薯蕷皂苷對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管重構(gòu)的影響及其機(jī)制

王建平 周青山

武漢大學(xué)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 湖北 武漢 430060

高血壓主要表現(xiàn)為動(dòng)脈血壓持續(xù)升高，是心肌梗死、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、腦卒中、心力衰竭等多種疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其病程進(jìn)展導(dǎo)致血管重構(gòu)，引起心、腦、腎、視網(wǎng)膜等多臟器靶器官損傷［1，2］。高血壓誘導(dǎo)的血管重構(gòu)病理生理學(xué)改變主要有：血管內(nèi)膜和中層增厚，外膜纖維化，血管張力和硬度增加；內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，血管炎癥激活；細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡［3?5］。改善高血壓誘導(dǎo)的血管重構(gòu)，可能為預(yù)防和治療高血壓及其并發(fā)癥提供理論基礎(chǔ)。

薯蕷皂苷是從中草藥植物中提取，具有抗腫瘤、抗炎、抗心肌肥厚、護(hù)腎、護(hù)肝等廣泛保護(hù)效應(yīng)［6，7］。既往大量研究證實(shí)：薯蕷皂苷抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，緩解肝臟、腎臟和腦等組織器官缺血/再灌注損傷［8?10］。在心血管疾病方面，薯蕷皂苷可改善阿霉素導(dǎo)致的心臟毒性損傷，改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［11］。而薯蕷皂苷在高血壓誘導(dǎo)的血管重構(gòu)中是否有保護(hù)作用尚不清楚。本研究將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，闡明薯蕷皂苷在血管緊張素誘導(dǎo)的血管重構(gòu)中作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物將40 只雄性C57BL/6 小鼠（清潔級(jí)，12 周齡左右）（購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）分為4組：生理鹽水灌胃組（Saline 組）、薯蕷皂苷灌胃組（Dioscin 組）、血管緊張素Ⅱ泵注+生理鹽水灌胃組（AngⅡ+Saline 組）、血管緊張素Ⅱ泵注+薯蕷皂苷灌胃組（AngⅡ+Dioscin），每組10 只小鼠。生理鹽水或薯蕷皂苷［80 mg/（kg·d）］（購(gòu)自美國(guó)Selleck 公司）連續(xù)灌胃7 d，再予以血管緊張素Ⅱ（購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司）［1 500 ng/（kg·d）］皮下泵注14 d。處死前，利用全自動(dòng)大小鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x（購(gòu)自澳大利亞PowerLab 公司），測(cè)量小鼠清醒靜息狀態(tài)下尾動(dòng)脈收縮壓（mmHg），取3 次有效測(cè)量數(shù)據(jù)取平均值。2%戊巴比妥鈉麻醉后處死小鼠，取胸主動(dòng)脈、心臟、血漿、腎臟，液氮處理后，-80 ℃冰箱保存。

1.2 蘇木素?伊紅（HE）染色取小鼠胸主動(dòng)脈后，4%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟后包埋和切片。石蠟切片二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，透明。蘇木紫染色10 min，洗滌后鹽酸乙醇分化，自來(lái)水沖洗15 min，伊紅染色3 min。脫水、透明、中性樹(shù)脂封片，顯微鏡觀察胸主動(dòng)脈大體形態(tài)。

1.3 Van Gieson 染色將石蠟切片脫蠟、水化，鐵蘇木紫染色10 min，洗滌后鹽酸乙醇分化。加入Van Gieson 染液染色5 min，95%乙醇分化，脫水、透明，封片。顯微鏡觀察胸主動(dòng)脈彈力纖維狀態(tài)。

1.4 組織免疫組化將小鼠胸主動(dòng)脈石蠟包埋組織切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，切片放入枸櫞酸?枸櫞酸鈉溶液（pH=7.4）微波爐加熱，進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS 洗3 遍；3% 過(guò)氧化氫溶液孵育10～15 min，阻斷組織內(nèi)源性過(guò)氧化物，PBS 洗3 遍；5%山羊血清室溫封閉1 h，PBS 洗3 遍；加入相應(yīng)一抗（PCNA，稀釋濃度1∶200；ICAM?1，稀釋濃度1∶150），4 ℃封閉過(guò)夜，PBS 洗3 遍；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫下孵育1 h，二氨基苯胺（DAB）避光顯色10 min。蘇木紫復(fù)染細(xì)胞核，乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，中性樹(shù)脂封片，普通顯微鏡拍攝，采用Image?pro Plus 軟件分析圖片，計(jì)算并統(tǒng)計(jì)PCNA 和ICAM?1 相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 組織免疫熒光小鼠胸主動(dòng)脈石蠟包埋組織切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，切片放入枸櫞酸?枸櫞酸鈉溶液（pH=7.4）微波爐加熱，進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS 洗3 遍；3%過(guò)氧化氫溶液孵育10～15 min，阻斷組織內(nèi)源性過(guò)氧化物，PBS 洗3 遍；5%山羊血清室溫封閉1 h，PBS 洗3 遍；加入相應(yīng)一抗（α?SMA，稀釋濃度1∶200；VCAM?1，稀釋濃度1∶150），4 ℃封閉過(guò)夜，PBS 洗3 遍；滴加藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的熒光二抗，室溫避光孵育1 h，PBS 洗3遍；二脒基?2?苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片，倒置熒光顯微鏡觀察，Image?pro Plus 軟件分析，計(jì)算并統(tǒng)計(jì)主動(dòng)脈組織VCAM?1 和α?SMA 相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn)全組織蛋白提取試劑盒提取組織蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，上樣后10%SDS?PAGE 膠電泳（80 V，0.5 h；110 V，1 h），將蛋白電泳轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，5% BSA 封閉2 h，TBST 洗膜3遍；相應(yīng)一抗（稀釋濃度1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 洗3 次后，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1.5 h，TBST 洗3 遍，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑曝光，Tanon 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)獲取蛋白條 帶，以GAPDH 為 內(nèi) 參，Gel?Pro Analyzer 4.0 軟件分析目的條帶灰度值。

1.7 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（MOVAS），細(xì)胞融合度達(dá)到50%，加入生理鹽水或薯蕷皂苷（200 ng/mL），孵育2 h。加入AngⅡ（1 μmol/L），繼續(xù)孵育24 h。提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western Blot 檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prsim5.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 薯蕷皂苷緩解血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管重構(gòu)見(jiàn)圖1。血管緊張素Ⅱ皮下泵注2 周成功誘導(dǎo)小鼠高血壓形成。與saline 組相比，AngⅡ+Saline組小鼠血壓顯著升高［分別為（154±6.01）mmHg和（113.36±6.68）mmHg，P<0.05）］。薯蕷皂苷灌 胃 干 預(yù) 后，與Ang Ⅱ+Saline 組 相 比，Ang Ⅱ+Disocin 組小鼠血壓下降［分別為（136.02±8.9）mmHg 和（154±6.01）mmHg，P<0.05）］（圖1C）。形態(tài)學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：血管緊張素Ⅱ皮下泵注成功誘導(dǎo)血管重構(gòu)，AngⅡ+Saline 組小鼠胸主動(dòng)脈HE 染色可見(jiàn)血管中層增厚，EVG 染色可見(jiàn)部分彈力纖維斷裂（圖1A 和1B）。與AngⅡ+Saline 組相比，AngⅡ+Dioscin 組小鼠胸主動(dòng)脈血管重構(gòu)明顯緩解，血管中層厚度降低（P<0.05），彈力纖維走行規(guī)整，未見(jiàn)斷裂（圖1A 和1B）。

圖1 薯蕷皂苷緩解血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管重構(gòu)

2.2 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常免疫組化和組織免疫熒光染色結(jié)果表明，與Saline 組相比，AngⅡ+Saline 組小鼠主動(dòng)脈組織ICAM?1 和VCAM?1 表達(dá)上調(diào)（P<0.05）（圖2），這提示血管緊張素Ⅱ刺激后，血管內(nèi)皮細(xì)胞功 能 異 常。與Ang Ⅱ+Saline 組 相 比，Ang Ⅱ+Dioscin 組小鼠主動(dòng)脈組織ICAM?1 和VCAM?1 表達(dá)下調(diào)（P<0.05）（圖2）。

圖2 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常

2.3 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化通過(guò)免疫組化和組織免疫熒光實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)：與Saline 組相比，AngⅡ+Saline 組小鼠主動(dòng)脈組織α?SMA 表達(dá)水平顯著下降（P<0.05），PCNA 表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。與AngⅡ+Sa?line 組相比，AngⅡ+Dioscin 組小鼠主動(dòng)脈α?SMA表達(dá)上調(diào)（P<0.05），PCNA 表達(dá)下調(diào)（P<0.05）（圖3A）。Western Blot 結(jié)果顯示：與Saline 組相比，AngⅡ+saline 組小鼠主動(dòng)脈發(fā)生顯著的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，收縮型標(biāo)記分子α?SMA 和cal?ponin1 表達(dá)下調(diào)（P<0.05），合成型標(biāo)記分子Vi?mentin 和PCNA 表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。與AngⅡ+Saline 組相比，AngⅡ+Dioscin 組主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化緩解，α?SMA 和calponin1 表達(dá)水平上調(diào)（P<0.05）（圖3B、3C、3D），Vimentin 和PCNA表達(dá)水平下降（P<0.05）（圖3B、3E、3F）。

圖3 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化

2.4 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管炎癥通路激活Western Blot顯示：與Saline 組相比，AngⅡ+Saline 組小鼠主動(dòng)脈組織磷酸化STAT1 和磷酸化IκBα 表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），提示血管重構(gòu)過(guò)程中炎癥通路激活。與AngⅡ+Saline 組相比，AngⅡ+Dioscin 組小鼠主動(dòng)脈組織磷酸化STAT1 和磷酸化IκBα 表達(dá)下調(diào)（P<0.05）（圖4）。

圖4 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管炎癥通路激活

2.5 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和炎癥通路激活 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)Western Blot 顯示：與Saline 組相比，AngⅡ+Saline組血管平滑肌細(xì)胞收縮型標(biāo)記分子α?SMA 表達(dá)下調(diào)（P<0.05），合成型標(biāo)記分子Vimentin 表達(dá)上調(diào)（P<0.05），提示血管緊張素誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化；炎癥通路激活相關(guān)分子磷酸化STAT1 和磷酸化IκBα 表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）。與AngⅡ+Saline 組 相 比，AngⅡ+Dioscin 組 小 鼠血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化緩解，磷酸化STAT1 和磷酸化IκBα 表達(dá)下調(diào)（P<0.05）（圖5）。

圖5 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和炎癥通路激活

3 討論

高血壓是由基因、環(huán)境因素、神經(jīng)?體液因子失衡、腎素?醛固酮系統(tǒng)過(guò)度激活、胰島素抵抗等眾多因素導(dǎo)致的全身阻力血管壓力持續(xù)升高（收縮壓≥140 mmHg 或舒張壓≥90 mmHg）。長(zhǎng)期高血壓導(dǎo)致血管重構(gòu)，血管重構(gòu)主要病理生理學(xué)改變包括：血管內(nèi)皮功能障礙，血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化增強(qiáng)，血管外膜纖維化，血管炎癥激活，膠原沉積，血管壁增厚，動(dòng)脈硬化，收縮/舒張功能異常，引起血管功能和結(jié)構(gòu)異常，最終導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)紊亂，心臟、腎臟、視網(wǎng)膜、腦等多臟器靶器官受損［4，12］。控制血壓和改善血管重構(gòu)是高血壓及相應(yīng)并發(fā)癥治療的重要措施。

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常是血管重構(gòu)發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。血管內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放多種細(xì)胞因子，參與血管張力維持、血管新生、炎癥反應(yīng)、血管通透性等多種病理生理學(xué)效應(yīng)的調(diào)節(jié)［13，14］。高血壓中，血管內(nèi)皮細(xì)胞舒血管因子如內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源超極化因子（EDH）、內(nèi)皮源性一氧化氮等合成減少，縮血管因子如內(nèi)皮素?1、血栓素A2 和超氧化物等釋放增加，血管持續(xù)收縮［15］。此外，高血壓發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)激活，內(nèi)皮細(xì)胞表面的細(xì)胞間黏附因子（血管細(xì)胞黏附分子?1、細(xì)胞間黏附分子?1、內(nèi)皮細(xì)胞選擇素等）表達(dá)上調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞分布和排列完整性破壞，血管通透性增加，易于炎癥細(xì)胞吸附、募集和遷移至血管壁［13，16］。薯蕷皂苷抑制TNF?α 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM?1、ICAM?1 和內(nèi)皮脂肪酶的表達(dá)［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷干預(yù)可緩解血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的主動(dòng)脈組織VCAM?1 和ICAM?1 表達(dá)上調(diào)，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能。

血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化在血管重構(gòu)中起重要作用。血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移能力增強(qiáng)，同時(shí)發(fā)生顯著的表型轉(zhuǎn)化，由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化，收縮表型標(biāo)記分子α?SMA、calponin1、smoothe?lin 和desmin 等表達(dá)下調(diào)，合成表型標(biāo)記分子Vimentin、OPN 和PCNA 等表達(dá)上調(diào)［4，18］。既往研究發(fā)現(xiàn)：薯蕷皂苷可通過(guò)抑制MAPK?FoxM1 通路，緩解頸動(dòng)脈損傷后內(nèi)膜增生［19］。我們動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：薯蕷皂苷可改善血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。

血管炎癥反應(yīng)激活在血管重構(gòu)中有著重要作用。血管重構(gòu)中，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，血管通透性增強(qiáng)，炎癥細(xì)胞吸附和遷移進(jìn)入血管壁，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和血管外膜成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)激活，釋放大量炎癥因子，進(jìn)一步加重內(nèi)皮損傷、血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移和表型轉(zhuǎn)化、外膜纖維化、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理生理學(xué)改變［16，20］。大劑量血管緊張素Ⅱ干預(yù)甚至誘導(dǎo)動(dòng)脈瘤/主動(dòng)脈夾層形成［21］。既往研究發(fā)現(xiàn)：薯蕷皂苷抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞TNF?α、IL?1β 和IL?6 分泌；同時(shí)，薯蕷皂苷抑制TLR4 通路，降低NF?κB 轉(zhuǎn)錄活性，改善腦缺血再灌注損傷［7］。我們研究發(fā)現(xiàn)：薯蕷皂苷干預(yù)可降低血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的主動(dòng)脈組織磷酸化STAT1 和磷酸化IκBα 表達(dá)水平，緩解主動(dòng)脈組織炎癥反應(yīng)。薯蕷皂苷可能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，改善內(nèi)皮功能，抑制炎癥細(xì)胞黏附；抑制血管平滑肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子釋放，緩解血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，維持血管彈性。薯蕷皂苷通過(guò)緩解血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞炎癥激活和改善平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，改善血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管重構(gòu)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)并初步證實(shí)薯蕷皂苷改善血管內(nèi)皮功能，抑制血管平滑肌表型轉(zhuǎn)化和血管炎癥通路激活，改善血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管重構(gòu)，為高血壓及其并發(fā)癥防治提供新的理論依據(jù)。本研究不足之處在于，薯蕷皂苷抗血管重構(gòu)具體靶點(diǎn)尚不清楚，需進(jìn)一步研究。