ICU醫(yī)院獲得性MRSA肺炎患者的菌株耐藥基因分析及利奈唑胺和萬古霉素的治療效果▲

房東東 楊逢永 李學軍 段崇浩 孫燕潔 亓永杰 劉 亮 楊興菊

(山東省濟南市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，山東省濟南市 271199)

醫(yī)院獲得性肺炎(hospital-acquired pneumonia，HAP)作為僅次于癌癥和腦血管疾病之后的第三大類致死病因，受到臨床的廣泛關(guān)注[1]。研究表明，金黃色葡萄球菌是HAP最常見的致病菌，在醫(yī)院獲得性感染致病菌中約占20%，且分離出的金黃色葡萄球菌中約60%是耐甲氧西林的菌株，即耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)[2-3]。近年來，隨著耐藥基因研究的深入，MRSA耐藥基因受到廣泛關(guān)注，但卻鮮見相關(guān)的系統(tǒng)分析報告。為此，本研究對MRSA的耐藥情況和耐藥基因進行了分析。

以往臨床上大多采用萬古霉素治療MRSA肺炎，療效尚可，但隨著多重耐藥金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)，MRSA肺炎的病死率逐漸升高[4]，這對HAP的治療提出了新的挑戰(zhàn)。利奈唑胺作為新一代全合成的噁唑烷酮類抗生素，其對MRSA等多種耐藥菌引發(fā)的HAP均有較好的療效[5]。為此，本研究比較了利奈唑胺與萬古霉素治療醫(yī)院獲得性MRSA肺炎的效果，旨在為臨床治療醫(yī)院獲得性MRSA肺炎提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取濟南市某三甲醫(yī)院ICU 2016年1月至2019年12月收治的410例繼發(fā)MRSA肺炎患者作為研究對象。納入標準：(1)HAP的診斷符合美國胸科協(xié)會制定的相關(guān)標準[6]；(2)痰培養(yǎng)及藥敏實驗結(jié)果顯示MRSA者；(3)年齡>18歲者。排除標準：(1)合并其他感染者；(2)合并惡性腫瘤或自身免疫性疾病者；(3)合并器官衰竭或休克者。采用隨機數(shù)字表法將患者分為對照組和觀察組，各205例。其中，對照組男性92例、女性113例，年齡22～65(43.52±10.24)歲；急性生理學與慢性健康狀況評分[3](20.68±6.04)分；觀察組男性95例、女性110例，年齡21～67(44.75±9.82)歲；急性生理學與慢性健康狀況評分(21.04±5.64)分。兩組患者的上述一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究通過我院醫(yī)學倫理審查委員會審核批準，并取得研究對象知情同意。

1.2 藥物敏感試驗及基因檢測

1.2.1 體外藥物敏感性試驗：采用紙片擴散法進行體外藥物敏感性試驗[7]，評估除MRSA菌株外，藥敏結(jié)果中對利奈唑胺、萬古霉素、替加環(huán)素、奎奴普汀、利福平、克林霉素、慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素、青霉素、苯唑西林、環(huán)丙沙星、頭孢西丁、復方磺胺甲噁唑等藥物的耐藥情況。

1.2.2 耐藥基因檢測：采集患者清晨痰液樣本1 mL，離心10 min后分離、純化，獲得菌株。取2～3個新鮮菌落溶解于200 μL無菌雙蒸水中，混勻配成細菌懸液，100 ℃煮沸10 min后置于碎冰中冷卻10 min，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液即可獲得細菌DNA模板。參照文獻[7]設(shè)計相關(guān)耐藥基因PCR引物，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系包括稀釋后的DNA模板2 μL、2×Power SYBR Green Master Mix 10 μL、上下游引物各1 μL，加蒸餾水至總體積20 μL。PCR擴增條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。得到反應(yīng)產(chǎn)物后進行基因測序。涉及的儀器和試劑包括7300定量PCR儀(美國ABI公司)，Gel DocXR凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，2% NaCl M-H瓊脂平板(法國生物梅里埃公司)，LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ(瑞士Roche公司)。

表1 PCR引物序列

1.3 治療方法和觀察指標

1.3.1 治療方法：所有患者均接受止咳化痰、調(diào)節(jié)電解質(zhì)平衡、營養(yǎng)支持等對癥支持治療。對照組患者靜脈滴注鹽酸去甲萬古霉素治療(華北制藥股份有限公司，國藥準字H13020286)，1.0 g/次，2次/d，連續(xù)治療14 d；觀察組則靜脈滴注利奈唑胺注射液(挪威 Pfizer AS，國藥準字H20110311)，600 mg/次，2次/d，連續(xù)治療14 d。

1.3.2 臨床療效的評估:(1)臨床有效率。① 痊愈，指患者臨床癥狀、體征消失，胸部X線、實驗室檢查及病原學等指標顯著改善，基本恢復正常；② 顯效，指臨床表現(xiàn)有明顯改善，但上述指標仍有1項未恢復正常；③ 有效，指臨床表現(xiàn)有所好轉(zhuǎn)，但不夠明顯；④ 無效，指藥物治療后臨床表現(xiàn)無改善甚至加重?？傆行?(痊愈+顯效+有效)例數(shù)/總例數(shù)×100%。(2)病原菌清除率。根據(jù)痰培養(yǎng)結(jié)果進行細菌學療效評估。完全清除，指痰培養(yǎng)結(jié)果細菌完全轉(zhuǎn)陰；未完全清除，指痰培養(yǎng)結(jié)果仍提示有MRSA?？偳宄?完全清除例數(shù)/總例數(shù)×100%。(3)治療期間醫(yī)院內(nèi)病死率。治療期間醫(yī)院內(nèi)病死率=死亡人數(shù)/總?cè)藬?shù)×100%。(4)不良反應(yīng)發(fā)生情況。包括惡心嘔吐、頭暈、腹瀉、蛋白尿、血小板減少、血肌酐異常、肝功能異常等。蛋白尿指24 h測定尿白蛋白>150 mg；血小板減少指血小板計數(shù)<1010/L；血肌酐異常：血肌酐水平>133 μmol/L；肝功能異常：谷草轉(zhuǎn)氨酶水平>50 U/L，谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平>45 U/L。

1.4 成本效果比分析 采用決策樹模型對MRSA肺炎治療中靜脈滴注利奈唑胺和萬古霉素的成本效果進行分析。決策樹模型如下圖1所示，當觀察組利奈唑胺治療無效或出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)，采取萬古霉素補救治療時視為治療失敗；同樣，當對照組萬古霉素治療無效或出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)，采取利奈唑胺補救治療時為治療失敗。將治療失敗視為治療終點。分析兩組患者治療的成本效果比(cost-effectiveness ratio，CER)，CER=期望成本/總有效率；計算增量成本效果比(incremental cost-effectiveness ratio，ICER)，ICER=(方案A期望成本-方案B期望成本)/(方案A治愈率-方案B治愈率)?？傆行?總有效人數(shù)/治療總?cè)藬?shù)×100%。

圖1 決策樹模型

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MRSA肺炎患者的菌株耐藥情況和耐藥基因檢測結(jié)果 410例繼發(fā)MRSA肺炎患者均未檢出對利奈唑胺、萬古霉素、替加環(huán)素耐藥。410株MRSA全部對青霉素耐藥，其中389株(94.88%)對苯唑西林耐藥，377株(91.95%)對頭孢西丁耐藥，46株(11.22%)對利福平耐藥，44株(10.73%)對復方磺胺甲噁唑耐藥，87株(21.22%)對環(huán)丙沙星耐藥，264株(64.39%)對四環(huán)素耐藥，171株(41.71%)對慶大霉素耐藥，255株(62.20%)對克林霉素耐藥，271株(66.10%)對紅霉素耐藥。188株(45.85%)同時對2種抗菌藥物耐藥，132株(32.20%)同時對3種或3種以上抗菌藥物耐藥。

β-內(nèi)酰胺類耐藥基因mecA、氨基糖苷修飾酶基因aac(6′)/aph(2″)、大環(huán)內(nèi)酯類23SrRNA甲基化酶基因ermA/C、四環(huán)素類核糖體保護蛋白基因tetM/K、喹諾酮類耐藥基因qnrA/B的檢出率分別為100.00%(410/410)、38.29%(157/410)、65.37%(268/410)、57.56%(236/410)、21.00%(86/410)。

2.2 兩組臨床療效及病菌清除率的比較 觀察組患者臨床治療總有效率為85.85%(176/205)高于對照組的78.05%(160/205)(χ2=4.221，P=0.040)；觀察組的病菌總清除率為52.68%(108/205)高于對照組的42.93%(88/205)(χ2=3.910，P=0.048)。見表2、表3。

表2 兩組患者的臨床療效的比較(n)

表3 兩組的病原菌清除率的比較(n)

2.3 兩組患者醫(yī)院病死率和不良反應(yīng)發(fā)生情況的比較 觀察組醫(yī)院病死率為1.46%(3/205)低于對照組的3.90%(8/205)，但差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.335，P=0.126)；觀察組不良反應(yīng)發(fā)生率為4.89%(10/205)低于對照組的14.63%(30/205)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=11.081，P=0.001)。見表4。

表4 兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生情況的比較(n)

2.4 利奈唑胺與萬古霉素治療MRSA肺炎的成本效果的比較 利奈唑胺治療MRSA肺炎的CER高于萬古霉素。相對于萬古霉素，首選利奈唑胺治療每提高1個單位總有效率需多花費31 321.41元。見表5。

表5 利奈唑胺與萬古霉素治療MRSA肺炎的成本效果的比較

3 討 論

我國HAP在院內(nèi)感染性疾病中占比較高，其致病菌中金黃色葡萄球菌占較大比重，近年臨床上時常發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌的存在[2]。MRSA耐藥現(xiàn)象給肺炎的治療帶來了極大困難，導致患者的病死率增高[8]。MRSA產(chǎn)生多重耐藥的原因是多方面的，包括本身耐藥基因或引入的外來耐藥基因的激活等[9]。因此，了解MRSA的耐藥基因，從基因水平研究MRSA對不同抗菌藥物的耐藥情況，有利于臨床合理選擇抗菌藥物，提高治療效果，降低HAP死亡率。

相關(guān)研究報告顯示，利奈唑胺和萬古霉素對MRSA肺炎均有較好的療效[5]。本文基于MRSA耐藥基因的特點，對比利奈唑胺與萬古霉素治療醫(yī)院獲得性MRSA肺炎的優(yōu)勢，為臨床合理選擇藥物治療該病提供參考。本研究結(jié)果顯示，濟南市某三甲醫(yī)院MRSA的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因mecA的檢出率為100.00%。mecA 基因是金黃色葡萄球菌通過轉(zhuǎn)座機測獲得的變異基因，其轉(zhuǎn)錄受mecⅠ、mecR1和mecR2基因的調(diào)控，三者相互作用影響mecA基因啟動，促進mecA基因表達，增強MRSA的耐藥性。MRSA菌株的耐藥性大部分是由mecA 基因介導的，因此在MRSA菌株中mecA 基因的檢出率極高，這與張利等[7]的研究結(jié)果相似。本研究中氨基糖苷修飾酶基因aac(6′)/aph(2″)的檢出率為38.29%。MRSA對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的原因主要是其本身含有編碼氨基糖苷類抗菌藥物修飾酶的耐藥基因，其中aac(6′)/aph(2″)基因最為重要，其通過對抗菌藥物分子的氨基或羥基進行修飾，使抗菌藥物與核糖體的親和力下降，從而產(chǎn)生耐藥性[10]。大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物耐藥與否主要取決于erm基因，erm基因是編碼核糖體甲基化酶的基因，可對細菌核糖體50S亞基23S rRNA進行特定核苷酸殘基甲基化，其通過改變大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的結(jié)合靶位，降低抗菌藥物的親和力，從而產(chǎn)生耐藥性[11]。本研究中，大環(huán)內(nèi)酯類23S rRNA甲基化酶基因ermA/C的檢出率為65.37%，四環(huán)素類核糖體保護蛋白基因tetM/K的檢出率為57.56%，喹諾酮類耐藥基因qnrA/B的檢出率為21.00%。四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥性主要取決于tetM基因，tetM基因編碼的因子可通過抑制細菌核糖體相關(guān)蛋白的表達而產(chǎn)生耐藥性，同時通過tetK基因編碼和膜蛋白介導，將藥物泵出膜外，降低藥物濃度，從而產(chǎn)生耐藥[12]，MRSA對氟喹諾酮類藥物耐藥與具有外排功能的qnrA/B蛋白密切相關(guān)，當qnrA/B基因高度表達時，qnrA/B蛋白表達增加，對喹諾酮類藥物的主動外排增加，進而產(chǎn)生耐藥性[13]。

本研究體外藥物敏感檢測結(jié)果顯示，410株 MRSA對青霉素、苯唑西林、頭孢西丁、四環(huán)素、克林霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星及復方磺胺甲噁唑等藥物均有不同程度的耐藥，其中多重藥物耐藥率高達32.20%，這表明MRSA的耐藥情況比較嚴重，但本研究未檢出對利奈唑胺、萬古霉素耐藥的MRSA菌株。多重耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生與抗菌藥物的交叉使用和濫用密切相關(guān)，臨床應(yīng)重視并嚴格控制抗生素的使用，合理用藥。

本文對比了利奈唑胺與萬古霉素治療醫(yī)院獲得性MRSA肺炎的療效，結(jié)果顯示，首選利奈唑胺治療的患者的總有效率為85.85%、病菌清除率為88.78%，均高于首選萬古霉素治療的患者(均P<0.05)。這表明，相比于萬古霉素治療，采用利奈唑胺治療醫(yī)院獲得性MRSA肺炎療效更佳。分析其原因可能為，利奈唑胺為新一代惡唑烷酮類抗生素，其可通過結(jié)合細菌核糖體上的50 S亞基，切斷核糖體和RNA的連接通道，阻止細菌蛋白質(zhì)的合成，從而發(fā)揮清除細菌的作用[14]。一方面，利奈唑胺分子量相對較小，穿透機體肺組織的能力較高，可廣泛作用于肺上皮細胞和肺組織中，能夠有效地清除肺部細菌；另一方面，由于細菌修飾酶、靶位修飾、主動外排等耐藥機制對利奈唑胺的影響較小，利奈唑胺自身不易誘導細菌耐藥，也不易與其他抗菌藥物產(chǎn)生交叉耐藥[15]。這些都使得利奈唑胺治療醫(yī)院獲得性MRSA肺炎的療效優(yōu)于萬古霉素。同時，采用利奈唑胺治療的患者的不良反應(yīng)發(fā)生率低于萬古霉素(P<0.05)，具有較好的安全性和用藥依從性。

本文采用決策樹模型對MRSA肺炎治療中靜脈滴注利奈唑胺和萬古霉素的成本效果進行分析，結(jié)果顯示，利奈唑胺治療的CER高于萬古霉素，雖然相對于萬古霉，首選利奈唑胺治療每提高1個單位總有效率需多花費31 321.41元，但模型所得ICER低于2019年人均國內(nèi)生產(chǎn)總值(>60 000元)[17]。根據(jù)WHO對藥物經(jīng)濟學中增量分析結(jié)果的推薦[17]，當ICER<人均國內(nèi)生產(chǎn)總值時，增加的成本完全值得。此外，由于萬古霉素治療導致的不良反應(yīng)較多，尤其是肝腎功能損害，為防治這些并發(fā)癥可能會增加更多的費用。因此，利奈唑胺作為治療MRSA重癥肺炎的一線用藥，具有較高的性價比。國外學者也報告，相較于萬古霉素，采用利奈唑胺治療醫(yī)院獲得性MRSA重癥肺炎的成本低、效果好[16]。這進一步提示臨床上可推薦利奈唑胺為治療MRSA肺炎優(yōu)先備選方案。

綜上所述，ICU醫(yī)院獲得性MRSA肺炎患者的菌株耐藥情況嚴重，耐藥基因的檢出率高，但未檢出對利奈唑胺和萬古霉素耐藥的MRSA菌株。相比于萬古霉素治療，采用利奈唑胺治療MRSA肺炎的病菌清除率高、不良反應(yīng)少、臨床療效和成本效果更優(yōu)，臨床上可推薦首選利奈唑胺治療MRSA肺炎。