基于網(wǎng)絡藥理學探討參麥注射液治療新型冠狀病毒肺炎的作用機制▲

劉本濤 李本杰 袁彩英 陳 睿, 杜 秀 王 翔

(1 廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西南寧市 530001； 2 廣西中醫(yī)藥大學賽恩斯新醫(yī)藥學院，廣西南寧市 530222； 3 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，廣西南寧市 530023)

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)是由新型冠狀病毒感染引起的急性肺炎，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳、氣促、乏力等，嚴重者會出現(xiàn)呼吸困難、急性肺損傷、心肝腎功能衰竭、呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克等，嚴重者甚至死亡[1-2]。新型冠狀病毒主要通過飛沫、親密接觸等途徑傳播，同時也存在氣溶膠傳播的可能[3-4]；其傳染性強，傳播速度快、范圍廣，且各類人群普遍易感，故嚴重危害人類健康和公共安全。

目前，臨床上尚未研制出治療COVID-19的特效藥，但是基于中醫(yī)藥的對癥和支持治療在COVID-19的防控中發(fā)揮了重要作用，這充分顯示了中醫(yī)藥的獨特優(yōu)勢[5]。自疫情發(fā)生以來，國家衛(wèi)生健康委員會推出并不斷更新COVID-19的診療方案，第三版診療方案開始納入中醫(yī)治療，第四版診療方案開始推薦使用中藥注射液。在《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[6]中，參麥注射液被推薦作為治療危重型內(nèi)閉外脫證患者的中成藥。

參麥注射液由紅參和麥冬兩味藥材組成，具有益氣養(yǎng)陰、復脈固脫之功效。該藥能明顯地降低支原體肺炎和重癥肺炎患者的炎癥水平[7-8]，增強呼吸機相關性肺炎、膿毒癥和腫瘤患者的免疫功能[9-11]，在疾病治療和預后改善中發(fā)揮重要作用。上述作用也可能是其治療COVID-19的潛在作用機制。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法篩選參麥注射液治療COVID-19的活性成分和作用靶點，進一步探索參麥注射液治療COVID-19的作用機制，以期為其用于治療COVID-19提供更多的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 參麥注射液化學成分和靶點的搜集 利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php)，針對參麥注射液中的主要成分紅參和麥冬進行檢索，同時結合相關文獻[12-13]，獲取參麥注射液的全部活性成分及其相關靶點，數(shù)據(jù)庫未收錄的活性成分則利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)在線預測其靶點。最后，對收集到的全部靶基因進行整理，并使用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)校正基因名稱。

1.2 參麥注射液治療COVID-19的作用靶點的獲取 在CTD數(shù)據(jù)庫(http://ctdbase.org/)中以“coronavirus”“pneumonia”和“COVID-19”為關鍵詞分別進行檢索，搜集與COVID-19相關的靶點；利用在線平臺Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)將上述疾病靶點與參麥注射液活性成分相關靶點進行取交集，篩選出的共同靶點即為參麥注射液治療COVID-19的作用靶點。

1.3 活性成分-作用靶點網(wǎng)絡的構建及分析 獲取參麥注射液治療COVID-19的作用靶點后，可進一步得到其對應的活性成分。將參麥注射液治療COVID-19的作用靶點及其對應的活性成分導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建參麥注射液治療COVID-19的活性成分-作用靶點網(wǎng)絡，網(wǎng)絡中節(jié)點代表成分或作用靶點，邊代表成分與靶點的相互作用。最后通過軟件的“Merge”功能將紅參、麥冬的活性成分-靶點網(wǎng)絡進行整合，并利用軟件的“Network Analyzer”功能對整合網(wǎng)絡進行網(wǎng)絡拓撲學屬性分析，獲取活性成分和作用靶點的度值。

1.4 蛋白-蛋白相互作用分析 針對參麥注射液治療COVID-19的作用靶點，采用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)進行蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析，物種限定為“Homo sapiens”，置信度設為>0.9，獲取PPI網(wǎng)絡。保存TSV格式的結果文件，從中獲取節(jié)點1、節(jié)點2和結合分數(shù)的相關信息，將結果文件導入Cytoscape 3.7.2軟件重新構建PPI網(wǎng)絡并進行網(wǎng)絡分析。計算網(wǎng)絡中每個靶點的度值，以度值設置節(jié)點大小及顏色，度值越高，節(jié)點越大、對應顏色越深；邊的粗細代表靶點間的作用強度，且與結合分數(shù)相關聯(lián)，結合分數(shù)值越大、邊越粗，靶點間相互作用越強。

1.5 功能和通路富集分析 將參麥注射液治療COVID-19的作用靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫(http://david.ncifcrf.gov/)中進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因組與基因百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，設定靶基因名稱為“Homo sapiens”，閾值P<0.01，根據(jù)涉及靶點數(shù)目的多少篩選排名靠前的生物過程及通路，并采用ImageGP在線平臺(www.ehbio.com/ImageGP/)對相關GO功能注釋結果進行可視化分析。

1.6 靶點-通路網(wǎng)絡的獲取 將參麥注射液治療COVID-19的作用靶點導入KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp)，限定物種為人，通過KEGG Mapper工具的“Search Pathway”功能獲取作用靶點涉及的相關通路并進行通路注釋，最終得到作用靶點-通路網(wǎng)絡。

2 結 果

2.1 參麥注射液的活性成分及相關靶點 共檢索到參麥注射液活性成分112個，其中紅參90個、麥冬22個，無共有成分；刪除重復項并經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫校正后共獲取活性成分相關靶點807個，其中紅參575個、麥冬427個，共有靶點195個。見圖1。

2.2 參麥注射液治療COVID-19的作用靶點 以“coronavirus”“pneumonia”和“COVID-19”為關鍵詞，在CTD數(shù)據(jù)庫中分別檢索到6 918個、34 364個和472個相關靶點，共有靶點472個，作為COVID-19的靶基因；將上述472個疾病靶點與807個參麥注射液活性成分相關靶點進行取交集，得到148個共同靶點，即為參麥注射液治療COVID-19的作用靶點。見圖1。

圖1 參麥注射液活性成分相關靶點(左圖)及其治療COVID-19的靶點(右圖)的韋恩圖

2.3 參麥注射液治療COVID-19的活性成分-作用靶點網(wǎng)絡構建 參麥注射液治療COVID-19的148個作用靶點可對應到94個活性成分，其中有101個作用靶點對應紅參的77個活性成分，有97個作用靶點對應麥冬的17個活性成分，二者共有作用靶點50個。運用Cytoscape 3.7.2軟件構建參麥注射液治療COVID-19的活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(見圖2)，發(fā)現(xiàn)參麥注射液治療COVID-19的活性成分主要包括皂苷、植物甾醇、高異黃酮、脂肪酸、多糖和揮發(fā)性成分，表明上述成分為參麥注射液在治療COVID-19時發(fā)揮藥效作用的物質基礎。圖中紅參的活性成分-作用靶點網(wǎng)絡包括179個節(jié)點(1味藥材、77個活性成分、101個作用靶點)和649條邊；麥冬的活性成分-作用靶點網(wǎng)絡包括115個節(jié)點(1味藥材、17個活性成分、97個作用靶點)和150條邊。網(wǎng)絡中同一活性成分可作用于不同靶點，同一靶點可對應多個成分，提示參麥注射液治療COVID-19具有多成分、多靶點協(xié)同作用的特點。

圖2 參麥注射液治療COVID-19的活性成分-作用靶點網(wǎng)絡

將紅參、麥冬的活性成分-作用靶點網(wǎng)絡整合后，利用“Network Analyzer”功能對整合網(wǎng)絡進行分析，獲取度值排名前25的活性成分及作用靶點，見表1。其中，薯蕷皂苷元、人參皂苷、三七皂苷、原人參三醇、人參炔三醇、β-欖香烯、豆甾醇等單一活性成分的度值較大，提示其可能為參麥注射液在治療COVID-19時發(fā)揮藥效的主要成分。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、信號傳導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、Na+/K+-ATP酶α1亞基(Na+/K+-ATPase alpha 1 subunit,ATP1A1)、纖維細胞生長因子1(fibroblast growth factor 1,FGF1)、熱休克蛋白90α家族 A類成員1(heat shock protein 90 alpha family class A member 1,HSP90AA1)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、白細胞介素2(interleukin 2,IL-2)、B細胞淋巴瘤2(B cell lymphoma-2,BCL2)L1、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)、溶質載體家族6成員4(solute carrier family 6 member 4,SLC6A4)、核受體共激活蛋白2(nuclear receptor coactivator 2,NCOA2)、細胞色素P450家族2亞家族C(cytochrome P450 family 2 subfamily C,CYP2C)19和CYP2C9等靶點分別與多個化學成分關聯(lián)，表明它們可能是參麥注射液治療COVID-19的重要作用靶點。

表1 參麥注射液治療COVID-19度值排名前25的活性成分與靶點

2.4 參麥注射液治療COVID-19的作用靶點的PPI網(wǎng)絡 將篩選所得的參麥注射液治療COVID-19的148個作用靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，設置置信度>0.9，得到PPI網(wǎng)絡；并將結果文件導入Cytoscape3.7.2軟件中重新構建PPI，見圖3。如圖3所示，STAT3、MAPK1、MAPK3、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,AKT)1、原癌基因Jun轉錄因子AP-1亞單位(Jun proto-oncogene,AP-1 transcription factor subunit,JUN)、腫瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、RELA、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、IL-6、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src,SRC)、Janus激酶(Janus kinase,JAK)、HSP90AA1、Caspase 8(CASP8)、VEGFA、EGFR等靶標蛋白在網(wǎng)絡中十分突出(即節(jié)點大、顏色深)，提示以上靶點可能是參麥注射液治療COVID-19的核心作用靶點。

圖3 參麥注射液治療COVID-19的作用靶點的PPI網(wǎng)絡

2.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析 將參麥注射液治療COVID-19的148個作用靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析共映射到顯著富集的GO 條目155個，包括生物過程120個、細胞組分15個和分子功能20個，采用ImageGP在線平臺對上述3個模塊中排名前10的條目進行可視化處理(見圖4)。結果顯示，生物過程主要涉及缺乏配體的外源性凋亡信號途徑、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄正調控、DNA損傷的內(nèi)源性凋亡信號途徑、神經(jīng)元凋亡過程、脂多糖介導的信號途徑、凋亡過程負調控、宿主共生體生長負調控、DNA模板轉錄、膠原分解代謝過程等；細胞組分主要涉及細胞外間隙、胞液、細胞核、質膜外側、核常染色質、黑素小體、膜筏、胞外基質、線粒體外膜、核仁等；分子功能主要涉及蛋白質異二聚活性、血紅素結合、蛋白質均聚活性、ATP結合、生長因子活性、同一蛋白結合、藥物結合、細胞因子活性、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、通道活性等。

圖4 GO基因功能注釋

KEGG通路富集分析共得到102個P<0.01的條目，取P值排名前30的通路繪制氣泡圖(見圖5)。結果顯示，參麥注射液治療COVID-19的作用靶點主要涉及乙型肝炎、癌癥信號通路、前列腺癌、弓形蟲病、恰加斯病/南美錐蟲病、癌癥相關蛋白多糖信號通路、TNF信號通路、低氧誘導因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)信號通路、胰腺癌、磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/AKT信號通路、利什曼病、麻疹、小細胞肺癌、結核病、甲型流感等多條信號通路。

圖5 KEGG通路富集分析

在GO基因功能注釋和KEGG通路富集分析中，涉及到的靶基因主要包括TNF、PTGS2、STAT3、FGF1、HSP90AA1、VEGFA、IL-2、BCL2L1、基質金屬蛋酶9、ESR1、SLC6A4、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)γ、細胞周期蛋白依賴性激酶4、NCOA2、CYP2C19、CYP2C9、MAPK1、MAPK3、AKT1、JUN、TP53、RELA、IL-6、PPARA、SRC、JAK、CASP8、EGFR等。

2.6 作用靶點-通路網(wǎng)絡分析 將參麥注射液治療COVID-19的148個作用靶點導入KEGG數(shù)據(jù)庫，利用KEGG Mapper工具獲取作用靶點涉及的相關通路并進行通路注釋，最終得到作用靶點-通路網(wǎng)絡，此網(wǎng)絡可更加準確、直觀地反映參麥注射液治療COVID-19的分子作用機制。經(jīng)數(shù)據(jù)庫分析，得到多個靶點-通路相互作用關系網(wǎng)絡，與病毒感染有關的通路包括人巨細胞病毒、甲型流感、麻疹、人乳頭瘤病毒感染、丙型肝炎、皰疹、小細胞肺癌、人T細胞白血病病毒1型感染、乙型肝炎、結核等。其中僅丙型肝炎涉及的靶點和通路中就包括了18個參麥注射液治療COVID-19的作用靶點(以紅色標記)和相關信號通路(包括JAK-STAT、TNF、PI3K-AKT、MAPK、PPAR等信號通路)，見圖6。

圖6 丙肝病毒感染涉及的作用靶點-通路網(wǎng)絡

3 討 論

COVID-19屬于中醫(yī)“疫”病范疇，病因為感受“疫戾”之氣，病位在肺。重癥者多在發(fā)病1周后出現(xiàn)呼吸困難和/或低氧血癥，嚴重者可進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒、凝血功能障礙、多器官功能衰竭等[6]。參麥注射液具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津的功效，臨床上常用于治療心力衰竭、休克、病毒性心肌炎、糖尿病等[12-14]，因此成為國家衛(wèi)生健康委員會推薦的抗疫藥物，用于危重型患者的治療。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法共篩選出參麥注射液治療COVID-19的作用靶點148個，可對應94個活性成分。活性成分中大部分屬于人參皂苷、麥冬皂苷和植物甾醇。其中，人參皂苷能夠解除機體免疫抑制，還具有心肌保護作用，可有效地改善心力衰竭患者的心功能[15-17]。麥冬皂苷可以提高心肌對缺氧的耐受性，并且降低心肌耗氧量，減輕缺氧對心肌的損傷[18]。豆甾醇和β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫調節(jié)、抗腫瘤和護肝等藥理活性[19-20]。以上提示參麥注射液可能通過免疫調節(jié)和抗炎作用治療COVID-19引起的炎癥和肺損傷。

通過對參麥注射液治療COVID-19的活性成分、作用靶點進行篩選，發(fā)現(xiàn)PTGS2、STAT3、FGF1、HSP90AA1、IL-2、BCL2L1等作用靶點的度值較高。研究顯示，PTGS2/環(huán)氧合酶-2是一種誘導酶，其表達與肺炎和肺損傷有關，抑制PTGS2表達可減輕炎性損傷[21-22]；FGF1具有促進組織器官的形態(tài)發(fā)生、損傷修復、血管生成和神經(jīng)細胞再生等作用[23]；STAT3、HSP90AA1和IL-2在調控腫瘤細胞增殖與凋亡中發(fā)揮重要作用[24-26]；BCL2可通過控制線粒體膜通透性來調節(jié)造血細胞和神經(jīng)細胞的凋亡，其過度表達會減少脂質氧化物的生成[27]。此外，本研究PPI網(wǎng)絡分析結果顯示，MAPK1、MAPK3、AKT1、JUN、TP53、RELA、TNF、IL-6、JAK、CASP8、EGFR等是PPI網(wǎng)絡中的核心靶點。MAPK家族在氧化應激、DNA損傷、癌癥發(fā)展和病毒感染等刺激下被激活[28]。AKT1能夠抗細胞凋亡，參與細胞凋亡和葡萄糖代謝等細胞過程[29]。JUN是核內(nèi)原癌基因c-Jun的編碼產(chǎn)物，c-Jun被各種細胞、炎癥因子激活后，可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力[30]。 抑制腫瘤壞死蛋白TP53的表達可減輕肺部炎癥和上皮細胞凋亡[31]。RELA可促進中性粒細胞由循環(huán)系統(tǒng)進入肺組織，加重炎癥反應。活化的中性粒細胞能夠分泌γ-干擾素、IL-6等炎性因子，促進TNF-α等趨化因子的表達[32]。CASP8可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲[33]。EGFR常表達于多種細胞的細胞膜上，病毒可利用EGFR介導的內(nèi)吞作用或信號傳導進入宿主細胞，并在細胞中復制，對抗宿主抗病毒反應[34]。由此可見，參麥注射液可能通過上述靶點在減輕機體炎癥、促進心肺功能和提高免疫功能等方面發(fā)揮治療作用。

GO功能富集分析顯示，參麥注射液治療COVID-19的作用靶點主要涉及與調控細胞凋亡和分解代謝等相關的生物過程。經(jīng)KEGG富集到的通路涉及病毒和細菌感染、免疫調節(jié)、腫瘤和炎癥等方面，其中以PI3K/AKT、TNF、HIF-1等信號通路最為重要。研究表明，PI3K/AKT信號通路參與細胞炎癥反應的調控，PI3K抑制劑對病毒性肺炎小鼠肺組織炎癥反應具有抑制作用；許多病毒能通過該通路來促使病毒蛋白表達、復制，并抑制宿主抗病毒反應[35-36]。TNF能直接殺傷腫瘤細胞且對正常細胞無明顯毒性，并可促進促炎因子的表達，參與全身炎癥反應[37]。HIF-1是一種轉錄因子，可作為氧穩(wěn)態(tài)的主要調節(jié)劑，HIF-1通路與病毒性肺炎的炎癥因子釋放有關[38-39]。這表明參麥注射液可能通過上述通路抑制病毒和機體的炎性反應，從而發(fā)揮治療COVID-19的作用。由作用靶點-通路網(wǎng)絡分析結果可知，參麥注射液治療COVID-19的分子作用機制涉及多條信號通路和相關靶點，作用機制復雜，這恰好與中醫(yī)的整體觀念和辨證論治相符合，從側面顯示出中醫(yī)藥在COVID-19的治療中具有獨特優(yōu)勢。

綜上所述，參麥注射液的活性成分可能主要是可能通過作用于PTGS2、AKT1、JUN、TP53、RELA、EGFR等靶點，調控PI3K/AKT、TNF、HIF-1等信號通路來抑制新型冠狀病毒和機體的炎癥反應、調節(jié)細胞凋亡和機體免疫功能，從而達到治療COVID-19的目的。但網(wǎng)絡藥理學存在一定局限性，還需進一步開展實驗研究驗證所得結論，從而為藥物的臨床應用提供更科學、有效的依據(jù)。