60 mg PET底物。I.sakaiensis所產(chǎn)的PET水解酶(PETase)和單羥乙基對苯二甲酸酯水解酶(MHETase)可以協(xié)同降解PET為TPA和EG單體，其中PETase可能會黏附在PET表面以啟動其生物降解。此外，I.sakaiensis不僅能夠降解PET，還具有代謝PET降解單體的完整途徑，這種對PET的同化作用更有利于從環(huán)境中去除PET塑料廢棄物的污染，因此，I.sakaiensis在PET生物降解和生物修復(fù)方面均具有應(yīng)用潛力[22]。隨后，PETase特殊的結(jié)構(gòu)特征和PET降解機(jī)制也得到解析[23-24]。除此之外，通過蛋白質(zhì)工程改進(jìn)PETase和MHETase這2種酶的催化活性和熱穩(wěn)定性也成為目前的研究熱點(diǎn)。例如，Cui等[25]提出了新型蛋白質(zhì)穩(wěn)定性計(jì)算設(shè)計(jì)策略(GRAPE)，并基于計(jì)算機(jī)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)對PETase進(jìn)行了穩(wěn)定性改造，獲得了魯棒性顯著增強(qiáng)的從頭設(shè)計(jì)的酶。Knott等[26]利用不同長度的Linker構(gòu)建了PETase-MHETase嵌合酶體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與游離酶相比，嵌合酶體系的PET降解性能均有一定的提升。由于自然界中的微生物可以通過酶的協(xié)同作用高效降解“頑固”的天然聚合物，多酶協(xié)同系統(tǒng)也可能在未來的混合塑料降解中發(fā)揮出潛在優(yōu)勢。

除了I.sakaiensis外，最近還有其他天然PET降解細(xì)菌或真菌被分離和鑒定。例如，Liu等[27]在污泥中篩選到1株Delftia屬的WL-3菌株，該菌株可以在7 d內(nèi)將5 g/L對苯二甲酸二乙酯(DET)降解掉94%，并將其作為唯一碳源生長，具體過程：先通過2個酯鍵的水解將DET轉(zhuǎn)化為TPA，再將TPA轉(zhuǎn)化為原兒茶酸(PCA)并進(jìn)一步礦化。此外，菌株WL-3能夠在較寬的pH(6.0～9.0)和溫度(20～42 ℃)范圍內(nèi)穩(wěn)定降解DET，最適pH和溫度分別為7.0和30 ℃。將菌株WL-3與PET一起孵育 2個月后，使用掃描電鏡觀察PET薄膜表面和液體培養(yǎng)基中的變化后發(fā)現(xiàn)，菌株WL-3附著在PET表面并形成一層薄的生物膜，去除生物膜后，在PET薄膜表面觀察到明顯的凹坑和空洞。Da Costa等[28]從巴西瓜納巴拉灣河口分離到1株解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)，該酵母能夠降解PET并將其作為碳源合成自身物質(zhì)，而且PET降解過程的中間產(chǎn)物BHET是該酵母脂肪酶合成的最佳誘導(dǎo)劑，在250 r/min培養(yǎng)條件下添加BHET后酵母脂肪酶產(chǎn)量達(dá)到(385±5.8)U/L，比對照組增加了3倍。由于脂肪酶是工業(yè)領(lǐng)域的通用生物催化劑，解脂耶氏酵母在PET生物轉(zhuǎn)化方面顯示出巨大潛力。

截至目前，雖然已經(jīng)從自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了PET天然全細(xì)胞催化體系，但PET降解微生物資源依然不足，降解效率仍相對較低，還無法滿足大規(guī)模PET廢棄物處理的需求。一方面亟待開發(fā)針對性的環(huán)境微生物篩選和定向進(jìn)化方法。例如，近期Qiao等[29]提出了對PET降解微生物或酶進(jìn)行高通量篩選的熒光活化液滴分選技術(shù)(FADS)，并基于該技術(shù)從PET紡織廠的廢水中篩選到9種不同屬的PET降解微生物。FADS可廣泛用來從各種環(huán)境中發(fā)現(xiàn)新的PET降解微生物和酶，在PET降解微生物資源的挖掘方面顯示出巨大的潛力。然而，該方法目前還不能用于高溫條件下的酶或微生物的篩選，所以還需基于現(xiàn)有基礎(chǔ)對該技術(shù)進(jìn)一步升級和開發(fā)。拉曼激活細(xì)胞分選(RACS)作為一種無標(biāo)記、無損且高通量的單細(xì)胞分選技術(shù)，已經(jīng)廣泛用于胞內(nèi)大分子化合物合成水平的篩選，在PET降解微生物或酶的高通量篩選方面具有很大的應(yīng)用潛力[30-31]。另一方面，需要投入更多的努力，從這些微生物中尋找可以高效降解PET的酶，用于開發(fā)酶催化降解體系或人工全細(xì)胞降解體系。

2.2 PUR天然全細(xì)胞催化體系

PUR內(nèi)部由酯鍵或者脲鍵連接而成，因此可以利用微生物的脲酶、酯酶和蛋白酶來解聚[32]。目前發(fā)現(xiàn)的PUR降解的真菌主要是枝孢菌屬，而細(xì)菌主要以假單胞菌屬和芽孢桿菌屬為主。例如，Osman等[33]從固體廢棄物傾倒場分離出1種PUR降解真菌Aspergillussp.S45，它以線性聚酯型PUR膜為唯一碳源，在30 ℃反應(yīng)28 d后，PUR膜的質(zhì)量損失達(dá)15%～20%。Khan等[34]從土壤中分離出1種新型PUR降解真菌，并鑒定為塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)，該菌的菌絲體可以在聚酯型PUR材料上定植，并導(dǎo)致材料表面形貌發(fā)生變化，在室溫下的液體反應(yīng)體系中反應(yīng)2個月，可以降解約90%的PUR膜。Mathur等[35]從塑料垃圾堆放場的環(huán)境中分離出1株新的真菌Aspergillusflavus，它能夠利用聚酯型PUR作為唯一的碳源生長，該菌株與PUR材料共同孵育30 d后，PUR降解率達(dá)到60.6%。

目前，PUR降解微生物資源仍較為匱乏，而且已有的PUR降解微生物幾乎無法降解硬段氨基甲酸酯重復(fù)結(jié)構(gòu)單元。除此之外，PUR微生物降解機(jī)制和單體利用的代謝途徑也有待進(jìn)一步解析。

2.3 聚烯烴塑料的天然全細(xì)胞催化體系

聚烯烴類塑料化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，內(nèi)部主要由碳碳鍵—C—C—或者—C—H鍵構(gòu)成，其大分子量的長鏈結(jié)構(gòu)形成空間位阻，使其無法進(jìn)入微生物細(xì)胞。除此之外，聚烯烴類塑料具有高度疏水性，這降低了微生物和酶對底物的可及性，增加了塑料生物降解的難度[36]。目前，PE、PP和PS等聚烯烴類塑料的生物降解也已有相關(guān)的報(bào)道。

PE是產(chǎn)量最大和應(yīng)用范圍最廣的一類塑料，可分為高密度聚乙烯(HDPE)和低密度聚乙烯(LDPE)。目前已報(bào)道的PE生物降解研究主要以LDPE為底物。Yang等[16]發(fā)現(xiàn)印度谷螟(Indianmealmoths)幼蟲能夠嚙食LDPE，因此利用印度谷螟幼蟲降解LDPE后，在其腸道中分離出2種塑料降解細(xì)菌YT1和YP1，分別屬于阿氏腸桿菌(Enterobacterasburiae)和芽孢桿菌(Bacillussp.)，這2株菌與LDPE膜孵育28 d后，可以在LDPE表面形成生物膜，并且使LDPE膜的疏水性降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，YT1和YP1能夠在60 d內(nèi)分別降解約6.1%和10.7%的LDPE薄膜(初始100 mg)。Réjasse等[37]利用同位素標(biāo)記的HDPE喂食轉(zhuǎn)基因大蠟螟(Galleriamellonella)幼蟲，通過傅里葉變換紅外光譜技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在幼蟲組織中沒有出現(xiàn)生物同化現(xiàn)象，但在消化道中檢測到了微弱生物降解狀態(tài)的HDPE微塑料顆粒。該研究證明了該轉(zhuǎn)基因大蠟螟幼蟲可以降解HDPE，但無法真正地消化代謝HDPE。Paco等[38]利用海洋真菌Zalerionmaritimum對LDPE進(jìn)行降解，在14 d內(nèi)造成的質(zhì)量損失達(dá)56.7%。Harshvardhan等[39]以LDPE作為唯一碳源，篩選到能夠降解LDPE的細(xì)菌，其中，在30 d內(nèi)短小芽孢桿菌M27的LDPE降解率為1.5%、沼澤考克氏菌M16的LDPE降解率為1%、枯草芽孢桿菌H1584的LDPE降解率為1.75%。Gao等[40]自近海海洋垃圾中篩選到1株海洋真菌AlternariaalternataFB1，該真菌在PE塑料表面具有較強(qiáng)的定植能力，將菌株與LDPE薄膜一起孵育1個月左右，PE表面產(chǎn)生明顯的降解孔洞；結(jié)合X線衍射、凝膠滲透色譜、紅外光譜、高效液相色譜及質(zhì)譜等手段多方面證實(shí)了該真菌能夠有效降解PE，解聚效率高達(dá)95%。

除了PE之外，其他聚烯烴類塑料的降解微生物也有發(fā)現(xiàn)。Yang等[41]在黃粉蟲(Tenebriomolitor)幼蟲腸道中分離出1株具有PS降解能力的細(xì)菌Exiguobacteriumsp.，將其與PS一起孵育60 d后，PS的降解率為7.4%左右。另外，從土壤中分離到的微生物對于經(jīng)過熱處理[42]或紫外照射[17]的PP表現(xiàn)出一定的降解能力，對未經(jīng)處理的PP幾乎沒有降解能力，這說明預(yù)處理有助于提高PP的生物可降解效率。

此外，能夠同時(shí)降解多種塑料污染物的菌株或菌群也得到研究和分離。Luo等[43]分別利用PS、LDPE、聚酯型PUR作為唯一碳源喂養(yǎng)大麥蟲幼蟲35 d后，幼蟲對3種碳源的平均消耗率分別為1.41、0.30和0.74 mg/d。同時(shí)幼蟲腸道微生物群落顯示出顯著的相對豐度變化：其中，PE喂養(yǎng)組中的檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)豐度增加，PS喂養(yǎng)組中的單胞菌屬(Dysgomononas)和鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)豐度增加，聚酯型PUR喂養(yǎng)組中的紅樹桿菌屬(Mangrovibacter)豐度增加。Auta等[44]自紅樹林的沉積物中篩選塑料降解微生物，最終分離到的2株名為Bacilluscereus和Bacillusgottheilii的細(xì)菌可在以不同種類微塑料作為唯一碳源的合成培養(yǎng)基上生長；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在40 d內(nèi)，B.cereus對PE、PET和PS微塑料顆粒造成的質(zhì)量損失分別為1.6%、6.6%和7.4%；B.gottheilii對PE、PET、PP和PS微塑料顆粒造成的質(zhì)量損失分別為6.2%、3.0%、3.6%和5.8%，表現(xiàn)出了修復(fù)微塑料污染環(huán)境的潛力。

與PET降解微生物相比，可用于聚烯烴類塑料降解的微生物資源則相對缺乏。由于塑料的質(zhì)量損失和表面結(jié)構(gòu)變化有可能歸因于塑料中化學(xué)添加劑的降解，因?yàn)榛瘜W(xué)添加劑通常占聚合物的很大一部分，因此僅僅基于質(zhì)量損失和材料表面形貌觀察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往不能作為可靠的聚烯烴塑料降解證明。所以聚烯烴類塑料降解還存在著降解機(jī)制尚不明晰、降解產(chǎn)物不易檢測的技術(shù)難題，因此有待進(jìn)一步開發(fā)更先進(jìn)的檢測技術(shù)并對降解途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行鑒定及功能解析。

3 人工全細(xì)胞催化體系

在各種石油基塑料中，PET塑料的結(jié)構(gòu)和水解機(jī)制研究得較為透徹，因此研究人員將PET作為人工全細(xì)胞催化降解的主要研究對象，通過基因工程等手段構(gòu)建適用于PET水解酶異源表達(dá)的底盤細(xì)胞，以進(jìn)一步提升水解酶的表達(dá)量和熱穩(wěn)定性，從而彌補(bǔ)天然宿主的不足，大幅提高PET的生物降解效率。按照使用的全細(xì)胞催化劑生長溫度的不同，可以將現(xiàn)有的PET人工全細(xì)胞降解體系分為嗜中溫和嗜高溫催化體系兩大類。

3.1 嗜中溫人工全細(xì)胞催化體系

3.1.1 人工微生物混菌催化體系

人工微生物混菌體系具有功能模塊化的優(yōu)勢，有利于整個體系催化能力的優(yōu)化。例如，Qi等[45]利用紅球菌(Rhodococcusjostii)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)和2種外泌表達(dá)PET水解酶PETase和MHETase的工程化枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)構(gòu)建了PET降解的人工微生物混菌體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：工程化枯草芽孢桿菌構(gòu)成的雙菌體系可以降解PET膜，在7 d內(nèi)質(zhì)量損失達(dá)13.6%；進(jìn)一步通過添加紅球菌獲得了3種微生物的混菌體系，可減少TPA對酶解體系引起的反饋抑制作用，PET膜的質(zhì)量在3 d內(nèi)損失了31.2%，比雙菌體系提高了約17.6%；最后，通過引入惡臭假單胞菌將PET水解后產(chǎn)生的另一種單體成分EG進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而進(jìn)一步消除反饋抑制作用。由此可見，由前3種微生物組成的混菌體系的PET降解效率最高，引入惡臭假單胞菌后形成的4種微生物混合體系在TPA和EG的生物轉(zhuǎn)化上更有優(yōu)勢。

Liu等[46]也構(gòu)建了PET降解的人工混菌體系，首先構(gòu)建能夠外泌表達(dá)I.sakaiensis來源的PETase的Yarrowialipolytica工程菌株，以降解PET產(chǎn)生TPA。隨后，他們篩選到1株可以代謝TPA的Pseudomonasstutzeri，并在該菌中重組表達(dá)了聚-β-羥丁酸(PHB)合成基因簇phbCAB，實(shí)現(xiàn)TPA進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為PHB。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：基于工程化的Y.lipolytica和P.stutzeri構(gòu)建的人工混菌體系在12 h內(nèi)可以完全水解5.16 g/L的BHET，并在54 h內(nèi)積累36.6 g/L的PHB，228 h內(nèi)水解PET產(chǎn)生0.31 g/L TPA。

除此之外，利用人工混菌體系對PUR進(jìn)行降解的研究也有報(bào)道。例如，F(xiàn)ernandes等[47]利用黑曲霉(AspergillusnigerATCC16404)和銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC9027)形成的混菌體系對聚酯型PUR進(jìn)行降解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2株菌在PUR降解過程中可以發(fā)揮協(xié)同作用，有效提高了PUR的降解效率。由此可見，人工微生物混菌體系在塑料降解和轉(zhuǎn)化方面的巨大潛力為復(fù)雜聚合物的生物降解提供了新的思路。

3.1.2 海洋微藻催化體系

每年至少有800萬t塑料廢棄物進(jìn)入海洋，占海洋垃圾總量的80%。由于已知的塑料降解酶及其生產(chǎn)菌株多來源于陸地微生物系統(tǒng)，不能很好地適應(yīng)海洋生長條件，為此，開發(fā)適用于海洋中塑料污染降解處理的海洋微藻全細(xì)胞催化體系也成為重要的研究方向。三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)是一種海洋光合單細(xì)胞生物，可以在鹽水環(huán)境消耗CO2并快速生長，且具有相應(yīng)的遺傳操作系統(tǒng)[48]。Moog等[14]使用三角褐指藻作為底盤細(xì)胞，對來源于I.sakaiensis的PETase進(jìn)行了表達(dá)外泌，獲得了海洋微藻PET全細(xì)胞降解催化劑，該工程藻株可以在30 ℃下的鹽水環(huán)境中降解PET，這一研究證明了硅藻系統(tǒng)在未來PET海水污染的生物修復(fù)中的應(yīng)用潛力。然而，由于三角褐指藻需要SiO2作為營養(yǎng)物質(zhì)且在較低的溫度和高鹽度下才能生長，這些特性限制了其應(yīng)用范圍。萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是光合微生物的GRAS模式生物，非常適用于環(huán)保應(yīng)用，具有多種優(yōu)勢[49-50]。Kim等[51]使用另一種單細(xì)胞光合微生物萊茵衣藻作為底盤來生產(chǎn)PETase，在實(shí)驗(yàn)中選擇了萊茵衣藻CC-124和CC-503這2個代表性藻株進(jìn)行PETase異源表達(dá)，分析后發(fā)現(xiàn)：CC-124是更為適合的PETase表達(dá)底盤；同時(shí)，為了驗(yàn)證萊茵衣藻產(chǎn)生的PETase的催化活性，將細(xì)胞裂解物和30 mg PET粉末在30 ℃下共同孵育4周，通過高效液相色譜檢測到9.12 mg降解產(chǎn)物TPA，轉(zhuǎn)化率達(dá)到35.17%；另外使用掃描電鏡還觀察到PET薄膜表面出現(xiàn)孔洞和凹痕等形貌變化。這一研究實(shí)現(xiàn)了PETase在綠色微藻中首次成功表達(dá)，進(jìn)一步證明了海洋微藻體系作為塑料降解全細(xì)胞催化平臺的可行性。

3.1.3 酵母表面展示催化體系

酵母表面展示技術(shù)可以將外源蛋白與錨定蛋白以融合蛋白的形式展示在酵母細(xì)胞表面，從而實(shí)現(xiàn)外源蛋白的表達(dá)、純化和固定化于一體，簡化工藝，節(jié)約成本，在生物催化領(lǐng)域顯示出強(qiáng)大的優(yōu)勢[13]。Chen等[52]成功地將PETase展示在畢赤酵母細(xì)胞表面，從而開發(fā)了一種基于酵母的人工全細(xì)胞生物催化劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在酵母表面功能性展示PETase，可以有效提高酶的穩(wěn)定性,與純化的游離PETase相比，表面展示PETase的酵母全細(xì)胞生物催化劑對高結(jié)晶PET的轉(zhuǎn)化率增加了約36倍。此外，該全細(xì)胞生物催化劑重復(fù)使用性好且對化學(xué)溶劑耐受性較好，并具有降解不同商業(yè)高結(jié)晶PET瓶的能力。這一研究證實(shí)了通過在模式微生物表面展示PETase，構(gòu)建全細(xì)胞生物催化劑是實(shí)現(xiàn)PET降解與再造的重要途徑之一。

3.2 嗜高溫人工全細(xì)胞催化體系

PET是應(yīng)用最廣泛的合成聚酯，對PET材料特性和界面催化反應(yīng)機(jī)制分析后發(fā)現(xiàn)，PET生物降解水平提高的關(guān)鍵在于酶-底物相互作用及匹配性、酶制劑的熱穩(wěn)定性、高溫條件下的催化效率以及降解中間體的及時(shí)去除[53]。其中，高溫條件下的高效酶解催化至關(guān)重要。這是由于PET生物降解的最關(guān)鍵因素之一是玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，即PET在升溫過程中由玻璃態(tài)向高彈態(tài)或者在降溫過程中由高彈態(tài)向玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變時(shí)的溫度。當(dāng)溫度接近玻璃化轉(zhuǎn)變溫度時(shí)，PET塑料的狀態(tài)會發(fā)生改變，非晶態(tài)部分具有更高的柔性。PET聚酯鏈的擺動性增加可有效促進(jìn)聚酯鏈進(jìn)入酶催化活性中心，從而提高PET降解效率[54]。一般PET的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度在80 ℃左右[55]，在水溶液中，由于水分子在聚合物鏈之間擴(kuò)散的作用，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度下降至60～65 ℃[56]。目前，能夠在大于60 ℃的高溫條件下高效降解PET的天然微生物尚未見報(bào)道，因此需要人工開發(fā)適用于PET降解的嗜熱底盤細(xì)胞。

目前，已報(bào)道多種具有較高降解效率的高溫PET水解酶。例如，HiC角質(zhì)酶來源于特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)，在70 ℃下反應(yīng)96 h，幾乎可以完全水解結(jié)晶度為7%的PET薄膜[57]。Then等[58]利用來源于ThermobifidafusaDSM43793的TfH催化降解PET薄膜，在55 ℃下反應(yīng)3周，使結(jié)晶度為10%的PET薄膜質(zhì)量損失50%。來自T.fusaKW3菌株的TfCut2角質(zhì)酶能夠在65 ℃下降解低結(jié)晶度PET材料[59]。Wei等[60]自嗜熱放線菌ThermomonosporacurvataDSM43183中分離到2種具有聚酯降解能力的水解酶Tcur1278和Tcur0390，其中Tcur1278表現(xiàn)出更佳的熱穩(wěn)定性，可以在60 ℃條件下降解PET顆粒；此外，來源于枝葉堆肥宏基因組的LCC角質(zhì)酶在pH 8.0、50 ℃條件下，PET降解效率達(dá)到12 mg/(h·mg)。

在天然PET降解酶的基礎(chǔ)上，研究人員通過催化條件優(yōu)化或者蛋白質(zhì)工程進(jìn)一步提高了酶的熱穩(wěn)定性。例如，Then等[58]通過向TfH中添加Ca2+、Mg2+來提高酶的熱穩(wěn)定性，最終在65 ℃反應(yīng)48 h，對低結(jié)晶度PET膜的降解率達(dá)13%。Tournier等[61]利用二硫鍵策略對LCC進(jìn)行了改造，將其金屬離子結(jié)合位點(diǎn)附近的氨基酸殘基替換成了含硫基的氨基酸，獲得的突變體的Tm提高了9.8 ℃，通過進(jìn)一步突變，最終獲得的四氨基酸殘基的突變體LCCICCG在10 h內(nèi)最終實(shí)現(xiàn)了至少90%的PET解聚，TPA生產(chǎn)強(qiáng)度為16.7 g/(L·h)。在此基礎(chǔ)上，Zeng等[62]通過解析LCCICCG和PET底物類似物的晶體結(jié)構(gòu)，揭示了角質(zhì)酶的PET結(jié)合模式；根據(jù)結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行蛋白質(zhì)理性設(shè)計(jì)，進(jìn)一步構(gòu)建了幾種Tm接近99 ℃且PET水解活性提高的突變體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些突變體在解聚無定形和高結(jié)晶度PET方面均表現(xiàn)出比突變體LCCICCG更高的效率。

IsPETase作為一種PET中溫水解酶在高溫條件下活性較低。研究人員基于IsPETase所具有的靈活而開放的底物結(jié)合區(qū)域的特點(diǎn)，對其開展了一系列的蛋白質(zhì)工程改造。例如，Son等[63]經(jīng)過3個氨基酸殘基的突變獲得ThermoPETase(S121E/D186H/R280A)，它的Tm比野生型的提高了8.8 ℃，PET降解能力提高了14倍。Cui等[25]通過GRAPE計(jì)算方法獲得的十氨基酸殘基突變體DuraPETase，其Tm提高了31 ℃，PET降解能力提高了300倍以上。

高溫條件對PET的高效降解至關(guān)重要[54-55]。雖然有天然或改造的高溫PET水解酶的報(bào)道較多，但嗜熱微生物比嗜中溫細(xì)菌的遺傳改造難度更大，所以可用于PET降解的人工高溫全細(xì)胞催化體系相對缺乏。熱纖梭菌是一種典型的嗜熱細(xì)菌，最適培養(yǎng)溫度在60 ℃左右[64]，且已具有相對成熟的遺傳改造工具平臺[65-67]。作為一種天然高效的木質(zhì)纖維素降解菌株，在前期的研究中，熱纖梭菌已被應(yīng)用于秸稈等天然廢棄聚合物的全細(xì)胞催化技術(shù)的開發(fā)，繼而衍生出整合生物加工和整合生物糖化等技術(shù)體系，并應(yīng)用于木質(zhì)纖維素的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化領(lǐng)域[68-69]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室基于前期在熱纖梭菌遺傳改造方面的技術(shù)優(yōu)勢，通過基因工程改造實(shí)現(xiàn)嗜熱角質(zhì)酶LCC在熱纖梭菌中異源外泌表達(dá)，首次構(gòu)建了PET人工嗜高溫全細(xì)胞降解體系，在60 ℃條件下，該熱纖梭菌工程菌株在14 d內(nèi)將超過60%的無定形PET薄膜轉(zhuǎn)化為可溶性單體，其降解性能明顯高于先前報(bào)道的使用嗜中溫細(xì)菌或微藻的全細(xì)胞PET生物降解體系[15]。因此，熱纖梭菌是重要的合成生物學(xué)嗜熱微生物底盤，未來可用于PET廢棄物生物降解平臺的開發(fā)。由于熱纖梭菌能夠天然降解木質(zhì)纖維素，因此該菌在滌棉混紡廢品的生物回收中也極具潛力[53]。

除了熱纖梭菌以外，滿足高溫水解酶的生產(chǎn)及催化需求的嗜熱底盤細(xì)胞和相應(yīng)的全細(xì)胞催化體系研究較少，但針對Thermotogasp.[70]、Caldicellulosiruptorsaccharolyticus[71]和Thermoanaerobacterethanolicus[72]等，研究者們也建立了相應(yīng)的遺傳改造平臺。因此，這些高溫菌株具有應(yīng)用于PET全細(xì)胞催化體系開發(fā)的潛力。

3.3 PET降解多酶復(fù)合體的構(gòu)建

在自然環(huán)境下，微生物已進(jìn)化出復(fù)雜的纖維素酶體系來降解木質(zhì)纖維素。例如，以熱纖梭菌為代表的厭氧微生物能夠分泌一種多酶復(fù)合體——纖維小體。該多酶復(fù)合體可以通過支架蛋白(scaffold protein)將各種纖維素酶組裝在一起，通過掛壁模塊展示在細(xì)胞表面，還可以利用碳水化合物結(jié)合模塊吸附在纖維素底物上行使催化功能。纖維小體可以發(fā)揮酶與酶之間的協(xié)同效應(yīng)、酶與細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)以及酶與底物的協(xié)同效應(yīng)，從而高效降解木質(zhì)纖維素底物。目前，纖維小體的基本架構(gòu)和降解機(jī)制都已經(jīng)得到深入的解析[73-74]，與此同時(shí)，人工纖維小體也在合成生物學(xué)中得到廣泛應(yīng)用[75-76]。

已知PET生物降解過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物BHET和MHET會抑制PET水解酶的活性[77-78]，如果基于纖維小體架構(gòu)，將PET水解酶和中間產(chǎn)物水解酶組裝成一個人工多酶復(fù)合體，從而獲得可實(shí)現(xiàn)底物級聯(lián)催化的分子機(jī)器，這將是解決中間產(chǎn)物抑制問題的一種良好策略(圖1)。此外，利用蛋白質(zhì)多聚體、納米顆?；蛘吣さ鞍讈順?gòu)建仿纖維小體架構(gòu)的思路也值得借鑒[79]。

4 聚酯類塑料的開放升級再造策略

傳統(tǒng)的物理和化學(xué)處理技術(shù)致力于將塑料廢棄物分解為分子結(jié)構(gòu)單元，再重新加工聚合成纖維和瓶子等再生塑料制品。生物降解技術(shù)更易與生物回收技術(shù)相耦合，旨在利用微生物將塑料降解的產(chǎn)物合成高附加值化學(xué)品，且不局限于塑料產(chǎn)品范圍內(nèi)，因?yàn)檫@是一種更為開放的升級再造策略，更符合低碳經(jīng)濟(jì)的發(fā)展理念。目前塑料廢棄物升級再造主要集中在PET和PUR兩大類塑料。

PET的生物降解產(chǎn)物主要包括終產(chǎn)物TPA、EG以及MHET和BHET等少量中間產(chǎn)物，經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化為聚羥基脂肪酸(polyhydroxyalkanoate,PHA)和生物基聚氨酯、原兒茶酸(protocatechuic acid)和乙醇酸(glycolic acid)等產(chǎn)品[80-81](圖1)。例如，Kenny等[82]自塑料瓶生產(chǎn)廠區(qū)的土壤中分離到3株可以利用TPA作為唯一碳源生長并能夠合成積累PHA的細(xì)菌。不僅如此，進(jìn)一步通過發(fā)酵優(yōu)化使PHA產(chǎn)量達(dá)到2.61 g/L，且在發(fā)酵體系中同時(shí)添加TPA和生物柴油生產(chǎn)中產(chǎn)生的廢甘油(WG)，可以提高菌株對TPA的利用率[83]。

近年來，研究人員針對惡臭假單胞菌開發(fā)了成熟的遺傳改造技術(shù)[84-86]，將其打造為鼠李糖脂、萜類化合物、聚酮化合物、非核糖體肽以及氨基酸衍生物等應(yīng)用廣泛的化學(xué)品生產(chǎn)平臺[87-88]。例如，Tiso等[89]對惡臭假單胞菌進(jìn)行改造后將其用于生產(chǎn)3-羥基脂肪酸的二聚體——羥基烷酰氧基鏈烷酸酯(HAA)，進(jìn)一步將它用于生物或化學(xué)催化轉(zhuǎn)化。與許多其他含有脂肪酸的分子相比，HAA可以分泌到胞外，不依賴于細(xì)胞裂解，簡化了純化步驟[90]。在此基礎(chǔ)上，Tiso等[80]進(jìn)一步利用假單胞菌工程菌株將PET水解產(chǎn)物TPA和EG轉(zhuǎn)化為HAA，并進(jìn)一步合成PUR。除此之外，TPA可以由重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化為原兒茶酸，并進(jìn)一步合成沒食子酸、鄰苯三酚、兒茶酚、黏康酸和香草酸等高附加值產(chǎn)品[81]。EG還可以由氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)或者惡臭假單胞菌轉(zhuǎn)化為乙醇酸[91-92]。

PUR的主鏈相對于PET的更加復(fù)雜，降解產(chǎn)物多樣化，可能包括醇、酸、胺和芳烴等，對下游的生物轉(zhuǎn)化提出了挑戰(zhàn)[93-94]。已知野生型惡臭假單胞菌KT2440能夠以1,4-丁二醇(1,4-BDO)為唯一碳源生長，但速度非常緩慢。Li等[95]通過對惡臭假單胞菌KT2440進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化，分離到了幾株生長速率和生物量顯著提高的菌株，并進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組重測序分析了可能的1，4-BDO的代謝途徑，以擴(kuò)大惡臭假單胞菌在塑料升級再造中的適用性。Utomo等[46]設(shè)計(jì)了3種分別具有己二酸、1，4-BDO和EG利用功能的惡臭假單胞菌工程菌株，并構(gòu)建了由3種工程菌株組成的混菌降解體系，最終將PUR單體轉(zhuǎn)化為鼠李糖脂。

5 結(jié)論與展望

我國早在2007年底提出了最早的“限塑令”，《國務(wù)院辦公廳關(guān)于限制生產(chǎn)銷售使用塑料購物袋的通知》要求自2008年開始限制一次性塑料制品中用量最大、使用最多的塑料購物袋的使用。2020年1月19日，國家發(fā)展和改革委員會、生態(tài)環(huán)境部公布了《關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)塑料污染治理的意見》，又進(jìn)一步加強(qiáng)了對更多種類的塑料制品的限制。2021年2月9日，國家機(jī)關(guān)事務(wù)管理局辦公室、住房和城鄉(xiāng)建設(shè)部辦公廳、國家發(fā)展和改革委員會辦公廳共同發(fā)布《關(guān)于做好公共機(jī)構(gòu)生活垃圾分類近期重點(diǎn)工作的通知》，明確定義了不可降解塑料的范圍和類型，再次證明了我國限制塑料使用、保護(hù)環(huán)境安全的決心。

近幾年，國家自然科學(xué)基金委和科技部等部門啟動了多項(xiàng)廢塑料微生物降解項(xiàng)目，包括與歐盟環(huán)境科技領(lǐng)域共同資助的項(xiàng)目，在塑料機(jī)械預(yù)處理、特定塑料類型的酶設(shè)計(jì)、人工塑料降解微生物菌群構(gòu)建、塑料降解單體和低聚物的高值轉(zhuǎn)化(如PHA)、加工過程的毒素去除和產(chǎn)品回收等方面開展攻堅(jiān)研究?？梢?，我國政府對塑料降解技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用寄予厚望。與基于酶制劑的塑料降解技術(shù)相比，全細(xì)胞催化技術(shù)的天然菌株及工程底盤的開發(fā)仍處于實(shí)驗(yàn)室初期階段，但已經(jīng)展現(xiàn)出了廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。

5.1 新型天然降解微生物的分選與實(shí)驗(yàn)室定向進(jìn)化

除了通過開發(fā)基于熒光或拉曼信號的分選技術(shù)以實(shí)現(xiàn)塑料天然降解菌的高通量分選外，還需要建立與之相對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化技術(shù)。塑料是人造聚合物，自然界中幾乎沒有天然“專職”降解塑料的酶，已報(bào)道的水解酶均為“兼職”降解塑料。現(xiàn)有的分子設(shè)計(jì)和理性改造取得了巨大成功，而在現(xiàn)有酶的基礎(chǔ)上開展實(shí)驗(yàn)室壓力條件下的非理性改造，推動酶的進(jìn)化，有望進(jìn)一步獲得具有更高比酶活、底物親和力以及魯棒性的突變體。

除此以外，可以通過非理性手段對現(xiàn)有的水解酶表達(dá)底盤細(xì)胞進(jìn)行定向進(jìn)化，結(jié)合先進(jìn)的分選技術(shù)，獲得滿足塑料高效降解的全細(xì)胞催化體系。這些非理性手段包括誘變技術(shù)(例如室溫常壓等離子體)、適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化技術(shù)(例如微滴微生物培養(yǎng)系統(tǒng))、隨機(jī)組裝策略(例如多重自動化基因組工程)等。

5.2 人工全細(xì)胞催化劑的理性構(gòu)建

已開發(fā)的以熱纖梭菌為嗜熱底盤的PET全細(xì)胞降解體系，滿足高溫水解酶的生產(chǎn)及催化需求，表現(xiàn)出較高的PET降解效率，具有開發(fā)和應(yīng)用前景。新型高溫酶的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，為高溫人工全細(xì)胞催化劑的構(gòu)建提供了有力的酶資源支撐。除了酶的甄選外，還需要通過理性改造手段進(jìn)一步提高菌株發(fā)酵的魯棒性。另外，通過探索菌株代謝水平、培養(yǎng)基組分、表達(dá)載體、連接肽和信號肽等因素對異源蛋白表達(dá)外泌條件的優(yōu)化，有助于不斷優(yōu)化全細(xì)胞催化劑的PET降解性能。

此外，針對PUR等降解途徑尚不明確的塑料，應(yīng)利用從基因組到代謝組的多組學(xué)分析手段，綜合分析微生物代謝水平、能量水平、氧化還原水平等與塑料底物的響應(yīng)關(guān)系，從而解析塑料降解途徑和同化途徑，指導(dǎo)人工全細(xì)胞催化降解體系的構(gòu)建。

5.3 塑料降解和再造的集中式工程化應(yīng)用

農(nóng)作物秸稈也是固體廢棄物的一種，目前已經(jīng)形成了比較成熟的從原料收集到高值轉(zhuǎn)化的綜合體系，這與其天然屬性密切相關(guān)。塑料廢棄物的回收利用更為復(fù)雜和困難。借鑒農(nóng)作物秸稈的管理體系，除了開發(fā)更為高效的塑料生物降解技術(shù)外，還需在如何建立完善的塑料回收系統(tǒng)、提高收集效率、建設(shè)回收基礎(chǔ)設(shè)施、建立回收法規(guī)制度、建立工程化的應(yīng)用體系等環(huán)節(jié)進(jìn)行研究，同時(shí)，形成不同環(huán)節(jié)間的有機(jī)整合意義重大。國內(nèi)外科研單位、企業(yè)與政府也越來越關(guān)注塑料降解技術(shù)集中式工程化落地應(yīng)用的可行性與技術(shù)的經(jīng)濟(jì)性。通過建立“塑料—單體—高值化產(chǎn)品”的完整產(chǎn)業(yè)鏈，實(shí)現(xiàn)塑料廢棄物的綠色降解及升級再造，將有效減少化石能源的使用，助力我國“雙碳”目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。