保山豬LPL 基因表達(dá)量與生長(zhǎng)及胴體性能的關(guān)聯(lián)分析

李文君，程 娜，龔紹榮，趙加鼎，邱丙姍，吳正明，李再磊，周戚斌，趙桂英*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南省保山市保山豬研究所，云南保山 678200）

生產(chǎn)性能測(cè)定在養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中具有重要意義，是選育優(yōu)良豬種的基礎(chǔ)，是組織生產(chǎn)的依據(jù)，也是衡量養(yǎng)豬生產(chǎn)水平的標(biāo)準(zhǔn)。豬的生產(chǎn)性能一般包括生長(zhǎng)性能、胴體性能、繁殖性能等，其中胴體性能又包括背膘厚度、瘦肉率、脂比率、眼肌面積等。當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)重視豬生長(zhǎng)速度和瘦肉率的提高，卻忽視了胴體品質(zhì)的改善，而改善豬胴體品質(zhì)的難點(diǎn)和關(guān)鍵點(diǎn)是在較低背膘厚和皮下脂肪含量的前提下，同時(shí)提高瘦肉率及肌內(nèi)脂肪的含量。

脂蛋白脂肪酶（Lipoproteinlipase，）是參與合成和分解脂肪的關(guān)鍵酶，是脂肪、心肌、骨骼肌和乳腺細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白，是對(duì)動(dòng)物脂肪沉積具有調(diào)控作用的重要基因。已有研究發(fā)現(xiàn)：基因具有調(diào)控脂類(lèi)代謝的功能，其多態(tài)性與動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和胴體品質(zhì)關(guān)系密切；基因在不同組織中的表達(dá)存在組織特異性，在一定程度上影響肌內(nèi)脂肪含量（IMF），且在背肌及肌內(nèi)脂肪中表達(dá)量越高，肉品質(zhì)相對(duì)較好；基因可以通過(guò)調(diào)控脂肪組織和肌肉組織發(fā)育過(guò)程中所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的水平，進(jìn)而影響眼肌面積、瘦肉率和脂比率等胴體性狀。

保山豬又名保山大耳朵豬，原產(chǎn)于云南省保山市，毛色大多為黑色，少數(shù)為棕色，體長(zhǎng)皮厚，耳肥大而下垂，具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、對(duì)青綠飼料利用能力較好、飼料的利用轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高等優(yōu)良特性；其肉質(zhì)鮮美細(xì)嫩、香味濃郁、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，是制作臘肉和火腿的優(yōu)質(zhì)原材料。目前在其他豬種上已有基因表達(dá)量對(duì)生產(chǎn)性能影響的相關(guān)研究，但對(duì)保山豬生產(chǎn)性能的影響還需進(jìn)行更深層次的探究。因此，本實(shí)驗(yàn)以保山豬為研究對(duì)象，探究基因表達(dá)量與生長(zhǎng)性能、胴體性能之間的關(guān)聯(lián)性，對(duì)保山豬的選育、培育新品種、提高養(yǎng)豬效益具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及采樣 從保山市保山豬研究所隨機(jī)選取10 頭斷奶后的純種保山豬，在相同飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，達(dá)260 日齡后隨機(jī)宰殺6 頭（3 ♂，3 ♀），取適量的肝臟、背最長(zhǎng)肌和背脂樣品，放入無(wú)RNA 酶的凍存管中，用液氮罐運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)存于超低溫冰箱（-80℃）中備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定指標(biāo) 生長(zhǎng)性能中的平均日增重、耗料增重比指標(biāo)參照《NY/T 822-2004 種豬生產(chǎn)性能測(cè)定規(guī)程》測(cè)定，胴體性能中的屠宰率、宰前活重、三點(diǎn)背膘厚、皮厚、皮比率、瘦肉率、脂比率、眼肌面積、骨比率等指標(biāo)參照《DB43/T356-2007 豬性能測(cè)定技術(shù)規(guī)范》測(cè)定。

1.2.2 總RNA 的提取及檢測(cè) 保山豬肝臟、背脂及背最長(zhǎng)肌的總RNA 采用北京擎科生物科技有限公司的動(dòng)物組織或細(xì)胞總RNA 提取試劑盒（TSP413）提取。用凝膠電泳法及核酸濃度檢測(cè)儀測(cè)定每個(gè)樣品的RNA 濃度以及OD值，判斷RNA 的完整性、濃度及純度是否符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

1.2.3 反轉(zhuǎn)為cDNA 將質(zhì)檢合格的RNA 樣品，用北京擎科生物科技有限公司TSK302S 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（GoldenstarRT6cDNASynthesisKitVer.2）提供的方法，反轉(zhuǎn)為cDNA。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 參照NCBI 收錄的基因序列：內(nèi)參基因（登錄號(hào)：NM_205518.1），目的基因（登錄號(hào)：NM_214286.1），用在線軟件Primer 3.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并找出最佳的引物設(shè)計(jì)方案，送北京擎科生物科技有限公司合成。引物設(shè)計(jì)如下：內(nèi)參基因：上游引物（F）:5'-ACAGGTGCAGAAGTGGGATG-3'，下游引物（R）：5'-TGGTAGCCGTGACACCTTTC-3'，退火溫度：58℃；基因：上游引物（F）：5'-CCCTG GCTTTGCTATTGAGA-3'，下游引物（R）：5'-GAGACTT GTCGTGGCATTTC-3',退火溫度：60℃。

參照北京擎科生物科技有限公司2×TsingKeMasterqPCRMixSYBRGreenI 試劑盒提供的方法進(jìn)行RT-qPCR。在超凈工作臺(tái)中避光配制反應(yīng)體系：2×TsingKeMasterqPCRMix10 μL、上下游引物（10 μmmol/L）各0.8 μL、模板DNA（<100 ng）：2 μL、ddHO：6.4 μL；反應(yīng)條件：基因：95 ℃預(yù)變性1 min，95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，循環(huán)40 次；基因：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性10 s，58℃退火10 s，72℃延伸10 s，循環(huán)40 次。

1.2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析 保山豬的生長(zhǎng)、胴體性能數(shù)據(jù)用Excel 表格整理，使用SPSS 23 軟件完成數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)，并通過(guò)分析數(shù)據(jù)判斷基因相對(duì)表達(dá)量與保山豬生長(zhǎng)、胴體性能是否有關(guān)聯(lián)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)誤（ˉ±SE）”表示。本實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因是（-actin），把目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)作為Ct 值，?Ct=Ct-Ct，目的基因的相對(duì)表達(dá)量用2值計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)性能、胴體性能測(cè)定 對(duì)保山豬的生長(zhǎng)性能及胴體性能進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表1 所示，生長(zhǎng)性能中保山豬的平均日增重為323.46 g/d，耗料增重比為4.89；胴體性能中保山豬的3 點(diǎn)背膘厚為4.699 cm，眼肌面積為25.459 cm，瘦肉比率為34.30%，皮比率為12.36%，脂比率為44.12%。

表1 保山豬的生長(zhǎng)性能及胴體性能測(cè)定結(jié)果

2.2 總RNA 的提取及質(zhì)檢 觀察提取的總RNA 凝膠電泳圖（圖1），發(fā)現(xiàn)只有2 個(gè)條帶（18S 和28S）明亮且清晰，5S 條帶不太清晰，說(shuō)明RNA 提取成功?？俁NA 檢測(cè)結(jié)果如表2 所示，OD值最大不超過(guò)2.2，最小不低于1.8，且濃度均高于100 ng/μL，表明總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果均達(dá)到要求，可進(jìn)行后續(xù)反轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。

表2 樣品總RNA 質(zhì)量檢測(cè)

圖1 部分保山豬3 個(gè)組織總RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3基因的相對(duì)表達(dá)量 對(duì)基因進(jìn)行熒光定量PCR 測(cè)定，其相對(duì)表達(dá)量結(jié)果如表3 所示，基因在保山豬3 個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量從高到低依次為：背脂、背最長(zhǎng)肌、肝臟；基因在背脂與背最長(zhǎng)肌和肝臟中的相對(duì)表達(dá)量差異極顯著，在背最長(zhǎng)肌與肝臟中的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著。基因在保山豬3 個(gè)組織中的表達(dá)水平為：背脂>背最長(zhǎng)肌>肝臟（圖2）。

表3 3 個(gè)組織中LPL 基因的相對(duì)表達(dá)量

圖2 LPL 基因在保山豬肝臟、背最長(zhǎng)肌和背脂中的表達(dá)水平

2.4基因在3 個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量與生長(zhǎng)和胴體性能的關(guān)聯(lián)分析 由表4 可知，基因在保山豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量與皮比率呈極顯著負(fù)相關(guān)；在背脂中的表達(dá)量與脂比率呈顯著正相關(guān)，與眼肌面積呈顯著負(fù)相關(guān)。

表4 LPL 基因在保山豬3 個(gè)組織中的表達(dá)量與生長(zhǎng)及胴體性能的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

趙桂英等研究發(fā)現(xiàn)，高黎貢山豬的日增重在200 g左右、耗料增重比最高可達(dá)5。連林生的研究表明，約杜保三元雜交豬育肥期的日增重為814 g、耗料增重比為3.09，本實(shí)驗(yàn)中，保山豬的日增重為323.46 g、耗料增重比為4.89，一定程度上優(yōu)于高黎貢山豬，但不如雜交豬，可能是雜交豬經(jīng)過(guò)有目的的雜交選育后對(duì)飼料利用率高。趙桂英等的研究發(fā)現(xiàn)，高黎貢山公豬中的瘦肉率、脂比率、眼肌面積分別為45.37%、30.67%、20.43 cm，母豬為44.32%、32.45%、19.68 cm；吳旭東等研究發(fā)現(xiàn)，杜保二元雜交豬的瘦肉率、脂比率、眼肌面積分別為57.67%、24.31%、39.32 cm；王海洲等研究發(fā)現(xiàn)，五蓮黑豬的瘦肉率、脂比率和眼肌面積分別是47.16%、33.35%、30.92 cm，杜長(zhǎng)大豬分別是67.55%、14.04%、53.83 cm。本實(shí)驗(yàn)中，保山豬的瘦肉率、脂比率、眼肌面積分別為34.3%、44.12%、25.459 cm，瘦肉率低于其他4 個(gè)豬種，眼肌面積高于高黎貢山豬而低于其他3 個(gè)豬種，脂比率高于其他4 個(gè)豬種，推測(cè)保山豬體內(nèi)脂肪的沉積能力優(yōu)于其他4 個(gè)豬種。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基因在3 個(gè)組織中的表達(dá)趨勢(shì)為背脂>背最長(zhǎng)肌>肝臟。丁琳琳研究不同月齡豬基因在心、肝、胃、大腸、小腸、背肌和腿肌等10 個(gè)組織中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果顯示基因在10個(gè)組織中均有表達(dá)，且表達(dá)趨勢(shì)均為：背最長(zhǎng)肌>肝臟。屈博文等研究指出淮南豬皮下脂肪組織中基因表達(dá)水平顯著高于背最長(zhǎng)肌組織，與本研究結(jié)果一致，可能是因?yàn)榛蛟谂嘤i種、地方豬種中表達(dá)量具有一致性。付言峰等的研究表明，基因在蘇鐘豬皮下脂肪的表達(dá)量最高，表達(dá)量順序由高到低依次為：皮下脂肪>背最長(zhǎng)肌>肝臟，與本研究保山豬基因的表達(dá)趨勢(shì)一致。張雄在基因?qū)慕阖i脂肪沉積影響的研究中發(fā)現(xiàn)，基因在背肌、心臟、肝臟等組織器官中均有表達(dá)，且存在組織特異性，其中在背最長(zhǎng)肌中的相對(duì)表達(dá)量最高，與本實(shí)驗(yàn)背脂中相對(duì)表達(dá)量最高的結(jié)果不一致。李培培等發(fā)現(xiàn)基因在肌肉和骨骼肌組織中相對(duì)表達(dá)量最高，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不一致。上述研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異的原因可能為：豬種不同，生物學(xué)特性會(huì)有所不同，同時(shí)豬的生長(zhǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)管理方式也會(huì)在一定程度上影響基因在各個(gè)組織的表達(dá)量。

王薇的研究表明，基因的表達(dá)量與背膘厚呈正相關(guān)，與活體重、眼肌面積呈負(fù)相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中，基因的表達(dá)量與保山豬三點(diǎn)背膘厚及宰前活重均無(wú)顯著的相關(guān)性，2 個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，可能是品種不同所致，但基因的表達(dá)量與保山豬眼肌面積呈顯著負(fù)相關(guān)，2 個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。郭勇等檢測(cè)了豬背最長(zhǎng)肌和皮下脂肪組織基因的表達(dá)水平，并與胴體性能和肉質(zhì)性能進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在背最長(zhǎng)肌組織中基因表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪、皮厚和背膘厚呈正相關(guān)，與眼肌面積呈負(fù)相關(guān)，其中與肌肉水分含量呈顯著負(fù)相關(guān)，在皮下脂肪組織中基因表達(dá)量與皮厚呈顯著負(fù)相關(guān)；廉紅霞等在杜長(zhǎng)大三元雜交豬基因表達(dá)與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，基因在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量呈極顯著正相關(guān)，與體重呈正相關(guān)；Gerfault 等的研究發(fā)現(xiàn)，基因在豬皮下脂肪組織中的高表達(dá)能夠顯著增加豬皮下脂肪的沉積，本研究中，保山豬基因在背最長(zhǎng)肌的表達(dá)量與皮比率呈極顯著負(fù)相關(guān)，在背脂組織中的相對(duì)表達(dá)量與眼肌面積呈顯著負(fù)相關(guān)，與脂比率呈顯著正相關(guān)，符合脂肪、瘦肉在豬體內(nèi)的生長(zhǎng)規(guī)律，以上研究可說(shuō)明基因與調(diào)控脂肪的沉積有關(guān)，可作為調(diào)控脂肪沉積的候選基因。但由于目前純種保山豬存欄量少，樣本獲取較為困難，且實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)有限，本研究只是采用了少量樣本進(jìn)行初步探索，為相關(guān)研究提供參考，今后會(huì)繼續(xù)對(duì)保山豬進(jìn)行保育擴(kuò)繁，待保山豬數(shù)量增加，實(shí)驗(yàn)資金充足，將擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)論。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，基因在保山豬3 個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量存在差異，其表達(dá)量從高到低依次為：背脂、背最長(zhǎng)肌、肝臟?；虻纳险{(diào)表達(dá)對(duì)保山豬脂肪沉積有促進(jìn)作用，可作為調(diào)控保山豬脂肪沉積的候選基因。