基于SNP 芯片分析鑒定大白豬、長(zhǎng)白豬與杜洛克豬的品種成分

牛安然，張 興，楊雨婷，閆之春，龔華忠，丁偌楠,4，馬 黎,4

（1.新希望六和養(yǎng)豬研究院數(shù)據(jù)與算法實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610095；2.新希望六和養(yǎng)豬研究院，山東青島 266100；3.新希望六和育種事業(yè)部，四川成都 610095；4.德州市現(xiàn)代生豬養(yǎng)殖技術(shù)創(chuàng)新中心，山東德州 263000）

近年來(lái)，為了提高我國(guó)生豬遺傳進(jìn)展，許多國(guó)內(nèi)大型養(yǎng)豬公司提出了在公司內(nèi)部廣泛開(kāi)展場(chǎng)間聯(lián)合育種的方案[1-3]。場(chǎng)間聯(lián)合育種的首要條件是保證參與聯(lián)合育種的種豬均為純品種。為了保證聯(lián)合育種中種豬的品種純度，美國(guó)國(guó)家種豬登記協(xié)會(huì)（The National Swine Registry，NSR）聯(lián)合密歇根州立大學(xué)于2009 年開(kāi)始推廣基于DNA 的種豬品種成分驗(yàn)證。NSR 明確要求所有進(jìn)入美國(guó)全國(guó)種豬育種排名的豬只必須提交組織樣本以驗(yàn)證其品種成分，同時(shí)建立了用于進(jìn)行種豬品種成分驗(yàn)證的大白豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克豬和漢普夏豬的品種參考群[4-6]。同NSR 要求一致，加拿大種豬注冊(cè)協(xié)會(huì)（Canadian Swine Breeders Association，CSBA）和丹育國(guó)際（DanBred）也均要求在對(duì)純種豬進(jìn)行登記計(jì)算育種值時(shí)，提供種豬的基因信息以便進(jìn)行品種核對(duì)[7-8]。

目前，群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析方法主要包括：系統(tǒng)發(fā)育研究[9-12]、主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）研究[5-6,13-15]和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[16-17]。NSR 主要采用PCA 對(duì)豬只的品種成分進(jìn)行驗(yàn)證區(qū)分[4-6,11-15]，但是該方法無(wú)法展示豬只的血統(tǒng)組成。遺傳結(jié)構(gòu)分析不僅可以對(duì)豬只品種進(jìn)行劃分，還可以展示其血統(tǒng)組成[16-17]。因此，本研究對(duì)四川省某豬場(chǎng)大白豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克豬進(jìn)行PCA 和遺傳結(jié)構(gòu)分析，以證明PCA 和遺傳結(jié)構(gòu)分析可在實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)豬只的品種成分進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，有效保證核心育種群的品種純度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自四川省某豬場(chǎng)，共計(jì)5 723個(gè)樣本，其中包括杜洛克豬919 頭，長(zhǎng)白豬392 頭，大白豬4 412 頭。這些樣本均在采集豬耳組織樣本后，使用酚-氯仿法提取DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)量符合分析標(biāo)準(zhǔn)后，送至上海紐勤生物技術(shù)有限公司采用固相Illumina 50K 芯片進(jìn)行SNP 基因型分型。在對(duì)5 723 個(gè)樣本進(jìn)行耳組織采樣的同時(shí)，觀察記錄每個(gè)個(gè)體的被毛顏色及耳型，對(duì)每個(gè)個(gè)體進(jìn)行基于表型評(píng)定的品種鑒定[4-5]。

1.2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 將紐勤生物公司返回的數(shù)據(jù)采用Plink（V1.90）軟件進(jìn)行合并及質(zhì)量控制。質(zhì)量控制條件如下：1）刪除未知區(qū)域和位于性染色體上的SNP位點(diǎn)；2）SNP 位點(diǎn)檢出率高于0.95；3）樣本檢出率高于0.95；4）次要等位基因頻率高于0.01；5）刪除顯著偏離哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)的SNP 位點(diǎn)，即P>10-6；6）依據(jù)連鎖不平衡分析去除冗余位點(diǎn)，參數(shù)為窗口50個(gè)SNPs，每次步移10 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，R2的閾值為0.1。

1.3 PCA 分析 使用GCTA（V1.93.2）軟件對(duì)通過(guò)質(zhì)控的樣本群體進(jìn)行PCA，以確認(rèn)群體結(jié)構(gòu)并采用R 對(duì)最終分析結(jié)果進(jìn)行繪圖。GCTA 軟件可以通過(guò)計(jì)算樣本群體遺傳關(guān)系矩陣（Genetic Relationship Matrix，GRM）特征向量，來(lái)分析樣本群體內(nèi)部的群體結(jié)構(gòu)[18]。估算GRM 需計(jì)算成對(duì)個(gè)體間的遺傳關(guān)系，具體計(jì)算公式如下：

其中，|S|是樣本SNPs 的數(shù)量，個(gè)體i 在第s 個(gè)SNP 位點(diǎn)的基因型值為Xis，是SNP 樣本的等位基因的平均頻率，|N|是樣本個(gè)體的數(shù)量[19]。

1.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 采用ADMIXTURE（V1.3.0）軟件對(duì)通過(guò)質(zhì)控的樣本群體進(jìn)行K=1～5 的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，并計(jì)算不同K 值下的交叉驗(yàn)證的預(yù)測(cè)錯(cuò)誤，使用R 對(duì)最終分析結(jié)果進(jìn)行繪圖。ADMIXTUR 主要利用最大似然法從多位點(diǎn)SNP 基因型數(shù)據(jù)集對(duì)樣本群體進(jìn)行個(gè)體祖先的快速估計(jì)。該軟件采用了與STRUCTURE相同的統(tǒng)計(jì)模型[17]對(duì)樣本群體的群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.5 群體間遺傳分化分析 采用GCTA（V1.93.2）軟件計(jì)算不同群體間的固定指數(shù)（Fixation index，F(xiàn)st）并進(jìn)行群體間遺傳分化分析。GCTA 主要采用無(wú)偏估計(jì)Fst 的方法計(jì)算每對(duì)等位基因的頻率變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同群體間分化程度的評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 表型統(tǒng)計(jì)結(jié)果及基因型數(shù)據(jù)質(zhì)控 本研究對(duì)5 723個(gè)樣本采用Illumina 50K 基因芯片進(jìn)行基因型分型，原始數(shù)據(jù)共包含50 697 個(gè)位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)質(zhì)控，共有21 894個(gè)SNP 位點(diǎn)和5 664 個(gè)個(gè)體通過(guò)篩選，其中包含杜洛克豬917 頭，長(zhǎng)白豬389 頭，大白豬4 358 頭。進(jìn)行過(guò)耳組織樣本采集的5 723 個(gè)個(gè)體均有效記錄了個(gè)體被毛顏色及耳型特征。該樣本群體中的個(gè)體未出現(xiàn)毛色混雜的情況，被毛顏色及耳型均符合品種特征（表1）。由于該豬場(chǎng)自引種后一直實(shí)施閉鎖繁育長(zhǎng)達(dá)8～9 個(gè)世代，且不進(jìn)行品種間的遺傳交換。通過(guò)引種群后代的表型記錄可知，大白豬、長(zhǎng)白豬和杜洛克豬引種群后代的表型均符合基本的品種特征。因此，可以確認(rèn)該豬場(chǎng)最初的引種群體為純品種，且其后代也均為大白豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克豬的純品種個(gè)體。

表1 大白、長(zhǎng)白、杜洛克豬測(cè)定數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

2.2 PCA 分析結(jié)果 采用PCA 品種成分鑒定方法，對(duì)5 664 個(gè)樣本進(jìn)行品種驗(yàn)證。5 664 個(gè)樣本群體的PCA 分析結(jié)果顯示，主成分1 和主成分2 分別占總變異的4.63%和2.69%，并且碎石圖在主成分3 出現(xiàn)拐點(diǎn)（圖1）。PCA 分析的可視化結(jié)果表明，主成分1 可依照3 個(gè)品種間的遺傳差異，在混合樣本群體中準(zhǔn)確地將長(zhǎng)白、大白、杜洛克豬區(qū)分為3 個(gè)亞群（圖2A、B）。主成分2將樣本群體中的長(zhǎng)白群體與大白及杜洛克劃分為2 個(gè)亞群，但未能依照品種間的遺傳差異對(duì)大白和杜洛克群體進(jìn)行準(zhǔn)確有效的區(qū)分（圖2A、C）。主成分3 無(wú)法依照大白、長(zhǎng)白、杜洛克品種間的遺傳差異對(duì)樣本群體進(jìn)行分群，僅在大白群體內(nèi)部進(jìn)行了分群（圖2B、C）。

圖1 主成分碎石圖

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果 為了進(jìn)一步對(duì)樣本群體中每個(gè)個(gè)體的品種組成，即每個(gè)個(gè)體的血統(tǒng)構(gòu)成進(jìn)行準(zhǔn)確分析，使用ADMIXTURE 軟件對(duì)5 664 個(gè)樣本間共同祖先的比例進(jìn)行估計(jì)。首先，通過(guò)ADMIXTURE 軟件中的K 值測(cè)試對(duì)樣本群體中所包含的群體數(shù)量進(jìn)行預(yù)估。當(dāng)所設(shè)定的K 值從1 增加至5 時(shí)，交叉驗(yàn)證的預(yù)測(cè)錯(cuò)誤從0.67 降低至0.54。當(dāng)K=3 時(shí)，樣本群體中的種豬按照實(shí)際的品種記錄被劃分為3 個(gè)類(lèi)群（圖3A），這和PCA 分析結(jié)果中主成分1 的分析結(jié)果（圖2A、B）一致。當(dāng)K=4 時(shí)，大白群體被進(jìn)一步分為品種內(nèi)部的2 個(gè)亞群，而長(zhǎng)白及杜洛克群體并未產(chǎn)生分群現(xiàn)象（圖3B）。雖然K=3 時(shí)，交叉驗(yàn)證的預(yù)測(cè)錯(cuò)誤并不是最小值，但此時(shí)每個(gè)個(gè)體的血統(tǒng)構(gòu)成是按照品種進(jìn)行劃分。

圖2 主成分分析圖

圖3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析圖

2.4 群體間遺傳分化分析結(jié)果 為對(duì)群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，依據(jù)ADMIXTURE 中K 值為3、4 時(shí)的分析結(jié)果，進(jìn)行群體間遺傳分化分析。通過(guò)計(jì)算4 個(gè)群體間成對(duì)的Fst 值發(fā)現(xiàn)，2 個(gè)大白豬亞群間的Fst 值的差異最小，為0.014 3±0.018 6，遠(yuǎn)低于大白豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克豬群體間的Fst 值（表2）。該結(jié)果表明，ADMIXTURE 軟件在K 值為4 時(shí)，便已開(kāi)始不依據(jù)品種間的遺傳差異對(duì)樣本群體進(jìn)行分群。

表2 不同群體間Fst 指數(shù)

3 討 論

在大型養(yǎng)豬公司內(nèi)部開(kāi)展場(chǎng)間聯(lián)合育種是推進(jìn)生豬遺傳改良工作的有效方法。核心育種群作為場(chǎng)間聯(lián)合育種的基礎(chǔ)，承擔(dān)著提升生豬生產(chǎn)性能和培育專(zhuān)門(mén)化品系等重要任務(wù)[20-21]。因此，保證核心育種群中種豬的品種純度是生豬遺傳改良工作的重點(diǎn)。目前，針對(duì)我國(guó)大型養(yǎng)豬公司開(kāi)展場(chǎng)間聯(lián)合育種的需求，已有相關(guān)研究提出需對(duì)主要養(yǎng)殖繁育的種豬品種即大白豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克豬，分品種規(guī)定統(tǒng)一的測(cè)定數(shù)量、遺傳評(píng)估的測(cè)定性狀和性狀的具體測(cè)定方法[20]。但是，尚未有相關(guān)研究提出需對(duì)參與場(chǎng)間聯(lián)合育種的種豬進(jìn)行品種成分鑒定。由于種豬市場(chǎng)中以雜種豬、其他品種豬來(lái)冒充本品種豬的情況時(shí)有發(fā)生[21]，而采用種豬外貌鑒定的方法并不能有效保證核心育種群在引入外血時(shí)可以準(zhǔn)確引入本品種的純血種豬。為了保證核心育種群中種豬的品種純度，NSR 早期主要通過(guò)回交的方式進(jìn)行驗(yàn)證[4-5]，但該方法所需的時(shí)間及經(jīng)濟(jì)成本較高。在將基因組信息引入種豬育種后，可以采用PCA 和遺傳結(jié)構(gòu)分析對(duì)種豬的品種成分進(jìn)行鑒定。在避免經(jīng)濟(jì)、時(shí)間成本浪費(fèi)的同時(shí)，獲得更加精確的鑒定結(jié)果。

本研究基于SNP 芯片數(shù)據(jù)對(duì)樣本群體進(jìn)行PCA 和遺傳結(jié)構(gòu)分析。PCA 分析結(jié)果表明，該方法可以顯著分離大白、長(zhǎng)白、杜洛克群體，這與Huang 等[5]及其公布在NSR 官網(wǎng)[4]上的PCA 分析結(jié)果一致。由于大白豬、長(zhǎng)白豬和杜洛克豬品種間的遺傳差異較大，因此PCA 分析可準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)對(duì)這3 個(gè)純品種的有效分群。遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，根據(jù)ADMIXTURE 對(duì)樣本群體所含的亞群數(shù)量的估算結(jié)果，該樣本群體中包含3 個(gè)以上亞群。但是，當(dāng)K 值為3 時(shí)，群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果同PCA 的分析結(jié)果一致，可以準(zhǔn)確將大白、長(zhǎng)白、杜洛克群體進(jìn)行分離并估算出每個(gè)個(gè)體的血統(tǒng)構(gòu)成。當(dāng)K 值為4 時(shí)，大白群體被再次劃分為2 個(gè)亞群，這與Huang 等[5]的分析結(jié)果一致。雖然，交叉驗(yàn)證的預(yù)測(cè)錯(cuò)誤最小時(shí)的K 值代表了該樣本群體所包含的亞群數(shù)量。但是，由于該樣本群體內(nèi)的大白豬數(shù)量顯著高于長(zhǎng)白豬和杜洛克豬，因此在對(duì)樣本群體內(nèi)的亞群數(shù)量進(jìn)行估算時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致ADMIXTURE 過(guò)度關(guān)注品種內(nèi)部由家系所形成的亞群間的遺傳差異，而不是品種間的群體遺傳差異[5]。為驗(yàn)證以上推測(cè)，依據(jù)ADMIXTURE分析結(jié)果對(duì)不同品種間及2 個(gè)大白亞群間的群體遺傳分化程度進(jìn)行評(píng)估。2 個(gè)大白亞群間的Fst 指數(shù)，遠(yuǎn)低于大白豬、長(zhǎng)白豬和杜洛克豬品種間的Fst 指數(shù)，這表明不同品種間的遺傳分化程度較高，而大白亞群間的遺傳分化程度遠(yuǎn)未達(dá)到品種間遺傳分化程度[22]，并不足以構(gòu)成品種。所以在K 值為4 時(shí)檢測(cè)到的大白亞群并不是基于品種間遺傳差異而產(chǎn)生的群體結(jié)構(gòu)，可能是由長(zhǎng)期人工選擇及人工選配所產(chǎn)生的基于家系的隱藏親緣群體[22-23]。在進(jìn)行品種成分鑒定時(shí)，不應(yīng)過(guò)度關(guān)注由于人工選擇和人工選配所產(chǎn)生的家系結(jié)構(gòu)，避免對(duì)最終鑒定結(jié)果造成影響。

目前，基因組育種正在我國(guó)大規(guī)模推廣實(shí)施，SNP測(cè)定已成為每一個(gè)核心育種場(chǎng)的基本測(cè)定要求。因此，將品種成分鑒定列為在構(gòu)建核心育種群的基本要求，是保障核心育種群品種純度切實(shí)可行的有效方法。在大型養(yǎng)豬公司體系內(nèi)開(kāi)展場(chǎng)間聯(lián)合育種的過(guò)程中，可為每個(gè)品種分別構(gòu)建品種參考群[4-5]，并將此作為各公司純種豬基因型信息的參考標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)依據(jù)PCA 分析、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析及群體遺傳分化分析結(jié)果，建議在對(duì)未知種豬群體進(jìn)行品種成分鑒定時(shí)，先采用PCA 分析對(duì)樣本群體內(nèi)的群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行估算；再采用群體遺傳結(jié)構(gòu)的方法依據(jù)PCA 分析結(jié)果，確定樣本群體中每個(gè)個(gè)體的血統(tǒng)組成；最后依據(jù)群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果計(jì)算不同亞群間的Fst，以避免品種內(nèi)部家系結(jié)構(gòu)對(duì)品種成分鑒定的影響。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)四川省某豬場(chǎng)的實(shí)際生產(chǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行研究分析，證明采用PCA 分析和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析可以實(shí)現(xiàn)對(duì)豬群中個(gè)體品種成分的鑒定。相比于PCA 分析，群體遺傳結(jié)構(gòu)分析可以更加清晰地展現(xiàn)每個(gè)個(gè)體的品種組成。以上結(jié)果表明，在大型養(yǎng)豬公司體系內(nèi)開(kāi)展場(chǎng)間聯(lián)合育種的過(guò)程中，可以利用PCA 分析方法和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析方法對(duì)核心群中的個(gè)體進(jìn)行品種鑒定，以保證核心群嚴(yán)格執(zhí)行純品種選育，為后續(xù)專(zhuān)門(mén)化品系和配套系的培育提供優(yōu)良的種質(zhì)資源。