慢性腎臟病兔心肌跨壁復(fù)極離散及膜離子流變化的實驗研究

余 平 李 晴

武漢市第三醫(yī)院/武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院1急診科，2心肺功能科 湖北 武漢 430060

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）在我國發(fā)病患病均高，已經(jīng)成為一個重要的公共衛(wèi)生問題，我國CKD 患者總患病率接近10%［1］。隨著病程進展，CKD 患者會最終進展為終末期腎臟病，并常并發(fā)心血管疾?。?，3］。心、腎作為控制機體有效循環(huán)和血流動力學(xué)穩(wěn)定的兩個重要器官，生理和病理狀態(tài)均存在相互依存現(xiàn)象［4］。心肌損害會大幅增加死亡等不良預(yù)后的發(fā)生概率，比如心室肥厚缺血會引發(fā)心律失常進而增加心源性猝死的風(fēng)險。統(tǒng)計結(jié)果提示，在我國各種原因?qū)е碌淖笮氖曳屎瘛⑿牧λソ甙l(fā)生率近年來一直呈現(xiàn)升高趨勢；對于CKD 患者人群，早期評估心血管病變以及進行療效判斷提供更簡便、低創(chuàng)傷性的檢查以及輔助檢測方法愈發(fā)受到關(guān)注［5，6］。其中，心肌細胞電生理相關(guān)指標可以為表征心肌及心血管病變提供便捷無創(chuàng)的測量信息，相關(guān)研究則始于20 世紀50年代末。目前我們已經(jīng)明確急性心肌缺血以及左室肥厚等病理狀態(tài)下，可見跨壁復(fù)極離散度（TDR）增加［7］。心電圖Tp?Te 間期可以反映心室肌跨室壁復(fù)極離散度，而Tp?Te/QT 比值是校正后的Tp?Te 間期，排除心率影響后，這些指標可以較為真實地反映TDR 狀態(tài)［8］。希望基于此類指標檢測，可以為臨床醫(yī)師在CKD 心血管病變病程評估、療效判斷方面提供一種更為簡便、可行、無創(chuàng)的輔助檢查方法。

1 對象與方法

1.1 構(gòu)建兔慢性腎衰竭模型對照組（5 只）：將食用油以10 mL/（kg·d）給實驗動物定時、定量灌胃，全程正常飼養(yǎng)；每周內(nèi)眥靜脈采血1 mL 檢測血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血清肌酐（serum cre?atinine，Scr）及C?反應(yīng)蛋白（C?reactive protein，CRP）；至第6 周造模結(jié)束時，行心臟超聲檢測。CKD 組（5 只）：將3%腺嘌呤食用油溶液以10 mL/（kg·d）給大鼠定時、定量灌胃，1 次/d，共6 周；每周內(nèi)眥靜脈采血1 mL 檢測BUN、Scr 及CRP，至第6周造模結(jié)束，余飼養(yǎng)同對照組；心臟超聲檢測、HM/BM 和LVM/BM、心肌組織學(xué)形態(tài)檢測同對照組。以Scr 水平進行評估，Scr 水平均升高2～3 倍提示造模達標。

1.2 觀察指標及測量首先進行實驗動物心室肌細胞的分離與復(fù)鈣：制備膜片鉗的金屬電極為銀絲（鍍氯化銀），玻璃電極由硼酸鹽硬質(zhì)玻璃毛細管拉直而成（使用拉制儀多次拉制玻璃毛細管）；形成常規(guī)全細胞記錄模式，膜片鉗實驗由計算機、Clampex軟件、數(shù)據(jù)采集卡和膜片鉗放大器組成。完成電極尖端與細胞膜之間的巨阻抗封接，形成全細胞記錄狀態(tài)。隨后進行電生理學(xué)測定等。最后進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.1 不同時期、不同部位心肌病理觀察 HE 染色后使用光鏡觀察心肌細胞形態(tài)及病理改變。

1.2.2 心電圖測定 走紙速度為25 mm/s，電壓定標：1 mV/cm，測量胸前各導(dǎo)聯(lián)的Tp?Te 間期取平均 值，測 定 胸 前 導(dǎo) 聯(lián)Tp?Te 離 散 度（Tp?Ted）。Tp?Te 間期為T 波頂點至T 波終點。Tp?Te 離散度為胸導(dǎo)聯(lián)最大Tp?Te 間期與最小間期之差。

1.2.3 借助單相動作電位記錄技術(shù)分析心肌單相動作電位 研究中將心室楔形肌塊以細針固定于灌注槽底硅膠板上行主動脈逆行灌注，恒溫恒速下進行灌注（37 ℃，5 mL/min），30 min 內(nèi)測定和對比心肌細胞的靜息膜電位（RMP）、最大動作電位幅度（APA）和動作電位復(fù)極90%時程（APD90）。

1.2.4 使用膜片鉗技術(shù)觀察電解質(zhì)干預(yù)下膜離子流變化 分析鉀離子和鎂離子對膜離子流的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析使用pClamp8.0 軟件進行信號采集，Clampfit 8.0 進行數(shù)據(jù)和圖形分析處理。計數(shù)和計量資料資料檢驗分布特征后，使用對應(yīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗方法完成組間對比的統(tǒng)計學(xué)檢驗，統(tǒng)計學(xué)檢驗使用SPSS 軟件完成。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征及病理改變的觀察HE 染色后觀察心肌病理特征：光鏡下可見對照組心肌纖維整體排列清晰整齊；心肌細胞呈短柱狀，結(jié)構(gòu)完整，染色較均勻，心肌纖維紋理清晰，排列整齊，粗、細心肌纖維相間。CKD 組心肌纖維排列尚清晰；心肌細胞分布彌散，結(jié)構(gòu)尚完整，染色欠均勻，細胞核可見破碎、溶解，核兩端肌漿分散，并可見周圍心肌細胞與之相溶，心肌纖維呈波浪狀且排列紊亂，局部肌纖維可見空泡變性以及出血。詳見圖1 所示。

圖1 兩組實驗動物心肌病理改變特征

2.2 T 波 振幅、Tp?Te、Tp?Ted 與CKD 病期的關(guān)系CKD 組T 波振幅總水平低于對照組水平；CKD組Tp?Te 以及Tp?Ted 總水平均高于對照組（均為P<0.05）。CKD 組內(nèi) 不同病期對比，1～4 期T 波振幅高于5 期水平，Tp?Te 以及Tp?Ted 均低于5 期水平（均P<0.05）。詳見表1 所示。

表1 波振幅、Tp?Te、Tp?Ted 與CKD 病期的關(guān)系特征分析

此外，對心肌細胞RMP、APA 和APD90分布及變化進行分析，可見不同心肌細胞RMP、APA 和APD90基礎(chǔ)值差別未見統(tǒng)計學(xué)意義，如表2 所示。隨著時間點變化，CKD 組及對照的外膜層心肌細胞RMP、APA 和APD90變化趨勢變化可見逐漸表現(xiàn)更低或先升高后減低的不同，詳見圖2 所示。

圖2 外膜層心肌細胞RMP、APA 和APD90變化趨勢對比

表2 心室M 細胞及外膜層心肌細胞RMP、APA 和APD90 基礎(chǔ)值分布特征

2.3 鉀離子、鎂離子的影響作用分析本研究中浸浴液K+濃度為75 mmol/L 和145 mmol/L，實驗條件下達到鉀的平衡電位；當(dāng)膜電位高于此平衡電位后，電流可見轉(zhuǎn)成外向，但幅值很??；繼續(xù)增大膜電位后，電流幅值并不繼續(xù)增大。進一步觀察，細胞內(nèi)Mg2+濃度對內(nèi)向整流作用的影響：在無Mg2+浸浴液的條件下，I?V 曲線呈一準曲線，表明內(nèi)向整流作用不明顯。當(dāng)浸浴液含1 mmol/L Mg2+時，內(nèi)向電流無影響，而外向電流受到明顯抑制，從而出現(xiàn)明顯內(nèi)向整流特點。同時，本實驗證實，當(dāng)移去細胞內(nèi)Mg2+時內(nèi)向整流特性幾乎完全消失。

3 討論

近10 余年來，慢性腎臟病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)迅速增長，并已呈現(xiàn)流行趨勢，它不僅是原發(fā)性腎臟疾病，也可出現(xiàn)在高血壓、糖尿病等其他疾病的中、晚期階段［9］，我國有一線城市≥40歲人群的流行病學(xué)調(diào)查［10］顯示CKD 的發(fā)病率已達接近10%的水平。在CKD 患者中，由于神經(jīng)、體液、內(nèi)分泌、代謝等多方面的改變，可以出現(xiàn)包括心室收縮、舒張功能改變在內(nèi)的多種心臟受損的表現(xiàn)，或加重患者原有心臟病受損傷的程度。心力衰竭（heart failure，HF）也是常見的心臟損害表現(xiàn)，其不僅是許多心血管疾病發(fā)展的終末階段，也是心血管疾病患者的重要死亡原因之一［11?14］。

本研究中，我們對對照組及CKD 動物模型進行了觀察，光鏡下可見對照組心肌纖維整體排列清晰整齊；心肌細胞呈短柱狀，結(jié)構(gòu)完整，染色較均勻，心肌纖維紋理清晰，排列整齊，粗、細心肌纖維相間。CKD 組心肌纖維排列尚清晰；心肌細胞分布彌散，結(jié)構(gòu)尚完整，染色欠均勻，細胞核可見破碎、溶解，核兩端肌漿分散，并可見周圍心肌細胞與之相溶，心肌纖維呈波浪狀且排列紊亂，局部肌纖維可見空泡變性以及出血。另外，行心電圖檢測可見CKD 組T 波振幅總水平低于對照組水平；CKD 組Tp?Te 以及Tp?Ted 總水平均高于對照組（均P<0.05）。CKD 組內(nèi)不同病期對比，1～4 期T 波振幅高于5 期水平，Tp?Te 以及Tp?Ted 均低于5 期水平（均P<0.05）。提示存在CKD（心肌缺血）時，Tp?Te 間期和Tp?Ted 增大，Tp?Te 間期和Tp?Ted可作為反映跨壁復(fù)極離散度的無創(chuàng)性指標。

心室外膜、中層及內(nèi)膜層心肌細胞間存在電生理異質(zhì)性，而中層細胞具有APD 長、復(fù)極延緩的特性，心室不同層細胞間存在跨室壁復(fù)極不均一性，這一差異成為在病理條件下觸發(fā)后除極及折返性心律失常的主要原因［15?17］。本研究發(fā)現(xiàn)不同心肌細胞RMP、APA 和APD90基礎(chǔ)值差別未見統(tǒng)計學(xué)意義。隨著時間點變化，CKD 組及對照組的外膜層心肌細胞RMP、APA 和APD90變化趨勢變化可見逐漸表現(xiàn)更低或先升高后減低的不同。本研究進一步對相關(guān)機制進行了探索，浸浴液K+濃度為75 mmol/L 和145 mmol/L，實驗條件下達到鉀的平衡電位；當(dāng)膜電位高于此平衡電位后，電流可見轉(zhuǎn)成外向，但幅值很?。焕^續(xù)增大膜電位后，電流幅值并不繼續(xù)增大。說明該離子流為K+攜帶，成內(nèi)向整流，與文獻報道一致。進一步觀察到，細胞內(nèi)Mg2+濃度對內(nèi)向整流作用的影響：在無Mg2+浸浴液的條件下，I?V 曲線呈一準曲線，表明內(nèi)向整流作用不明顯。當(dāng)浸浴液含1 mmol/L Mg2+時，內(nèi)向電流無影響，而外向電流受到明顯抑制，從而出現(xiàn)明顯內(nèi)向整流特點。內(nèi)向整流作用相關(guān)機制一方面與“門的電壓依賴性”去激活作用有關(guān)，另一方面與細胞內(nèi)鎂離子等對激活門的阻滯作用緊密關(guān)聯(lián)。IKATP敏感性鉀通道（IKATP）等鉀通道的內(nèi)向整流作用均表現(xiàn)出細胞內(nèi)Mg2+濃度依賴性。同時，本實驗證實，當(dāng)移去細胞內(nèi)Mg2+時內(nèi)向整流特性幾乎完全消失。

綜上所述，CKD 兔心肌跨壁復(fù)極離散的變化對心電圖T 波的形態(tài)有重要影響；希望基于此可以為臨床醫(yī)師在CKD 心血管病變病程評估、療效判斷方面提供一種更為簡便、可行、無創(chuàng)的輔助檢查方法。