烏司他丁聯(lián)合右美托咪定對感染性休克大鼠的抗炎作用

霍 苗 張 倩 楊 光 鄭星星 徐瑞芬

陜西省人民醫(yī)院 1麻醉科，2燒傷整形美容醫(yī)學(xué)外科 陜西 西安 710068

感染性休克是由病原微生物及其毒素等產(chǎn)物所引起的膿毒病綜合征，以抗感染、抗休克為主要治療手段。烏司他丁為常用的廣譜蛋白酶抑制劑，可用于感染性休克患者的治療，雖然可在一定程度上改善患者的臨床癥狀，但多數(shù)患者預(yù)后不理想［1，2］。而右美托咪定可抑制交感神經(jīng)去甲腎上腺素釋放，降低體內(nèi)內(nèi)源性兒茶酚胺濃度，改善血流動力學(xué)，增加感染性休克患者對外源性血管活性藥物的敏感性［3，4］。本研究建立感染性休克模型，并使用烏司他丁、右美托咪定干預(yù)，探究二者聯(lián)合應(yīng)用對感染性休克的作用，為臨床上感染性休克的治療提供新方向。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料實驗動物：選取75 只健康SD 大鼠，由凱學(xué)生物科技（上海）有限公司提供。鼠齡3～10 個月，體質(zhì)量200～250 g，飼養(yǎng)溫度為22～25 ℃，室內(nèi)濕度35%～40%，飼養(yǎng)室定時進(jìn)行紫外線照射消毒。統(tǒng)一給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，允許自由活動，飼養(yǎng)時間為1 周。本研究實驗獲得陜西省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

主要試劑來源：小鼠抗大鼠腫瘤壞死因子?α（tu?mor necrosis factor?α，TNF?α）、白細(xì)胞介素（interleu?kin，IL）?1、IL?6 一 抗 和 二 抗（美 國Affinity 抗 體 公司），PBST 洗滌劑（美國Agdia 公司），鱟試劑［湛江安度斯生物有限公司，批號：（94）衛(wèi)藥準(zhǔn)字SJ?01］，烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字H20040505，規(guī)格1 mL、5 萬單位），右美托咪定（江蘇恩華醫(yī)藥股份有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字H20110085，規(guī)格：2 mL∶200 μg）。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組 選取75 只中的15 只作為A組，其余60 只大鼠均參照參考文獻(xiàn)［5］建立感染性休克大鼠模型，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，暴露右側(cè)腹股溝，游離右側(cè)股動脈，結(jié)扎遠(yuǎn)端，近端插入聚乙烯導(dǎo)管，連接動脈測壓裝置，持續(xù)監(jiān)測平均動脈壓。游離右側(cè)股靜脈，插入聚乙烯導(dǎo)管，股靜脈給予10 mg/kg 脂多糖（LPS）。暴露背部皮膚，分離脊斜肌，置于顯微鏡下觀察微循環(huán)血流，持續(xù)滴入生理鹽水保持脊斜肌表面濕潤。用正置熒光顯微鏡+定量熒光比率成像測量系統(tǒng)軟件行每次30 min 錄像采集局部微循環(huán)圖像，待平均動脈壓降至初始血壓2/3 時，脈壓<20 mmHg 即為造模成功，在建模成功后拔除動靜脈導(dǎo)管。最終建模成功55 只，分 為B 組（15 只）、C 組（14 只）、D 組（13只）、E 組（13 只）。

1.2.2 藥物干預(yù) 建模成功后，C 組腹腔注射20 μg/g 烏司他??；D組腹腔注射100 μg/kg 右美托咪定；E 組大鼠腹腔注射20 μg/g 烏司他丁+100 μg/kg 右美托咪定。A 組、B 組大鼠腹腔注射20 μg/g 生理鹽水。給藥6 h 后觀察大鼠疾病變化，在給藥干預(yù)過程中B 組5 只大鼠因感染加重死亡。

1.2.3 切片及染色 所有大鼠在禁食和禁水后，行斷頭處死，立即取心肌組織，使用40 mL/L 的多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋，制作5 μm 心肌組織切片，HE 染色，觀察。

1.2.4 心功能及血壓檢測 均行頸部手術(shù)，分離右側(cè)頸總動脈插管，連接生物機能實驗系統(tǒng)記錄心率（HR）、頸總動脈收縮壓（SBP）、舒張末期壓力（DBP）、脈壓差以及最大上升/下降速率（±dp/dt?max），重復(fù)測量3 次，取平均值。

1.2.5 內(nèi)毒素檢測 分別取頸總動脈和門靜脈血在抗凝管中保存待用，使用顯色鱟試劑定量測定法測定，并做好記錄，重復(fù)測量3 次，取均值。

1.2.6 炎癥指標(biāo)、感染性標(biāo)志物水平檢測 取各組大鼠尾部靜脈血3 mL，以離心半徑為5 cm、以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心處理10 min，分離上層血清，-80 ℃保存，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測大鼠炎癥指標(biāo)TNF?α、IL?1、IL?6、感染性標(biāo)志物降鈣素原（procalcitonin，PCT）、C?反應(yīng)蛋白（C?reactive protein，CRP）、前白蛋白（prealbumin，PA）、癌蛋白TRE 水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件包統(tǒng)計分析處理。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，三組間比較采用F檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察如圖1 所示，A 組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常無任何損傷；B 組大鼠心肌細(xì)胞變性，實質(zhì)紊亂，有嗜酸細(xì)胞質(zhì)，核染色過深；C 組、D 組及E 組大鼠休克導(dǎo)致的心肌損傷均減弱，其中E 組大鼠心肌損傷減弱程度最為明顯。

圖1 5 組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)HE 染色照片（×200）

2.2 各組大鼠一般癥狀觀察建模成功后至給藥結(jié)束，A 組大鼠無死亡，體溫正常；B 組大鼠因感染加重死亡5 只，體溫顯著升高，眼睛無神、暗淡，毛色無光澤，活動遲緩，無進(jìn)食；C 組大鼠死亡2 只、D 組大鼠死亡1 只、E 組大鼠死亡1 只，C、D、E 三組大鼠體溫相比B 組均有所降低，但仍高于A 組，毛色恢復(fù)光澤，活動量增加，進(jìn)食逐漸恢復(fù)正常，但E 組大鼠癥狀改善最為明顯。最后A 組15 只、B 組10 只、C組12 只、D 組12 只、E 組12 只用于后續(xù)指標(biāo)檢測。

2.3 各組大鼠心功能及血壓的變化比較如表1所示，B 組、C 組、D 組、E 組大鼠心功能及血壓各指標(biāo)均低于A 組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；E 組大鼠各指標(biāo)均高于C 組、D 組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；C 組、D 組各指標(biāo)比較，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

表1 各組大鼠心功能及血壓的變化比較(-x±s)

2.4 各組內(nèi)毒素濃度對比如表2 所示，B 組、C組、D 組、E 組大鼠各指標(biāo)含量高于A 組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；E 組各指標(biāo)含量低于C 組、D 組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；C 組、D 組比較，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

表2 各組內(nèi)毒素含量對比(±s)

表2 各組內(nèi)毒素含量對比(±s)

aP<0.05，與A 組相比；bP<0.05，與B 組相比；cP<0.05，與C 組相比；dP<0.05，與D 組相比

組別A 組B 組C 組D 組E 組FP例數(shù)15 10 12 12 12--門靜脈內(nèi)毒素（EU/mL）0.10±0.01 0.26±0.05a 0.16±0.11ab 0.17±0.12ab 0.12±0.02abcd 5.085<0.005動脈內(nèi)毒素（EU/mL）0.04±0.01 0.19±0.05a 0.12±0.11ab 0.13±0.10ab 0.07±0.02abcd 7.628<0.005

2.5 各組炎癥指標(biāo)、感染性標(biāo)志物比較如表3 所示，B 組、C 組、D 組、E 組TNF?α、IL?1、IL?6、PCT、CRP 水平高于A 組，PA、TRE 水平低于A 組，具有統(tǒng) 計 學(xué) 差 異（P<0.05）；E 組TNF?α、IL?1、IL?6、PCT、CRP 水平均低于C 組、D 組，PA、TRE 水平均高于C 組、D 組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；C 組、D 組比較，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

表3 各組大鼠炎癥指標(biāo)、感染性標(biāo)志物比較(±s)

表3 各組大鼠炎癥指標(biāo)、感染性標(biāo)志物比較(±s)

aP<0.05，與A 組相比；bP<0.05，與B 組相比；cP<0.05，與C 組相比；dP<0.05，與D 組相比

組別A 組B 組C 組D 組E 組FP例數(shù)15 10 12 12 12--TNF?α（ng/L）51.25±5.13 216.35±22.64a 125.25±13.68ab 126.64±13.64ab 70.25±7.62abcd 11.594<0.005 IL?1(ng/L)10.25±1.03 25.46±3.13a 18.72±2.22ab 18.69±2.19ab 14.62±2.25abcd 10.076<0.005 IL?6(ng/L)21.24±2.00 65.23±6.92a 40.12±4.68ab 40.23±4.62ab 32.16±3.02abcd 21.054<0.005 PCT（ng/mL）1.25±0.32 28.96±2.46a 11.25±1.13ab 11.06±1.25ab 3.25±0.24abcd 26.937<0.005 CRP（mg/L）25.25±1.20 85.26±8.96a 41.35±4.52ab 41.25±4.16ab 35.26±3.02abcd 17.660<0.005 PA（mg/L）354.25±35.46 201.55±20.46a 284.36±28.26ab 285.49±28.24ab 312.25±31.65abcd 4.807<0.005 TRE（g/L）3.89±1.05 1.45±0.25a 2.04±0.34ab 2.03±0.36ab 2.62±0.54abcd 5.700<0.005

3 討論

感染性休克疾病較為嚴(yán)重，若不能采用及時有效的措施對此類患者進(jìn)行救治，可引發(fā)患者多器官持續(xù)低灌注，進(jìn)而使得機體多器官衰竭，最終導(dǎo)致死亡的發(fā)生［6］。

烏司他丁是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，具有抑制炎性因子分泌的作用，還能夠使多種水解酶的活性下降［7］。有學(xué)者在研究中表示，烏司他丁能夠抑制機體氧自由基的生成以及抑制炎癥因子的表達(dá)和分泌［8］。右美托咪定作為一種廣譜的相對選擇性α2?腎上腺素受體激動劑，能夠抑制去甲腎上腺素的釋放以及炎性因子的分泌，具有一定的調(diào)節(jié)免疫功能以及抑制炎癥反應(yīng)的作用［9，10］。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏司他丁聯(lián)合右美托咪定可修復(fù)感染性休克大鼠心肌損傷，減少心肌損害。

目前研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素為感染性休克的主要致病因子，其主要化學(xué)本質(zhì)為脂多糖，經(jīng)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，誘發(fā)機體細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎癥因子生成，引發(fā)機體全身性過度炎癥反應(yīng)綜合征［11，12］。本文研究結(jié)果證實，E 組大鼠門靜脈、動脈內(nèi)毒素含量均下降，說明烏司他丁聯(lián)合右美托咪定能降低內(nèi)毒素水平，控制感染。臨床研究顯示，感染性休克發(fā)生后由于組織灌注不足和病原微生物等刺激，多種炎癥因子和炎性介質(zhì)通常呈現(xiàn)“瀑布式”生成和釋放，并迅速浸潤、擴散，TNF?α、IL?1、IL?6 等炎癥因子會在機體循環(huán)中出現(xiàn)并迅速達(dá)到最高峰［13，14］。且感染性休克發(fā)生后機體感染性標(biāo)志物水平表現(xiàn)為異常表達(dá)，其主要體現(xiàn)在正性、負(fù)性急性期蛋白水平異常，其中PCT、CRP 為正性急性期蛋白，PA、TRE 為負(fù)性急性期蛋白，其中PCT、CRP 在感染后表達(dá)出現(xiàn)持續(xù)升高趨勢，PA、TRE 在感染后表達(dá)出現(xiàn)持續(xù)下降趨勢［15］。本文研究結(jié)果顯示，E 組大鼠機體炎癥、感染性標(biāo)志物水平顯著降低，此結(jié)果說明，烏司他丁聯(lián)合右美托咪定兩者可協(xié)同作用，起到抗炎癥、抗感染的作用。

綜上所述，烏司他丁聯(lián)合右美托咪定能改善感染性休克大鼠血壓、心功能水平，通過降低體內(nèi)內(nèi)毒素的含量，調(diào)控TNF?α、IL?1、IL?6 表達(dá)起到抗炎作用，抑制正性、負(fù)性急性期蛋白起到抗感染作用。