聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)水解酶的高通量篩選:進展與挑戰(zhàn)

韋 韌

(格萊夫斯瓦爾德大學(xué) 生物化學(xué)研究所，格萊夫斯瓦爾德 17489,德國)

石油基塑料在其不到百年的歷史中給人類社會帶來了翻天覆地的變化。在過去的幾十年中，塑料在許多應(yīng)用場景下逐漸取代了天然材料。塑料制品的大規(guī)模生產(chǎn)和使用不僅推動了眾多產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，同時也給人們的日常生活提供了許多便利。但是，另一方面，對塑料制品的依賴，特別是一次性塑料制品的廣泛應(yīng)用，給固體廢棄物處理和環(huán)境污染防治造成了嚴峻的挑戰(zhàn)[1-3]。根據(jù)Geyer 等[4]在2017年的一篇報道，截至2015年，全球大部分使用后的塑料并未被回收利用，而是通過填埋、丟棄的方式釋放到了自然環(huán)境中。在20世紀70年代，科學(xué)界首次量化分析了塑料垃圾在太平洋的分布情況[5]。近年來，塑料污染已經(jīng)成為人類社會最大的環(huán)境危機之一，對陸地和水生生態(tài)系統(tǒng)以及人類健康構(gòu)成了嚴重威脅[6-7]。2018年，歐盟委員會正式發(fā)布了“基于循環(huán)經(jīng)濟理念的塑料戰(zhàn)略”(A European strategy for plastics in a circular economy)，為可持續(xù)性資源利用、塑料生產(chǎn)和廢棄物處理制定了政策框架。在這個背景下，生產(chǎn)和使用非石油基或者可降解塑料制品替代石油基塑料成為了近期的研發(fā)熱點[8]。此外，塑料循環(huán)經(jīng)濟政策框架也鼓勵開發(fā)新型回收技術(shù)，使得現(xiàn)存的石油基塑料產(chǎn)品和廢棄物能最大限度地控制在材料循環(huán)圈內(nèi)，既可以避免它們被釋放到環(huán)境中去，又可以減少原始塑料材料的生產(chǎn)，從而達到節(jié)省燃料、能源和減少CO2排放的目的[9-11]。近年來，在許多國家和地區(qū)的共同努力下，不同程度的限塑令使得全球塑料(原始材料)生產(chǎn)趨于平穩(wěn)。2020年，全球塑料產(chǎn)量(原始材料，不包括合成纖維和再生塑料)達到3.67億噸/年，與上一年基本持平[12]。與此同時，人類社會對塑料制品的需求卻并未降低。特別是這兩年來，由于新冠病毒大流行引起的全球生活和出行方式的改變，人們對一次性塑料包裝和醫(yī)療材料的依賴呈現(xiàn)顯著的上升趨勢，進一步加重了塑料引起的環(huán)境危機[13-16]。

近年來，生物技術(shù)輔助的塑料降解和回收已成為一個蓬勃發(fā)展的研究領(lǐng)域[17-21]。其實，早在20世紀70年代，科學(xué)家們就開始研究塑料垃圾生物降解的可能性[22-23]。由于塑料高分子材料的物理(例如高結(jié)晶度結(jié)構(gòu)和強疏水性表面)、化學(xué)(例如聚烯烴類的碳-碳主鏈缺乏容易裂解的官能團)特性和環(huán)境抗性，尋找和優(yōu)化微生物來源的高效塑料解聚酶被認為是限制生物降解技術(shù)應(yīng)用的瓶頸[24-25]。盡管近年來的研究取得了一定的成就，有確鑿科學(xué)證據(jù)和工業(yè)化前景的生物催化或微生物塑料降解技術(shù)依然局限于幾種有限的聚酯類塑料。聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)是應(yīng)用范圍最廣泛的聚酯類材料，可以被加工成聚酯纖維應(yīng)用在紡織業(yè)的各個領(lǐng)域，也可以被制作成不同類型的食品飲料包裝材料。自2005年Müller等[26]從Thermobifidafusca中分離表征了一種高效的PET水解酶以來，發(fā)掘和改造新型PET水解酶已成為一個重要的研究領(lǐng)域[27-29](圖1)。到目前為止，人們從許多真核和原核生物微生物中發(fā)現(xiàn)了至少幾十種具有PET聚酯水解能力的酶。早期的報道集中在來源于嗜熱性放線菌的角質(zhì)酶和其他同源性水解酶，主要來源微生物包括Thermobifida屬和其他近緣微生物的不同菌株[30-31]。真菌類PET水解酶主要來自Fusarium屬和已經(jīng)商業(yè)化的嗜熱性Thermomycesinsolens(原種名Humicolainsolens)分泌的角質(zhì)酶[32-33]。2016年，Yoshida等[34]報道了一種從日本大阪府堺市一家塑料瓶回收廠的沉淀物樣本中分離出來的大阪伊德氏桿菌Ideonellasakaiensis，它能夠在實驗室低溫(30 ℃)條件下利用PET作為主要碳源生長并同化PET降解產(chǎn)物。此后，改造和優(yōu)化I.sakaiensis分泌的IsPETase水解酶成為了世界范圍內(nèi)的研究熱點[35-37]。此外，宏基因組技術(shù)的應(yīng)用也推動了許多新型PET水解酶的發(fā)現(xiàn)。Sulaiman等[38]在2012年報道了從植物枝葉堆肥中分離出來的PET水解酶LCC，由于其較高的熱穩(wěn)定性和高溫活性[39-41]，LCC近年來成為最受關(guān)注的PET水解酶之一。2020年，法國Carbios生物技術(shù)公司和圖盧茲大學(xué)在《Nature》上合作發(fā)表了通過蛋白工程技術(shù)優(yōu)化LCC酶的文章[42]，通過基于結(jié)構(gòu)的突變并結(jié)合前期其他同源角質(zhì)酶改造的成功案例，Tournier等[42]獲得了一個LCC-ICCG突變體，該突變體可以在高質(zhì)量濃度底物(200 g/L)的先導(dǎo)工業(yè)水平下，72 ℃反應(yīng)10 h，實現(xiàn)對預(yù)處理過的廢棄PET瓶超過90%的解聚，被公認為是實現(xiàn)未來生物技術(shù)塑料回收應(yīng)用的一個突破。Danso等[43]開發(fā)了一種搜索算法，從各種海洋和陸地來源的宏基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個PET水解酶候選基因，最新研究成果表明，在人類的唾液宏基因組中也有高效PET水解酶基因存在[44]。因此，世界各地開展的塑料生物降解的科研項目中(比如中歐政府間合作旗艦項目MIX-UP[45])，無一例外地包括了尋找和優(yōu)化PET水解酶的科研內(nèi)容。幾乎可以肯定的是，我們目前還沒有找到自然界中最有效的PET水解酶。為了實現(xiàn)這個目標，我們需要更有效的超高通量篩選方法去檢索自然界的微生物資源和大規(guī)模突變體文庫[29]。

TPA—對苯二甲酸根離子(terephthalate)；MHET—單(2-羥基乙基)對苯二甲酸酯(mono(2-hydroxyethyl)terephthalate)；BHET—雙(2-羥基乙基)對苯二甲酸酯(bis(2-hydroxyethyl)terephthalate)

本文根據(jù)近年來的研究進展，簡要回顧目前用于表征酶水解PET的分析方法，重點介紹幾種可能用于高通量篩選的方法并討論它們在不同應(yīng)用場景下的可行性。關(guān)于PET水解酶發(fā)掘、改造的最新進展以及眾多表征方法的詳盡描述，讀者可以參考幾篇最新的綜述[27-29,46-47]，本文不做一一贅述。

1 PET納米顆粒的制備和在酶篩選中的應(yīng)用

酶水解PET是典型的界面催化反應(yīng)(interfacial biocatalysis)，固態(tài)表面可以接觸酶水溶液的酯鍵，被水解后產(chǎn)生可溶性的小分子產(chǎn)物，所以也被稱為“表面侵蝕”(surface erosion)反應(yīng)[48]。因此，提高聚合物底物的比表面積是提高酶水解反應(yīng)速度的一個有效策略[49-51]，例如使用直徑在納米(100 nm以下)到亞微米范圍(100～1 000 nm)的PET顆粒(本文統(tǒng)一稱為PET納米顆粒)作為底物[43,52-61]。目前市場上暫時沒有商用的PET納米顆粒，但它們可以通過簡單的溶劑蒸發(fā)法來制備[55-56,60,62-63](圖2(a))?？梢匀芙釶ET的溶劑只有六氟異丙醇(HFIP)、三氟乙酸(TFA)等少數(shù)有機溶劑。相較于后者，HFIP可以在常溫下迅速溶解各種PET材料(例如商用無定形PET薄膜、高結(jié)晶度的PET顆粒和聚酯纖維以及廢舊PET包裝材料等)，因此是制備納米顆粒的首選溶劑。缺點是HFIP相對比較昂貴，所以如果能循環(huán)使用溶劑是一個比較經(jīng)濟的方案。如圖2(a)所示，一般的制備方法是將10 g/L的PET六氟異丙醇溶液逐滴加入10倍體積的蒸餾水中，蒸餾水要持續(xù)保持劇烈的攪拌(比如使用均質(zhì)器或磁力攪拌器等)，PET溶液在水(作為反溶劑antisolvent)中的稀釋導(dǎo)致了PET納米顆粒的形成。較大的顆粒或者絮狀沉淀物可以通過過濾去除，從而得到乳白色均勻的懸濁液。由于HFIP的沸點(58.2 ℃)低于水的沸點，所以可以用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器分離得到純水PET納米顆粒懸濁液。納米顆粒的濃度可以通過干燥后稱質(zhì)量來確定，顆粒大小可以通過動態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS)或者掃描電鏡(scanning electron microscopy,SEM)來確定[56]。一般情況下，按照這個方法制備的納米顆粒的粒徑均值在(100±50)nm[55-56,60]，因此可以作為懸濁液在室溫下儲存很久，方便隨時使用。根據(jù)Pfaff等[52]最新的報道，這種方法制備的納米顆粒的分子量也遠小于制備前PET原材料的分子量，因此可以更容易被酶水解。另一個制備PET納米顆粒的類似方案采取三氟乙酸(TFA)作為溶劑[63]。這個方法相對比較復(fù)雜，需要在50 ℃下溶解PET，并且在制備其水相懸濁液時要加入低濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS)。由于這個方法會產(chǎn)生大量粒徑在300 nm以上的顆粒，需要使用量筒進行沉淀分離。另外，由于SDS可能會影響酶活性和微生物生長，這種方案制備的納米顆粒不可以作為懸濁液直接使用。

由于PET納米顆粒的粒徑均值小于可見光波長，丁達爾效應(yīng)會使入射光透過納米顆粒懸濁液從而產(chǎn)生明顯的散射作用(圖2(b))。因此，由水解反應(yīng)引起的納米顆粒粒徑和濃度的變化可以通過跟蹤濁度(600 nm處的光密度)的變化來測量[60,64]。由于許多PET水解酶需要較高濃度的緩沖液來維持其活性[52,65]，PET納米顆粒可能在高溫降解反應(yīng)中形成沉淀并造成比濁度測量的誤差。通過使用瓊脂糖[60]或者聚丙烯酰胺凝膠[52]來固定納米顆粒以及反應(yīng)體系可以解決這一問題，提高測量的可重復(fù)性。通過縮小反應(yīng)體系的體積，酶水解凝膠固定化的PET納米顆?？梢栽?6孔板中進行，從而提升表征的通量，用于酶的篩選和動力學(xué)分析[52]。類似的方法可以用來表征和篩選其他小分子底物(例如 BHET)水解的酶活性[66]，以及酶解聚聚丁二酸己二酸丁二醇酯(PBSA)[67]、聚己內(nèi)酯(PCL)[59]、商用聚酯型聚氨酯分散體(Impranil?DLN-SD,Covestro AG,Germany)[68]等聚合物的活性。在使用后幾種底物時，由于酶水解反應(yīng)較快，納米顆粒懸濁液在反應(yīng)過程中比較穩(wěn)定，不需要額外加入凝膠固定就可以測得重復(fù)性較高的比濁度變化。這樣相對簡單的反應(yīng)體系有利于對解聚機制的解析。

在實踐中，基于微孔板的檢測方法通量有限，很難適用于篩選非常大的文庫。相比之下，瓊脂平板測定法的通量要高得多。在瓊脂平板的制備中加入4～5 g/L的聚酯納米顆粒，就可以通過比濁法檢測篩選具有較高聚酯水解活性的菌落。活性水解酶的分泌會導(dǎo)致菌落周圍形成清晰的透明圈[43]，采用此方法可以每周篩選數(shù)百萬個克隆[29](圖2(b))。由于PET納米顆粒制備中采用的溶劑價格高昂，PCL和Impranil?DLN-SD分散體經(jīng)常被用作其廉價易得的替代品[43,69-70]。需要注意的是，用這兩種替代底物篩選出來的酶和菌株通常具有較強的脂肪類聚酯水解活性，但未必都有足夠的PET水解活性，因此還需要在PET底物上進行進一步的活性驗證。為了解決這個問題，Charnock[71]最近開發(fā)了一種用二甲基亞砜(DMSO)在180 ℃高溫下溶解PET并迅速加入預(yù)熱的低濃度頂層瓊脂(top agar)的方法來制備瓊脂平板，可在保證直接篩選PET水解活性的基礎(chǔ)上有效地控制成本?；诰埘ゼ{米顆粒篩選水解酶和活性菌株的方法也有其局限性，原因在于高效PET水解酶大部分為最適反應(yīng)溫度在50 ℃以上的耐高溫酶，并且PET的物理性質(zhì)決定其在常溫條件下的可降解性有限[29,72-73]，如何在酶水解反應(yīng)的最佳溫度和底盤微生物的最佳生長溫度(一般為常溫到不超過40 ℃)之間進行權(quán)衡是目前限制這個方法應(yīng)用的瓶頸。

圖2 PET納米顆粒的制備(a)以及其在比濁法表征或篩選PET水解酶(b)中的應(yīng)用示意

2 紫外/可見光分光光度法在表征和篩選PET水解酶中的應(yīng)用

PET水解產(chǎn)生的降解產(chǎn)物包括TPA、MHET(酸根離子)、BHET和一些水溶性更低的短酯寡聚物[25,50,74]。雖然全面監(jiān)測PET水解產(chǎn)物的構(gòu)成和濃度有助于解析PET解聚機制，但由于其解聚產(chǎn)物成分復(fù)雜且溶解度不同，常見的檢測手段僅針對幾種可溶于水的小分子。因為所有3種化合物含有相同數(shù)量的羰基[46,50]，并具有相同的消光系數(shù)，因此在波長240～244 nm附近有一個相同的強吸收峰[75]。高效液相色譜法(HPLC)檢測PET水解產(chǎn)物一般也在這個紫外波長范圍內(nèi)進行，并已經(jīng)逐漸成為定量分析PET酶降解效率最常用的檢測方法[46,50]。根據(jù)朗伯-比爾定律，測量在該波長范圍內(nèi)的吸光值可用于計算這些小分子PET水解產(chǎn)物的總和，從而換算成產(chǎn)生TPA的總當(dāng)量來表征水解酶活性[30,37,42,57,76]。在最早對T.fusca角質(zhì)酶表征的研究中，在波長242 nm處的紫外分光光度法已經(jīng)被用來鑒定該酶在降解含TPA單元的脂肪類和芳香類共聚多酯方面的活性[77]。采用不受紫外線影響的96孔板，這個方法可以用來快速檢測和篩選大量樣品中的酶促PET水解產(chǎn)物，達到較高的篩選通量[74]。這種方法的主要優(yōu)點是不需要對可溶性水解產(chǎn)物樣品進行處理(如衍生化)，只需要將它們從PET底物和其他非水溶性降解產(chǎn)物中分離出來，減少這些雜質(zhì)對紫外吸光度產(chǎn)生的影響。但是如果產(chǎn)物中存在其他可溶性紫外吸收化合物時，例如二甲基亞砜(DMSO)或者大量蛋白質(zhì)(酶)[75,78]，這種方法的準確性會大打折扣。最近，Zhong-Johnson等[75]采用在波長260 nm處測量的方法有助于減少其他非特異性產(chǎn)物對測量結(jié)果的影響?；谶@個思路，建議在以后的應(yīng)用中掃描完整的反應(yīng)混合物吸光光譜(220～300 nm)，而不是記錄單一波長的吸光強度[50]。

作為水解產(chǎn)物的MHET和TPA都有自由的羧基(圖1)，因此在低濃度緩沖溶液中進行PET酶解時，反應(yīng)體系的pH會持續(xù)下降[50]。這個現(xiàn)象也是酸堿滴定法來表征PET水解的理論基礎(chǔ)[32]。類似地，如果在進行降解實驗時加入酸堿指示劑(比如酚紅(phenol red)或溴麝香草酚藍(bromothymol blue))，在遠高于這些產(chǎn)物pKa值的低濃度緩沖溶液中，由PET水解引起的pH變化可通過紫外/可見光吸收光譜的數(shù)值變化來量化表征[79]。分光光度計比色皿中的顏色變化可用于監(jiān)測反應(yīng)的進行程度[80]，也可以用來比較不同PET水解酶降解小分子模式底物的活性差異[79]。在固定化PET或者其他聚酯納米顆粒的瓊脂中添加酸堿指示劑可以快速固相篩選表達水解酶的微生物[81]。酸性反應(yīng)產(chǎn)物的擴散降低了菌落周圍的pH，改變了染料的顏色，從而將彩色光環(huán)的半徑和酶的表達水平和活性統(tǒng)一起來，有助于提升普通透明圈檢測的靈敏度。

3 熒光分光光度法在表征和篩選PET水解酶中的應(yīng)用

除了TPA之外，Gimeno-Pérez等[86]首次開發(fā)了基于乙二醇(EG)的PET水解產(chǎn)物熒光檢測法(圖3(b))。該方法采用酮還原酶(KRED)在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)輔酶Ⅱ輔助下將EG、MHET或BHET氧化成相應(yīng)的醛，然后，來自Clostridiumkluyveri克魯氏梭菌的黃遞酶(diaphorase)將NADPH重新氧化成NADP+，同時催化刃天青(resazurin)還原成在可見光范圍內(nèi)(550 nm)被激發(fā)可產(chǎn)生強熒光(580 nm)的試鹵靈(resorufin)。通過對不同商業(yè)化KRED的比較，篩選出了最有效的酮還原酶完成這個耦合反應(yīng)，定量檢測聚酯水解酶降解PET的產(chǎn)物。雖然這個熒光法測量出的降解產(chǎn)物與傳統(tǒng)HPLC法測出的量有較好的契合性，但是幾個顯著的缺陷限制了這個方法的進一步應(yīng)用。由于在低濃度范圍內(nèi)該方法對MHET和BHET檢測的靈敏度過高而且線性相關(guān)性較差，此方法很難用于準確定量分析PET水解產(chǎn)物。另外，復(fù)雜的反應(yīng)步驟和相對較長的總體最佳反應(yīng)時間(超過1 h)使得這個方法相比基于TPA的熒光檢測法毫無優(yōu)勢。另外，由于KRED針對EG的特異性較低，在MHET和BHET大量存在的條件下，該方法對特異性檢測EG有很大局限性。不過采用特異性氧化EG的酶[87]可能對進一步優(yōu)化該方法有很大幫助。

2022年，Qiao等[88]研究了一種基于熒光檢測的微流控液滴分選方法，用于分離分泌PET水解酶的微生物(圖3(c))。這個方法首先將單個細胞包裹在液滴中，并培養(yǎng)數(shù)天以表達足夠量的PET水解酶，然后將熒光素二苯甲酸酯(fluorescein dibenzoate)作為底物注入液滴，可表達活性水解酯酶的細胞能將模式底物轉(zhuǎn)化成熒光素(fluorescein)，從而實現(xiàn)熒光液滴分選。盡管作者認為，這個基于苯甲酰酯的底物與PET有一定結(jié)構(gòu)相似性，使其只能被PET水解酶水解而無法被典型脂肪酶水解。事實上，熒光素二苯甲酸酯很早就被合成并應(yīng)用為一種典型的脂肪酶底物[89]。鑒于大部分典型脂肪酶都沒有水解PET聚酯的活性，這個底物對于特異性鑒定PET水解酶的貢獻可能非常有限。甚至在高通量的篩選中，使用這個底物會更傾向于分離出只有典型脂肪酶活性的“假陽性”菌株。

圖3 熒光分光光度法在檢測和篩選PET水解酶中的應(yīng)用(水溶性降解產(chǎn)物對苯二甲酸根離子(a)或者乙二醇(b)可以被轉(zhuǎn)化成熒光信號，PET水解酶可以水解熒光素的衍生物實現(xiàn)高通量活性篩選(c))

4 通過生物傳感器建立超高通量的酶篩選平臺

最新研究結(jié)果表明，建立針對PET水解產(chǎn)物TPA的生物傳感器可能成為一種實現(xiàn)超高通量篩選的方式[29]。通過生物工程技術(shù)改造的生物傳感器系統(tǒng)已被廣泛用于檢測小分子，包括轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors,TFs)、核糖體開關(guān)或酶偶聯(lián)傳感器裝置[90-92]。近兩年來，針對TPA的特異性生物傳感器的研究成果不斷出現(xiàn)[93-95]。

Pardo等[93]為了評估TPA在基因改造后的AcinetobacterbaylyiADP1菌株中的轉(zhuǎn)運，特別設(shè)計了一個由轉(zhuǎn)錄因子TphR和一個熒光報告系統(tǒng)組成的生物傳感器，如圖4(a)所示，這個生物傳感器包括來自Comamonastestosteroni的轉(zhuǎn)錄因子 TphR及其相關(guān)的核苷酸調(diào)節(jié)序列和超級折疊(superfolder)綠色熒光蛋白(sfGFP)。在Comamonastestosteroni中，TphR在與TPA結(jié)合后可以誘導(dǎo)菌株轉(zhuǎn)錄一個與TPA代謝相關(guān)的基因簇，從而可以將TPA轉(zhuǎn)化為原兒茶酸酯(protocatechuate)[96]。基于這個生物傳感器系統(tǒng)，通過流式細胞熒光分選技術(shù)(fluorescence activated cell sorting,FACS)篩選出了可以高效攝取環(huán)境中TPA的Acinetobacterbaylyi突變菌株。Pardo等[93]還提出這個基于TphR的生物傳感器可以應(yīng)用于篩選產(chǎn)生TPA作為降解產(chǎn)物的酶，如PET水解酶。迄今為止，對PET酶和MHET酶的篩選方法大多使用模式底物來代替PET，而直接應(yīng)用聚酯底物或者針對其降解產(chǎn)物的評估都僅限于低通量和耗時的分選方法。因此，Pardo等[93]認為這個生物傳感器可以結(jié)合優(yōu)化TPA攝入的ADP1突變體，從而建立一個針對大型突變體或者宏基因組文庫中PET酶和MHET酶基因的快捷高通量篩選方案。

第2個針對TPA的生物傳感器的研究成果由Li等[94]在2022年發(fā)表。他們通過對一個有混雜結(jié)合能力的轉(zhuǎn)錄因子——來自Pseudomonasputida的XylS的定向進化，構(gòu)建分別可以特異性結(jié)合鄰苯二甲酸酯(PA)和TPA的突變體。通過激活一個熒光報告蛋白(stGFP)的下游表達，構(gòu)建的大腸桿菌全細胞生物傳感器能夠?qū)Φ椭?0 μmol/L的PA或TPA進行熒光檢測(圖4(b))。為了驗證這個生物傳感器的功效，他們將它應(yīng)用于對一個鄰苯二甲酸酯酶GoEst15突變體文庫的篩選中，最終發(fā)現(xiàn)了相對于野生型提升了2倍以上特異性活性的突變體。基于這個結(jié)果，他們進一步推斷基于XylS的全細胞生物傳感器應(yīng)用于PET水解酶篩選的可能性，盡管文章中并沒有直接提供類似生物傳感器對于PET水解酶篩選的驗證和數(shù)據(jù)。

目前唯一一個直接檢測TPA作為酶水解PET產(chǎn)物的生物傳感器由Bayer等[95]在2022年發(fā)表。這個生物傳感器結(jié)合了來自海洋分枝桿菌Mycobacteriummarinum的羧酸還原酶(carboxylic acid reductase,CAR)和熒光素酶(luciferase,LuxAB)，提供快速表征PET水解酶和檢測降解產(chǎn)物TPA的工具(圖4(c))。來自Photorhabdusluminescens的熒光素酶LuxAB被引入大腸桿菌后可以利用該重組菌株檢測結(jié)構(gòu)多樣的醛類[92]。在本項工作中，CAR在大腸桿菌中把TPA轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醛類結(jié)合LuxAB發(fā)光，不僅可以半定量地檢測水解樣品中的TPA，而且適合作為評估PET水解酶活性的高通量篩選方法。此外，CAR催化的對苯二甲醛合成可以結(jié)合還原性級聯(lián)胺化反應(yīng)實現(xiàn)二胺的單鍋法合成，從而為TPA作為PET生物降解產(chǎn)物的升值轉(zhuǎn)化提供一種新的策略。

圖4 不同構(gòu)造的生物傳感器可以通過檢測TPA來篩選PET水解酶

生物傳感器的建立對于高通量篩選大型基因文庫中可產(chǎn)生TPA的酶(例如PET酶和MHET酶)具有重要價值。以上3種方案都沒有直接以實際篩選真實文庫作為驗證，所以它們在未來的實際應(yīng)用中都需要針對不同的實驗?zāi)康倪M一步優(yōu)化。對于不同的應(yīng)用場景，類似的生物傳感器要具有不同的敏感度。比如，篩選環(huán)境宏基因組需要高敏感度的生物傳感器，而用于篩選建立已知PET水解酶的定向進化文庫，使用低敏感度的生物傳感器可能會更快找到高活性的酶突變體。

Yoshida等[34]發(fā)現(xiàn)的I.sakaiensis是可以利用PET為碳源生長的菌株。它的存在表明，應(yīng)該有開發(fā)基于生長選擇模式的超高通量篩選PET酶的可能性。Pardo等[93]改造的ADP1菌株中通過引入Comamonassp.E6中的tph操縱子，使得ADP1菌株能夠利用TPA為唯一碳源生長。這表明，其他模式生物應(yīng)該可以通過類似的改造獲得利用TPA為唯一碳源生長的能力。例如，Clarkson等[97]通過對大腸桿菌的改造，使得菌株獲得了代謝原兒茶酸酯的能力，而后者是tph操縱子代謝TPA的產(chǎn)物。由于目前發(fā)現(xiàn)的高效PET水解酶都是來自于嗜熱性菌株或者高溫環(huán)境，而以生物傳感器為基礎(chǔ)的篩選方案一般都要使用溫和條件下生長的底盤細胞，因此如何針對高溫酶檢測將成為未來生物傳感器篩選方案研發(fā)的挑戰(zhàn)。

5 結(jié)論和展望

從2005年Müller等報道第一個PET水解酶到2016年Yoshida等在《Science》上報道了可以利用PET作為主要碳源的新型微生物大阪伊德氏桿菌，這11年間，酶水解PET聚酯一直是一個相對小眾的研究領(lǐng)域。在此之后，由于全球社會日益關(guān)注塑料廢棄物處理和污染物造成的環(huán)境危機，人們對微生物在塑料廢棄物降解回收方面的潛力和對解析相關(guān)酶解聚機制的興趣與日俱增。因此，發(fā)掘新型天然PET水解酶、用定向進化或理性設(shè)計等蛋白質(zhì)工程的手段優(yōu)化已知水解酶的解聚活性成為近年來的研究熱點。相比于人們對新型塑料水解酶的熱忱，在建立高效、快捷表征和篩選PET水解酶的方法學(xué)研究領(lǐng)域進展乏善可陳。為了達到工業(yè)化應(yīng)用水平，PET的酶促降解和回收需要高活性、穩(wěn)定性和對產(chǎn)物抑制效應(yīng)不敏感的酶，從而縮短降解時間并節(jié)約反應(yīng)成本。

目前報道的PET水解酶高通量篩選方案多是基于模式底物的形變(例如比濁法檢測納米顆粒降解)或者水解產(chǎn)物的生成(例如紫外/熒光分光光度法)，它們的可行性大部分只是在小規(guī)模篩選和特殊應(yīng)用場景下被驗證，并未被用于實際的高通量篩選。如果可以將目前這些方法的優(yōu)勢進行重新整合，有望在短期內(nèi)建立可以有效實施的篩選方法。例如，優(yōu)化基于PET納米顆粒的瓊脂平板檢測結(jié)合酸堿指示劑的使用，可以實現(xiàn)短時間內(nèi)篩選數(shù)以百萬計克隆的目標，從而有助于從環(huán)境宏基因組中發(fā)現(xiàn)新的PET水解酶骨架。另外，通過改良基于TPA檢測的生物傳感器，使大腸桿菌或其他模式生物的工程菌株細胞可以獲得以TPA為唯一碳源生長的能力，有助于建立基于生長選擇的超高通量檢測方法，這些將大大推動高效PET水解酶領(lǐng)域的研發(fā)進展。